调节对酪氨酸激酶抑制剂敏感性的方法

相关申请的交叉引用

本申请要求于2020年8月25日提交的新加坡临时申请号10202008169Q的优先权权益，其内容通过引用整体并入本文用于所有目的。

技术领域

本发明总体上涉及分子生物学领域。特别地，本发明涉及调节对用于治疗癌症的化合物的应答的化合物的用途。

背景技术

鳞状细胞癌(squamous cell cancer，SCC)是全球最常见的致命癌症之一，具有复发、转移和导致死亡的趋势。头颈部鳞状细胞癌(head and neck squamous cell cancer，HNSCC)是该组癌症的原型。尽管有证据表明很大比例的鳞状细胞癌依赖于表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)信号传导，但用单克隆抗体和/或酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitor，TKI)靶向该途径并不怎么成功。

因此，提供增强肿瘤对酪氨酸激酶抑制剂疗法的应答的方法这一需求尚未得到满足。

发明内容

在一个实例中，本公开涉及一种提高EGFR相关癌症对表皮生长因子受体(EGFR)酪氨酸激酶抑制剂(TKI)的敏感性的方法，该方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的表皮生长因子受体同种型D。

在另一个实例中，公开了一种治疗患有EGFR相关癌症的受试者的方法，该方法包括向受试者施用有效量的表皮生长因子受体同种型D；以及向受试者施用有效量的用于治疗EGFR相关癌症的酪氨酸激酶抑制剂。

附图说明

当结合非限制性实例和附图考虑时，参考具体实施方式将更好地理解本发明，其中：

图1示出了说明EGFR Q787Q G/G(WT)和A/A细胞系的(A)对吉非替尼的应答和(B)相对EGFR同种型D与同种型A的mRNA比值的数据。这表明具有EGFR单核苷酸多态性(singlenucleotide polymorphism，SNP)Q787Q A/A的细胞系对表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR TKI)敏感。

图2示出了在不同时间点收集的来自NCC-HN19细胞的总细胞裂解物和外泌体级分的蛋白质印迹分析结果。Tubb用作胞质标志物，CD9用作外泌体标志物。该数据表明EGFR同种型D存在于外泌体/细胞外囊泡(extracellular vesicle，EV)中。

图3示出了用无外泌体/细胞外囊泡(无EV)或从NCC-HN19细胞纯化的外泌体(10％NCC-HN19 EV)处理的NCC-HN1细胞的结果。该数据表明含有EGFR同种型D的外泌体/细胞外囊泡能够使癌细胞对酪氨酸激酶抑制剂(TKI)敏化(sensitise)。

图4示出了随着来自NCC-HN19细胞的含有EGFR同种型D的外泌体(EV)的量的提高而引起的NCC-HN1细胞的剂量依赖性敏化(sensitisation)。该数据表明外泌体同种型D依赖性敏化是剂量依赖性的。

图5示出了用无外泌体(无EV)、含有EGFR同种型D的外泌体(载体对照，10％HN137P pLKO-1Ev)或用针对EGFR同种型D的shRNA#1(10％ HN137P shIsoD_1EV)或shRNA#2(10％ HN137P shIsoD_2EV)敲低的外泌体处理的NCC-HN1细胞的结果。该数据表明EV中的EGFR同种型D对于癌细胞敏化是必需的，因为仅特异性消耗EGFR同种型D降低了酪氨酸激酶抑制剂(TKI)敏化效应(sensitising effect)。

图6示出了用无外泌体(无EV)、仅载体的外泌体(10％293T pBob EV)或过表达EGFR同种型D的外泌体(10％293T pBob-IsoD EV)处理的NCC-HN1细胞的结果。该数据表明，单独EGFR同种型D在EV中的异位表达足以使细胞对EGFR酪氨酸激酶抑制剂(TKI)敏化。

