一种用于软骨修复的可注射透明质酸水凝胶及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种医用材料，具体涉及软骨损伤再生领域，主要公开了一种用于软骨修复的可注射透明质酸水凝胶及其制备方法。

背景技术

由创伤或骨病所致关节部位骨软骨缺损在临床较常见，且严重影响患者生活质量，已成为目前肢体残障的主要原因之一。膝部疾病可发生在各个年龄层的人群。膝部软骨缺损可由创伤、扭伤、过度使用膝部、肌肉无力或一般磨损导致。由于关节软骨特殊的组织结构及生物学特性，虽然已知有许多治疗关节软骨缺损的方法，包括但不限于：软骨下骨钻孔，电刺激，激光，药物及细胞注射，基因治疗等等，但是上述方法都达不到满意的修复效果。

快速发展的组织工程技术，为软骨的再生修复提供了新策略。组织工程中，组织细胞依附于由生物材料所制备的支架上，植入体内的病损部位，使之最终达到修复重建组织或器官、恢复功能目的。随着细胞增殖，支架材料不断降解，被细胞外基质代替，逐渐形成具有正常功能的组织。

在目前的研究中，用于修复关节软骨的支架材料主要有透明质酸(Hyaluronate，HA)，聚乳酸(polylactic，PLA)，聚乳酸-羟基乙酸(poly(lactic-co-glycolic)，PLGA)，胶原(collagen)，壳聚糖(chitosan)等，或者其中几种材料的复合亦常见。

前述天然活性生物材料中，以胶原、透明质酸等天然软骨成分为代表，可通过纯化工艺提升生物相容性，且保持活性。人工合成材料生物相容性好，便于精确控制和原位成型，但通常来说缺乏生物活性，需加入活性分子。

中国专利申请CN104910396A公开了一种可注射性双交联透明质酸水凝胶及其制备方法，先合成醛基化透明质酸及侧链中含有二硫键的氨基/甲基丙烯酰双功能化透明质酸，然后将二者和水溶性光引发剂一起混合均匀，进行光化学聚合，即可获得可注射性双交联透明质酸水凝胶。制得的透明质酸水凝胶力学性能、微观结构、降解性能、溶胀性能等可灵活调控，且具有可注射性。

中国专利申请CN105906824A公开了一种可注射的自组装透明质酸钠水凝胶的制备方法，该方法为透明质酸钠通过偶联试剂4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐(DMTMM)的活化作用，与胱胺制备得到透明质酸衍生物，再经二硫苏糖醇(DTT)还原得到透明质酸巯基衍生物；同时透明质酸钠通过偶联试剂DMTMM的活化作用，与多巴胺反应制备得到儿茶酚化透明质酸衍生物，两者在无其它交联剂参与下，互相混合形成水凝胶。

另一方面，软骨活性因子的时空调控对软骨功能性再生起到重要作用。目前研究中广泛使用的转化生长因子(TGF-β)和骨形态蛋白(BMP-2)等软骨诱导剂只是启动了干细胞的软骨内成骨分化，不足以诱导出成熟软骨表型，且常有并发症。申请人团队之前通过结构简单的亲和性多肽在体内募集TGF-β来再生软骨也是一种有效策略。小分子化合物虽然显示了明确的干细胞软骨诱导能力，如kartogenin等，但临床尚不能使用。

转化生长因子β家族对细胞的生长、分化和免疫功能及组织修复等方面起重要调节功能，尤其是对间充质来源的细胞起刺激作用，对于软骨损伤修复具有重要作用。一般来说，外源性注射转化生长因子β1存在很多缺点，如成本高、半衰期短等，因此有效利用内源性转化生长因子β1会显著提高安全性，有很高的利用价值。HSNGLP多肽，即组氨酸-丝氨酸-天冬酰胺-甘氨酸-亮氨酸-脯氨酸-亮氨酸多肽是在海洋生物中发现的，其能够吸附转化生长因子β1，原因是其表面有很多转化生长因子β1结合表位，可与转化生长因子β1紧密结合，并保持转化生长因子β的生物活性。

