一种蜜蜂样本采集与保存的方法及其在蜜蜂资源形态鉴定中的应用

技术领域

本发明涉及蜜蜂技术领域，具体而言，涉及一种蜜蜂样本采集与保存的方法及其在蜜蜂资源形态鉴定中的应用。

背景技术

每一个蜜蜂品种或品系除了有其特定的经济性状外，还有其特定的形态特征。根据这些形态特征不但可将各品种、品系区别开来，而且还可判定蜂种的优劣。特别是对生产性状以及与生产性能有关的形态特征指标和生物学特性进行观察、测定，为进一步的育种素材筛选提供科学依据。

蜜蜂的吻的长短与采集花蜜能力息息相关，吻长的蜂种能够采集花管较深的植物。翅长和翅宽指标通常用以衡量工蜂的飞翔能力和采集能力，并与蜂群的产蜜量存在关联。背板指标用来以衡量蜜蜂腹部大小，与蜜蜂的贮存花蜜能力有直接关系。蜜蜂分类学中将肘脉指数作为一个重要的参考指标，亲缘关系越近，工蜂肘脉指数就越相近。

蜜蜂资源形态测量包括吻长、前翅长、前翅宽、11个翅脉角、肘脉指数、背板长、腹板长、蜡镜长、后足股节长、后足胫节长、后足基跗节长及小盾片、背板、上唇色度等40余项指标。

蜜蜂形态鉴定作为蜜蜂资源调查中重要的技术手段，具有评价蜜蜂性状和区分亲缘关系的作用，为优良品种的选育提供科学依据。采用不科学的采样方法采取的蜜蜂样本无法使用或者不利于试验人员解剖，都给蜜蜂资源鉴定带来不利影响。

目前没有特别针对蜜蜂资源普查形态鉴定的蜜蜂采集与保存方法的报道。采用现有的采集与保存方法获得的蜜蜂样本具有如下缺点：

1)由于用于蜜蜂资源普查形态鉴定指标数量多，包括吻长、翅脉角、背板等40几个指标，对蜜蜂的采样与保存要求较高。现有的采样方法容易出现以下问题：测量的指标缺失不全；蜜蜂组织器官韧性差，解剖时容易拉断撕裂；背板较硬，铺在载玻片时容易拱起。

2)现有的采样方法多在蜂巢门前随机采用，采集的蜜蜂会有翅膀残缺和绒毛缺失的情况，无法进行翅长、翅宽等的测量及背板色度的鉴定，不利于后续的鉴定。

3)吻长是衡量蜜蜂采集能力的重要形态指标，不能缺少。现有的采用热水刺激蜜蜂促使蜜蜂应激伸吻的方法，热水浸烫时间不易掌握，时间长容易破坏蜜蜂组织和影响色度，时间短工蜂中唇舌无法伸出。

4)一般采样后用酒精浸泡样本，进行保存，当浓度过高时会出现背板较硬，背板拱起无法在载玻片铺平，造成背板的长度无法测量。浓度较低时组织器官偏软，用镊子夹取各个组织器官的容易造成器械损伤，其中任意一个组织出现破损，这个样本已经解剖的指标也无法使用，这样给试验人员无形中增加很多工作量，增加了解剖难度。

5)现有采集与保存方法获得的蜜蜂样本存在蜜蜂色度的偏差。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种蜜蜂样本采集与保存的方法及其在蜜蜂资源形态鉴定中的应用，以克服上述技术问题。