图7示出了已用来自表达载体对照(pBob)或EGFR同种型D(pBob-IsoD)的细胞的外泌体联合第一代酪氨酸激酶抑制剂(吉非替尼和厄洛替尼)、第二代酪氨酸激酶抑制剂(阿法替尼和达克替尼)和第三代酪氨酸激酶抑制剂(奥希替尼、拉帕替尼、那扎替尼和WZ4002)处理的三种原代HNSCC细胞系(NCC-HN1、NCC-HN120M和NCC-HN182M)获得的IC

图8示出了已用无外泌体(无EV)或来自以增加剂量(0.5x、1x和2x)过表达EGFR同种型D(pBob-IsoD)的细胞(293T或NCC-HN1)的外泌体联合吉非替尼、阿法替尼或达克替尼处理的三种原代HNSCC细胞系(NCC-HN1、NCC-HN120M和NCC-HN182M)获得的IC

图9示出了用无外泌体(无EV)、单独PitStop2(1μM PS2)、具有载体表达的外泌体(293T pBob EV)、具有EGFR同种型D表达的外泌体(293TpBob-IsoD EV)、具有载体表达和PitStop2的外泌体(293T pBob EV+1μMPS2)、具有同种型D表达和PitStop2的外泌体(293TpBob-IsoD EV+1μMPS2)处理的NCC-HN1细胞的结果。该数据表明PitStop2对网格蛋白介导的内吞作用的抑制降低了含有同种型D的EV的敏化效应。

图10示出了在不存在(无EV)或存在1％(1％v/v Bac IsoD)或10％(10％v/v BacIsoD)细菌产生的EGFR同种型D的情况下，用吉非替尼处理的NCC-HN1的存活百分比。该数据表明，仅重组EGFR同种型D蛋白无法提高针对TKI的癌细胞敏化。

图11示出了当用来自NCC-HN19、NCC-HN137P和293T的细胞外囊泡(EV)联合不同的酪氨酸激酶抑制剂共处理时，不同细胞系的活力。图11A示出了用NCC-HN19EV和八种酪氨酸激酶抑制剂(TKI)共处理的NCC-HN1细胞的结果。各图示出了未用外泌体(无EV)或用来自NCC-HN19细胞的外泌体(1x NCC-HN19EV)联合第一代酪氨酸激酶抑制剂(吉非替尼或厄洛替尼)、第二代酪氨酸激酶抑制剂(阿法替尼或达克替尼)和第三代酪氨酸激酶抑制剂(拉帕替尼、那扎替尼、WZ4002或奥希替尼)处理的NCC-HN1细胞的存活百分比。图11B示出了用NCC-HN19EV和八种酪氨酸激酶抑制剂共处理的NCC-HN120M细胞的结果。各图示出了未用外泌体(无EV)或用来自NCC-HN19细胞的外泌体(1x NCC-HN19EV)联合第一代酪氨酸激酶抑制剂(吉非替尼或厄洛替尼)、第二代酪氨酸激酶抑制剂(阿法替尼或达克替尼)和第三代酪氨酸激酶抑制剂(拉帕替尼、那扎替尼、WZ4002或奥希替尼)处理的NCC-HN120M细胞的存活百分比。图11C示出了用NCC-HN19EV和八种酪氨酸激酶抑制剂共处理的NCC-HN182M细胞的结果。各图示出了未用外泌体(无EV)或用来自NCC-HN19细胞的外泌体(1x NCC-HN19EV)联合第一代酪氨酸激酶抑制剂(吉非替尼或厄洛替尼)、第二代酪氨酸激酶抑制剂(阿法替尼或达克替尼)和第三代酪氨酸激酶抑制剂(拉帕替尼、那扎替尼、WZ4002或奥希替尼)处理的NCC-HN182M细胞的存活百分比。图11D示出了用NCC-HN137EV和八种酪氨酸激酶抑制剂共处理的NCC-HN1细胞的结果。各图示出了未用外泌体(无EV)或用来自NCC-HN137P细胞的外泌体(1x NCC-HN137P EV)联合第一代酪氨酸激酶抑制剂(吉非替尼或厄洛替尼)、第二代酪氨酸激酶抑制剂(阿法替尼或达克替尼)和第三代酪氨酸激酶抑制剂(拉帕替尼、那扎替尼、WZ4002或奥希替尼)处理的NCC-HN1细胞的存活百分比。图11E示出了用NCC-HN137EV和八种酪氨酸激酶抑制剂共处理的NCC-HN120M细胞的结果。各图示出了未用外泌体(无EV)或用来自NCC-HN137P细胞的外泌体(1x NCC-HN137P EV)联合第一代酪氨酸激酶抑制剂(吉非替尼或厄洛替尼)、第二代酪氨酸激酶抑制剂(阿法替尼或达克替尼)和第三代酪氨酸激酶抑制剂(拉帕替尼、那扎替尼、WZ4002或奥希替尼)处理的NCC-HN120M细胞的存活百分比。图11F示出了用NCC-HN137EV和八种酪氨酸激酶抑制剂共处理的NCC-HN182M细胞的结果。各图示出了未用外泌体(无EV)或用来自NCC-HN137P细胞的外泌体(1x NCC-HN137PEV)联合第一代酪氨酸激酶抑制剂(吉非替尼或厄洛替尼)、第二代酪氨酸激酶抑制剂(阿法替尼或达克替尼)和第三代酪氨酸激酶抑制剂(拉帕替尼、那扎替尼、WZ4002或奥希替尼)处理的NCC-HN182M细胞的存活百分比。图11G示出了用NCC-HN19EV和NCC-HN137EV以及八种酪氨酸激酶抑制剂共处理的NCC-HN1、NCC-HN120M和NCC-HN182M细胞的热图(作为总结)。该热图示出了未用外泌体(仅TKI)或用来自NCC-HN19细胞(NCC-HN19 EV)的外泌体或用来自NCC-HN137P细胞的外泌体(NC-HN137P EV)联合第一代酪氨酸激酶抑制剂(吉非替尼或厄洛替尼)、第二代酪氨酸激酶抑制剂(阿法替尼或达克替尼)和第三代酪氨酸激酶抑制剂(拉帕替尼、那扎替尼、WZ4002或奥希替尼)处理的NCC-HN1、NCC-HN120M和NCC-HN182M细胞的IC