因此，现有技术中的可注射透明质酸水凝胶存在着力学性能差，容易发生溶胀，且缺乏生理环境下的长期稳定性，这极大限制其在软骨修复中的应用。为了能够解决上述技术问题，同时解决目前软骨修复实践中的不足，即生物材料诱导性低、免疫排斥风险高、有效性低和治疗费用高的问题，除了考虑支架仿生材料的选择和制备工艺，也必须考虑对其分子量、交联度、固化性能、降解性能、力学性能等的设计和改进。

发明内容

本发明目的是提供一种用于软骨修复的可注射透明质酸水凝胶及其制备方法。与现有技术相比，所得可注射透明质酸水凝胶力学性能性能和溶胀性能更好，且具有生理环境下的长期稳定性。

为了实现上述目的，一方面，本发明所采取的技术方案如下：一种可注射透明质酸水凝胶的制备方法，包括如下步骤：

步骤1：将透明质酸钠溶于水中，形成质量百分数为0.1wt％的透明溶液，加入阳离子交换树脂搅拌过夜，过滤得到透明质酸原液；

步骤2：向步骤1的透明质酸原液中加入氧化剂，将体系置于暗处反应2小时；加入适量乙二醇除去多余氧化剂，继续搅拌1小时后终止反应，透析纯化，冷冻干燥得到开环的透明质酸；

步骤3：向步骤1得到的透明质酸原液中加入1-羟基苯并三唑(HBOt)、碳二亚胺盐酸盐(EDC)，调节pH＝6，再加入己二酸二酰肼(ADH)；室温搅拌过夜；透析纯化；冷冻干燥得到接枝酰肼的透明质酸；

步骤4：将多肽HSNGLPL溶解于适量水中，形成质量百分数0.5wt％的透明溶液；向透明溶液中加入EDC、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、多巴胺(DA)和抗坏血酸(Vc)，调节pH＝8，混合溶液除氧，室温搅拌过夜；透析纯化；冷冻干燥得到改性多肽HSNGLPL；

步骤5：将步骤2-4的两种改性透明质酸和改性多肽HSNGLPL分别溶解在0.1M PBS溶液中，各自形成质量百分数4wt％的PBS溶液；另取适量氯化铁溶解于PBS溶液中，形成氯化铁的PBS溶液；

步骤6：将开环的透明质酸、接枝酰肼的透明质酸、改性多肽HSNGLPL的PBS溶液与氯化铁的PBS溶液同时注入到模具中，漩涡混合，得到透明质酸水凝胶。

根据本发明所述的制备方法，其中，所述步骤1的透明质酸钠平均分子量为10K道尔顿。

根据本发明所述的制备方法，其中，所述步骤2的氧化剂选自高碘酸；质酸与氧化剂的摩尔比为10:1。

根据本发明所述的制备方法，其中，所述步骤3的质酸、HBOt、EDC与ADH的摩尔比为1:1:1:1.5。

根据本发明所述的制备方法，其中，所述步骤3的透析纯化使用截留分子量3.5K道尔顿的透析袋，用pH＝3.5的0.1M氯化钠溶液透析纯化2d，再用超纯水透析3d。

根据本发明所述的制备方法，其中，所述步骤4的多肽HSNGLPL、EDC、NHS、DA和Vc的摩尔比为1:3:3:2:2。

根据本发明所述的制备方法，其中，所述步骤4的透析纯化使用截留分子量3.5K道尔顿的透析袋，使用除氧超纯水透析3d。

根据本发明所述的制备方法，其中，所述步骤5的氯化铁与多巴胺的摩尔比为1:2。

根据本发明所述的制备方法，其中，所述步骤6的开环的透明质酸、接枝酰肼的透明质酸、改性多肽HSNGLPL的PBS溶液与氯化铁的PBS溶液的体积比为2:1.2:0.6:0.2。

另一方面，本发明还提供了根据前述制备方法得到的可注射透明质酸水凝胶。

与现有技术相比，本发明所得可注射透明质酸水凝胶力学性能性能和溶胀性能更好，且具有生理环境下的长期稳定性。

具体实施方式

必须指出的是，除非上下文另外明确规定，否则如本说明书及所附权利要求中所用，单数形式“一”、“一个/种”和“该/所述”既可包括一个指代物，又可包括多个指代物(即两个以上，包括两个)。