本发明是这样实现的：

一方面，本发明提供了一种蜜蜂样本采集与保存的方法，其包括收集低日龄的内勤蜂，对其进行麻醉熏杀，然后将其加入样本保存液中进行保存；

上述低日龄的内勤蜂为3日龄以内的内勤蜂。

在一些实施方式中，低日龄的内勤蜂为主要在蜂巢内从事保温、孵卵和清理工作，未参与外界的采集花蜜花粉工作，且背板较为柔软的蜜蜂。

在一些实施方式中，低日龄的内勤蜂的收集方法包括：

随机选择蜜蜂样本群，打开蜂箱盖，提取蜂箱中间带有正在出房的巢脾，轻轻地抖动巢脾，使日龄偏大的外勤蜂抖落在蜂箱内，日龄偏小的内勤蜂留在蜂脾上；

将经过一次抖蜂的巢脾，再进行一次抖蜂，将巢脾的剩余蜜蜂全部抖落至下方放置的收集盒中。

在一些实施方式中，麻醉熏杀包括采用二氧化碳麻醉致死蜜蜂。

在一些实施方式中，麻醉熏杀包括向装有蜜蜂样本的容器中注入二氧化碳气体；二氧化碳的流速为1-2L/min；麻醉熏杀的时间为20-30s。

在一些实施方式中，样本保存液包括酒精、甘油和水。

在一些实施方式中，样本保存液中酒精的终浓度为75-80％(V/V％)。

在一些实施方式中，样本保存液中甘油的终浓度为0.3-0.5％(V/V％)。

在一些实施方式中，蜜蜂样本在样本保存液中的浸泡时间为1-3个月。

另一方面，本发明还提供了上述蜜蜂样本采集与保存的方法在蜜蜂资源形态鉴定中的应用。

本发明具有以下有益效果：

1、本发明规定了工蜂的取样日龄，保证测定的各个指标的完整

蜜蜂从巢房爬出几个小时后，柔软的身体慢慢变硬，头胸腹等身体各个指标不再变化。本发明取样采用未参与外勤工作的内勤蜂，由于内勤蜂主要在蜂巢内从事保温、孵卵和清理等工作，未参与外界的采集花蜜花粉等工作，能够保证翅膀和绒毛的完整。同时低日龄蜜蜂背板较为柔软，有利于背板在载玻片上铺平。

2、本发明优化了麻醉熏杀的流速和时间

本发明利用二氧化碳促使蜜蜂伸吻，限定二氧化碳流速能够使蜜蜂快速伸吻，能够保证30s内使95％的蜜蜂伸吻，而且保证中唇舌完全伸出，满足形态测定的要求。如果二氧化碳的流速过快，导致蜜蜂快速的麻醉，反而中唇舌伸出效果不好。

3、蜜蜂形态鉴定的保存液

在酒精基础上加入特定体积的甘油，可以增强蜜蜂足、翅膀及背板等组织的柔韧性，使试验人员在进行足、翅膀和背板等各个组织解剖时，不易造成拉断、撕裂的损伤，增强各个组织的柔韧性，降低试验人员的解剖难度。

4、蜜蜂样本浸泡时间

本发明控制蜜蜂样本的浸泡时间，保证蜜蜂背板和小盾片的色度的不褪色，减小蜜蜂色度差。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明中不同流速的伸吻效果对比(上图为中唇舌伸出的吻，可用于形态鉴定；下图为中唇舌未伸出的吻，不可用于形态鉴定)。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

本发明针对形态鉴定指标特点，优化了蜜蜂标本保存液、抓取样本方法、麻醉熏杀方法以及最佳保存时间，能够保证蜜蜂各个组织指标完整和韧性，为下一步的试验人员的解剖提供合格的蜜蜂鉴定样本。

具体地，本发明的蜜蜂样本采集与保存的方法如下：

1.蜜蜂样本保存液的配制

本发明中的样本保存液是在酒精溶液中添加甘油制备获得的，其中酒精的终浓度为75-80％(V/V％)，甘油的终浓度为0.3-0.5％(V/V％)，溶剂为水。

在日常生化试验中，保存蜜蜂样本多采用95％酒精进行保存，形态鉴定需要解剖足、背板、吻等各个器官，各个器官容易变硬解剖时容易撕裂折断。而本发明中采用的是在酒精溶液中添加特定比例的甘油，可以增强蜜蜂足、翅膀及背板等组织的柔韧性，使试验人员在进行足、翅膀和背板等各个组织解剖时，不易造成拉断、撕裂的损伤，增强各个组织的柔韧性，降低试验人员的解剖难度。