图12示出了表明增加量的外泌体EGFR同种型D是否可以调节对酪氨酸激酶抑制剂(TKI)处理的敏感性的数据。图12A示出了用来自NCC-HN19的EV和吉非替尼、阿法替尼或达克替尼共处理的NCC-HN1、NCC-HN120M和NCC-HN182M细胞的结果。各图示出了未用外泌体(无EV)或用来自NCC-HN19细胞的0.5x(0.5x NCC-HN19 EV)、1x(1xNCC-HN19 EV)或2x(2xNCC-HN19 EV)的相对量的外泌体联合第一代酪氨酸激酶抑制剂(吉非替尼)或第二代酪氨酸激酶抑制剂(阿法替尼或达克替尼)处理的NCC-HN1、NCC-HN120M和NCC-HN182M细胞的存活百分比。图12B示出了用来自具有过表达的EGFR同种型D的293T的EV以及吉非替尼、阿法替尼或达克替尼共处理的NCC-HN1、NCC-HN120M和NCC-HN182M细胞的结果。各图示出了未用外泌体(无EV)或用来自表达同种型D的293T细胞的0.5x(0.5x 293T pBob-IsoD EV)、1x(1x293T pBob-IsoD EV)或2x(2x 293T pBob-IsoD EV)相对量的外泌体联合第一代酪氨酸激酶抑制剂(吉非替尼)或第二代酪氨酸激酶抑制剂(阿法替尼或达克替尼)处理的NCC-HN1、NCC-HN120M和NCC-HN182M细胞的存活百分比。图12C示出了用来自具有过表达同种型D的NCC-HN1的EV以及吉非替尼、阿法替尼或达克替尼共处理的NCC-HN1、NCC-HN120M和NCC-HN182M细胞的结果。各图示出了未用外泌体(无EV)或用来自表达同种型D的NCC-HN1细胞的0.5x(0.5xNCC-HN1 pBob-IsoD EV)、1x(1x NCC-HN1 pBob-IsoD EV)或2x(2xNCC-HN1pBob-IsoD EV)相对量的外泌体联合第一代酪氨酸激酶抑制剂(吉非替尼)或第二代酪氨酸激酶抑制剂(阿法替尼或达克替尼)处理的NCC-HN1、NCC-HN120M和NCC-HN182M细胞的存活百分比。该数据表明，来自具有内源性高EGFR同种型D表达的HNSCC细胞(HN19)、具有内源性低但被改造为过表达同种型D的HNSCC细胞(HN1pBob-IsoD)或具有异位表达的EGFR同种型D的非HNSCC细胞(293TpBob-IsoD)的EV能够以剂量依赖性方式提高针对酪氨酸激酶抑制剂(TKI)的癌细胞敏化。