除非另外指明，否则本发明中的数值范围为大约的，并且因此可以包括在所述范围外的值。所述数值范围可在本发明表述为从“约”一个特定值和/或至“约”另一个特定值。当表述这样的范围时，另一个方面包括从所述一个特定值和/或至另一个特定值。相似地，当通过使用先行词“约”将值表示为近似值时，应当理解，所述特定值形成另一个方面。还应当理解，数值范围中每一个的端点在与另一个端点的关系中均是重要的并独立于另一个端点。

在说明书和最后的权利要求书中提及组合物或制品中特定元素或组分的重量份是指组合物或制品中该元素或组分与任何其它元素或组分之间以重量份表述的重量关系。

在本发明中，除非具体指出有相反含义，或基于上下文的语境或所属技术领域内惯用方式的暗示，否则本发明中提及的溶液均为水溶液；当水溶液的溶质为液体时，所有分数以及百分比均按体积计，且组分的体积百分比基于包含该组分的组合物或产品的总体积；当水溶液的溶质为固体时，所有分数以及百分比均按重量计，且组分的重量百分比基于包含该组分的组合物或产品的总重量。

本发明中提及的“包含”、“包括”、“具有”以及类似术语并不意欲排除任何可选组分、步骤或程序的存在，而无论是否具体公开任何可选组分、步骤或程序。为了避免任何疑问，除非存在相反陈述，否则通过使用术语“包含”要求的所有方法可以包括一个或多个额外步骤、设备零件或组成部分以及/或物质。相比之下，术语“由……组成”排除未具体叙述或列举的任何组分、步骤或程序。除非另外说明，否则术语“或”是指单独以及以任何组合形式列举的成员。

此外，本发明中任何所参考的专利文献或非专利文献的内容都以其全文引用的方式并入本发明，尤其关于所属领域中公开的定义(在并未与本发明具体提供的任何定义不一致的情况下)和常识。

在本发明中，除非另外指明，否则份数均为重量份，温度均以℃表示或处于环境温度下，并且压力为大气压或接近大气压。室温表示20-30℃。存在反应条件(例如组分浓度、所需的溶剂、溶剂混合物、温度、压力和其它反应范围)以及可用于优化通过所述方法得到的产物纯度和收率的条件的多种变型形式和组合。将只需要合理的常规实验来优化此类方法条件。

在本发明中，PBS缓冲液浓度为0.1M，pH＝7.4。

实施例1

步骤1：室温下，将平均分子量10K道尔顿的透明质酸钠溶于水中，形成质量百分数0.1wt％的透明溶液，加入阳离子交换树脂搅拌，过夜，过滤得到透明质酸原液；

步骤2：向步骤1的透明质酸原液中加入高碘酸钠，质酸与高碘酸钠的摩尔比为10:1，将体系置于暗处反应2小时；加入适量乙二醇除去多余高碘酸钠，继续搅拌1小时后终止反应，使用截留分子量3.5K道尔顿的透析袋透析纯化，冷冻干燥得到开环的透明质酸；

步骤3：向步骤1得到的透明质酸原液中加入1-羟基苯并三唑(HBOt)、碳二亚胺盐酸盐(EDC)，调节pH＝6，再加入己二酸二酰肼(ADH)；质酸、HBOt、EDC与ADH的摩尔比为1:1:1:1.5，室温搅拌过夜；使用截留分子量3.5K道尔顿的透析袋，用pH＝3.5的0.1M氯化钠溶液透析纯化2d，再用超纯水透析3d；冷冻干燥得到接枝酰肼的透明质酸；

步骤4：将多肽HSNGLPL溶解于适量水中，形成质量百分数0.5wt％的透明溶液。向透明溶液中加入EDC、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、多巴胺(DA)和抗坏血酸(Vc)，多肽HSNGLPL、EDC、NHS、DA和Vc的摩尔比为1:3:3:2:2，调节pH＝8，混合溶液除氧，室温搅拌过夜；使用截留分子量3.5K道尔顿的透析袋，使用除氧超纯水透析3d；冷冻干燥得到改性多肽HSNGLPL；

步骤5：将步骤2-4的两种改性透明质酸和改性多肽HSNGLPL分别溶解在PBS溶液中，各自形成质量百分数4wt％的PBS溶液；另取适量氯化铁溶解于PBS溶液中，形成氯化铁的PBS溶液；氯化铁与多巴胺的摩尔比为1:2；