2.蜜蜂样本采集

随机选择蜜蜂样本群，打开蜂箱盖，提取蜂箱中间带有正在出房的巢脾，轻轻地抖动巢脾，使日龄偏大的外勤蜂抖落在蜂箱内，日龄偏小的内勤蜂留在蜂脾上；

将经过一次抖蜂的巢脾，再进行一次抖蜂，将巢脾的剩余蜜蜂全部抖落至下方放置的收集盒中。

由于蜜蜂从巢房爬出几个小时后，柔软的身体慢慢变硬，头胸腹等身体各个指标不再变化。本发明取样采用未参与外勤工作的内勤蜂，由于内勤蜂主要在蜂巢内从事保温、孵卵和清理等工作，未参与外界的采集花蜜花粉等工作，能够保证翅膀和绒毛的完整。同时低日龄蜜蜂背板较为柔软，有利于背板平铺在载玻片上。此处的低日龄是指3日龄以内。

在采集样本时，通过轻轻抖动获得日龄偏小的内勤蜂是因为发明人在试验中发现，轻轻的抖动巢脾，日龄偏大的外勤蜂会被抖落在蜂箱内，日龄偏小的内勤蜂抓取巢脾的能力比较强，会留在蜂脾上。通过这一操作方式就能集中获得日龄偏小的内勤蜂，其没有参加过巢外采集花粉花蜜，能够保证翅膀、足、绒毛等组织器官的完整，满足形态鉴定的需求。

2.蜜蜂样本的麻醉熏杀

向装有蜜蜂样本的容器中注入二氧化碳气体；二氧化碳的流速为1-2L/min；麻醉熏杀的时间为20s。

发明人发现，二氧化碳的流速过快导致蜜蜂快速麻醉死亡，蜜蜂的中唇舌无法伸出，样本无法使用，二氧化碳的流速过慢影响麻醉效率，尤其面对大批量采样的特别耗费时间。如图1所示，不同流速的伸吻效果不同，其上部为中唇舌伸出，可以用于形态鉴定；下部为中唇舌未伸出，无法用于形态鉴定。

3.蜜蜂样本的保存

经过二氧化碳麻醉熏杀样本20s后，立即加入配制好的样本保存液，浸泡在保存液的蜜蜂样本，常温阴凉处或4℃冰箱保存，在3个月内完成相应的形态鉴定工作。

同时发明人发现控制蜜蜂样本的浸泡时间，可以保证蜜蜂背板和小盾片的色度的不褪色，减小蜜蜂色度差。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例提供了一种蜜蜂样本采集与保存的方法，具体步骤如下：

1.蜜蜂样本保存液的配制

该保存液是在酒精溶液中添加甘油制备获得的，其中酒精的终浓度为75％(V/V％)，甘油的终浓度为0.3％(V/V％)，溶剂为水。

2.蜜蜂样本采集

首先随机选择本品种的蜜蜂10群，打开蜂箱盖，提取蜂箱中间带有正在出房的巢脾，轻轻的抖动巢脾，使日龄偏大的外勤蜂抖落在蜂箱内，日龄偏小的内勤蜂抓取巢脾的能力比较强，会留在蜂脾上。

把经过一次抖蜂的巢脾，再进行一次抖蜂，下面放置一个收集盒，这次抖蜂要把巢脾的蜜蜂全部抖落，每个样本瓶抓入50只内勤蜂样本即可。

3.蜜蜂样本的麻醉熏杀

向装有蜜蜂样本的容器中注入二氧化碳气体；二氧化碳的流速为2L/min；麻醉熏杀的时间为20s。每组50只蜜蜂样本，每组生物学重复3次。

4.蜜蜂样本的保存

2L/min的二氧化碳麻醉熏杀样本20s后，立即加入配制好的样本保存液，浸泡在保存液的蜜蜂样本，常温阴凉处或4℃冰箱保存，在3个月内完成相应的形态鉴定工作。

实施例2

本实施例提供了一种蜜蜂样本采集与保存的方法，具体步骤如下：

1.蜜蜂样本保存液的配制

该保存液是在酒精溶液中添加甘油制备获得的，其中酒精的终浓度为75％(V/V％)，甘油的终浓度为0.5％(V/V％)，溶剂为水。

2.蜜蜂样本采集

首先随机选择本品种的蜜蜂10群，打开蜂箱盖，提取蜂箱中间带有正在出房的巢脾，轻轻的抖动巢脾，使日龄偏大的外勤蜂抖落在蜂箱内，日龄偏小的内勤蜂抓取巢脾的能力比较强，会留在蜂脾上。