图13示出了蛋白酶K消化时分离的外泌体的蛋白质印迹分析结果。将来自NCC-HN19的经分离外泌体在不存在(-)或存在(+)1％ Triton-X100的情况下进行蛋白酶K消化0、15、30、60分钟(min)。分析样品是否存在EGFR同种型D、EpCAM和ALIX。将等量的总蛋白上样到每个泳道中。该数据表明EGFR同种型D以与EpCAM类似的方式位于EV颗粒的表面上。

图14A示出了来自HNSCC细胞系的总细胞裂解物(TL)和细胞外级分(EV)的蛋白质印迹分析结果。图14B示出了描绘所获得的HNSCC细胞系的IC

图15示出了在不存在(无EV)或存在稳定转染了抗EGFR同种型D的shRNA对照(pLKO1 EV)、shRNA链#1(shIsoD_1)或shRNA链#2(shIsoD_2)的NCC-HN19 EV(上图)或NCC-HN137P(下图)的情况下，用吉非替尼、阿法替尼或达克替尼处理的NCC-HN1、NCC-HN120M和NCC-HN182M的IC

图16示出了稳定转染了抗EGFR同种型D的shRNA对照(pLKO-1)、shRNA链#1(shIsoD_1)或shRNA链#2(shIsoD_2)的NCC-HN1和NCC-HN137P细胞的(A)相对mRNA水平和(B)蛋白质印迹分析的结果。TL：总细胞裂解物；EV：经分离的细胞外囊泡级分。针对蛋白质印迹，每个泳道上样等量的蛋白质。CD9用作外泌体标志物。图像示出了来自三个独立细胞培养实验的代表性印迹。该数据表明，同种型D相对于在图15的实验中的mRNA和蛋白质而言水平降低。

图17示出了在不存在或存在1μM Pitstop 2(PS2)的情况下，用(A)吉非替尼、(B)阿法替尼或(C)达克替尼处理，并与来自过表达载体对照(pBob)或EGFR同种型D(pBob-IsoD)的HEK293T的EV共处理的NCC-HN1、NCC-HN120M和NCC-HN182M获得的IC

图18示出了添加EV 8小时后用或未用(未处理)PitStop2处理的NCC-HN1细胞的免疫荧光测定。EEA1用于标记早期内体区室。该数据表明，抑制网格蛋白介导的内吞作用阻止了EGFR同种型D内化到细胞中。

图19示出了表明靶细胞中Rab5A的敲低降低了同种型D外泌体(EV)赋予的敏化效应的结果。图19A示出了在不存在(无EV)或存在来自过表达载体(pBob)或同种型D(pBob-同种型D)的HEK293T的EV的情况下，转染了siRNA对照(siCtrl)、siRab5A链#1(siRab5A_1)或siRab5A链#2(siRab5A_2)并且用吉非替尼、阿法替尼或达克替尼共处理的NCC-HN1、NCC-HN120M和NCC-HN182M的IC