步骤6：按照体积比2:1.2:0.6:0.2，将开环的透明质酸、接枝酰肼的透明质酸、改性多肽HSNGLPL的PBS溶液与氯化铁的PBS溶液同时注入到模具中，漩涡混合，得到透明质酸水凝胶。

比较例1

步骤1：室温下，将平均分子量10K道尔顿的透明质酸钠溶于水中，形成质量百分数0.1wt％的透明溶液，加入阳离子交换树脂搅拌，过夜，过滤得到透明质酸原液；

步骤2：向步骤1的透明质酸原液中加入高碘酸钠，质酸与高碘酸钠的摩尔比为10:1，将体系置于暗处反应2小时；加入适量乙二醇除去多余高碘酸钠，继续搅拌1小时后终止反应，使用截留分子量3.5K道尔顿的透析袋透析纯化，冷冻干燥得到开环的透明质酸；

步骤3：向步骤1得到的透明质酸原液中加入1-羟基苯并三唑(HBOt)、碳二亚胺盐酸盐(EDC)，调节pH＝6，再加入己二酸二酰肼(ADH)；质酸、HBOt、EDC与ADH的摩尔比为1:1:1:1.5，室温搅拌过夜。使用截留分子量3.5K道尔顿的透析袋，用pH＝3.5的0.1M氯化钠溶液透析纯化2d，再用超纯水透析3d；冷冻干燥得到接枝酰肼的透明质酸；

步骤4：将多肽HSNGLPL溶解于适量水中，形成质量百分数0.5wt％的透明溶液。向透明溶液中加入EDC、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、多巴胺(DA)和抗坏血酸(Vc)，多肽HSNGLPL、EDC、NHS、DA和Vc的摩尔比为1:3:3:2:2，调节pH＝8，混合溶液除氧，室温搅拌过夜。使用截留分子量3.5K道尔顿的透析袋，使用除氧超纯水透析3d；冷冻干燥得到改性多肽HSNGLPL；

步骤5：将步骤2-4的两种改性透明质酸和改性多肽HSNGLPL分别溶解在PBS溶液中，各自形成质量百分数4wt％的PBS溶液。

步骤6：按照体积比2:1.4:0.6，将开环的透明质酸、接枝酰肼的透明质酸与改性多肽HSNGLPL的PBS溶液同时注入到模具中，漩涡混合，得到透明质酸水凝胶。

比较例2

步骤1：室温下，将平均分子量10K道尔顿的透明质酸钠溶于水中，形成质量百分数0.1wt％的透明溶液，加入阳离子交换树脂搅拌，过夜，过滤得到透明质酸原液；

步骤2：向步骤1的透明质酸原液中加入高碘酸钠，质酸与高碘酸钠的摩尔比为10:1，将体系置于暗处反应2小时；加入适量乙二醇除去多余高碘酸钠，继续搅拌1小时后终止反应，使用截留分子量3.5K道尔顿的透析袋透析纯化，冷冻干燥得到开环的透明质酸；

步骤3：向步骤1得到的透明质酸原液中加入1-羟基苯并三唑(HBOt)、碳二亚胺盐酸盐(EDC)，调节pH＝6，再加入己二酸二酰肼(ADH)；质酸、HBOt、EDC与ADH的摩尔比为1:1:1:1.5，室温搅拌过夜。使用截留分子量3.5K道尔顿的透析袋，用pH＝3.5的0.1M氯化钠溶液透析纯化2d，再用超纯水透析3d；冷冻干燥得到接枝酰肼的透明质酸；

步骤4：将步骤2-3的两种改性透明质酸分别溶解在PBS溶液中，各自形成质量百分数4wt％的PBS溶液；

步骤5：按照体积比2:2，将开环的透明质酸与接枝酰肼的透明质酸的PBS溶液同时注入到模具中，漩涡混合，得到透明质酸水凝胶。

性能测试

溶胀度测试采用称重法测定。将透明质酸水凝胶冷冻干燥后称重，记为W

使用质构仪测定压缩模量。测试条件为0.49N/m

结果参见表1。

表1

此外应理解，在阅读了本发明的内容之后，本领域技术人员可以对本发明的技术方案作出各种改动、替换、删减、修正或调整，这些等价技术方案同样落于本发明权利要求书所限定的范围。