把经过一次抖蜂的巢脾，再进行一次抖蜂，下面放置一个收集盒，这次抖蜂要把巢脾的蜜蜂全部抖落，每个样本瓶抓入50只内勤蜂样本即可。

3.蜜蜂样本的麻醉熏杀

向装有蜜蜂样本的容器中注入二氧化碳气体；二氧化碳的流速为2L/min；麻醉熏杀的时间为20s。每组50只蜜蜂样本，每组生物学重复3次。

4.蜜蜂样本的保存

2L/min的二氧化碳麻醉熏杀样本20s后，立即加入配制好的样本保存液，浸泡在保存液的蜜蜂样本，常温阴凉处或4℃冰箱保存，在3个月内完成相应的形态鉴定工作。

对比例1

本对比例与实施例1的区别在于，蜜蜂样本保存液为75％(V/V％)的酒精。

对比例2

本对比例与实施例1的区别在于，蜜蜂样本保存液中用蔗糖替代甘油，添加量不变。

对比例3

本对比例与实施例2的区别在于，蜜蜂样本保存液中用蔗糖替代甘油，添加量不变。

对比例4

本对比例与实施例1的区别在于，蜜蜂样本的麻醉熏杀步骤中二氧化碳的流速为1L/min。

对比例5

本对比例与实施例1的区别在于，蜜蜂样本的麻醉熏杀步骤中二氧化碳的流速为3L/min。

对比例6

本对比例与实施例1的区别在于，蜜蜂样本的麻醉熏杀步骤中二氧化碳的流速为4L/min。

对比例7

本对比例与实施例1的区别在于，蜜蜂样本浸泡在保存液中的时间为1个月。

对比例8

本对比例与实施例1的区别在于，蜜蜂样本浸泡在保存液中的时间为6个月。

对比例9

本对比例与实施例1的区别在于，蜜蜂样本浸泡在保存液中的时间为12个月。

实验例1

配制75％、85％、95％的酒精，抓取同日龄蜜蜂各30只浸泡24小时，由同一个实验人员对蜜蜂头、胸、腹各个指标进行解剖，解剖结果发现浸泡85％和95％的酒精的样本明显比浸泡在75％酒精中变硬，同时随着浸泡时间的增加这种现象更为明显，组织变硬尤其背板容易拱起导致无法平铺在载玻片上。因此可以证明，75％浓度的酒精适合蜜蜂的保存。

实验例2

将实施例1-2与对比例1-3中保存的蜜蜂样本各取30只进行解剖，生物学重复3次，由同一实验人员进行解剖，各组的破损个数统计如表1所示：

表1不同保存液对蜜蜂组织韧性的影响

从表1中可以发现，不同保存液对蜜蜂组织韧性的影响有显著的区别，其中实施例1-2的保存液保存的蜜蜂样本组织韧性更佳，对比例1-3的保存液保存的蜜蜂样本组织韧性没有明显差异，证明相比于添加同等体积的蔗糖或者不添加其他成分，添加了甘油的样本保存液对蜜蜂样本组织韧性有重要影响。

实验例3

蜜蜂的吻由后颏、前颏和中唇舌构成，中唇舌是否伸出是测量吻的长度的关键，对比实施例1与对比例4-6的麻醉熏杀效果，每组50只蜜蜂样本，每组生物学重复3次，具体伸吻率见表2。

表2不同流速的二氧化碳麻醉熏杀效果

从实验结果可以看出，二氧化碳的流速过快导致蜜蜂快速麻醉死亡，蜜蜂的中唇舌无法伸出，样本无法使用；而流速太慢影响麻醉效率，尤其面对大批量采样的特别耗费时间。相比之下，实施例1中采用的流速蜜蜂样本伸吻完全，符合鉴定要求。

实验例4

将实施例1与对比例7-9保存的蜜蜂样本进行不同的保存时间对蜜蜂样本的影响的对比，对比结果如表3所示：

表3不同保存时间对蜜蜂样本的影响

从表3中可以看出，保存时间的长短会影响样本的色度以及硬度，在保存时间不超过3个月时，保存的样本，符合鉴定要求。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。