图20示出了表明靶细胞中Rab7A的敲低降低了同种型D EV赋予的敏化效应的结果。图20A示出了在不存在(无EV)或存在来自过表达载体(pBob)或同种型D(pBob-同种型D)的HEK293T的EV的情况下，转染了siRNA对照(siCtrl)、siRab7A链#1(siRab7A_1)或siRab7A链#2(siRab7A_2)并且用吉非替尼、阿法替尼或达克替尼共处理的NCC-HN1、NCC-HN120M和NCC-HN182M的IC

图21示出了表明靶细胞中EEA1的敲低降低了同种型D外泌体(EV)赋予的敏化效应的数据。图21A示出了在不存在(无EV)或存在来自过表达载体(pBob)或EGFR同种型D(pBob-同种型D)的HEK293T的EV的情况下，转染了siRNA对照(siCtrl)、siEEA1链#1(siEEA_1)或siEEA1链#2(siEEA_2)并且用吉非替尼、阿法替尼或达克替尼共处理的NCC-HN1和NCC-HN182M的IC

图22示出了获得了在不存在或存在0.5nM巴佛洛霉素A1的情况下，用吉非替尼处理并且用来自过表达载体对照(pBob)或同种型D(pBob-IsoD)的HEK293T的EV共处理的NCC-HN1、NCC-HN120M和NCC-HN182M的IC

图23示出了表明靶细胞中Rab11A的敲低提高了EGFR同种型D外泌体(EV)赋予的敏化效应的数据。示出了在不存在(无EV)或存在来自过表达载体(pBob)或同种型D(pBob-同种型D)的HEK293T的EV的情况下，转染了siRNA对照(siControl)或siRab11A并且用吉非替尼、阿法替尼或达克替尼共处理的NCC-HN1和NCC-HN182M的IC

图24示出了表明外泌体EGFR同种型D与靶细胞上的EGFR同种型A相互作用的数据，如免疫沉淀测定(IP)的蛋白质印迹分析所证实的。图24A示出了在用来自过表达载体(pBob)或同种型D(IsoD)的HEK293T的EV处理的NCC-HN1细胞中，使用EGFR同种型D抗体进行沉淀的结果，而图24B示出了使用EGFR同种型A抗体进行沉淀的结果。NC：未经处理的阴性对照。不受理论束缚，认为EGFR同种型A可能是细胞表面上EGFR同种型D的结合配偶体。

图25示出了表明当用EGFR同种型D外泌体(EV)和阿法替尼共处理时，HNSCC异种移植物的肿瘤负荷降低的线形图。皮下植入NCC-HN120M的Bulb/c裸鼠开始于5mg/kg阿法替尼的每日口服剂量以及瘤周注射来自过表达载体(pBobEV)或EGFR同种型D(IsoDEV)的HEK293T的EV的72小时间隔方案。这证实了含EGFR同种型D的EV的酪氨酸激酶抑制剂-敏化效应可以在体内患者来源的异种移植模型中复制。

图26示出了表明仅纯化的EGFR同种型D蛋白不会使细胞对吉非替尼敏化的数据。示出了当用吉非替尼和产生于并纯化自细菌(A)或哺乳动物HEK293F细胞(B)中的人EGFR同种型D蛋白共处理时，NCC-HN1细胞的活力测定结果。来自过表达同种型D(10％293T pBob-IsoD EV)的HEK293T的外泌体(EV)用作对照(B)。这证实了无论该蛋白是在细菌还是哺乳动物系统中产生的，单独的EGFR同种型D蛋白(即，不与EV结合的EGFR蛋白)无法使细胞对酪氨酸激酶抑制剂(TKI)敏化。

图27示出了表明在阿法替尼和细胞外囊泡共处理后，未观察到小鼠体重的变化的数据。箭头表示开始每日口服施用阿法替尼以及每72小时地瘤周注射细胞外囊泡(EV)。这证实了在实验过程中递送至图25中小鼠的疗法具有最小的副作用/毒性。

定义

如本文所用，术语“EGFR”是指“表皮生长因子受体”，一种跨膜蛋白，它是表皮生长因子家族(EGF家族)成员细胞外蛋白配体的受体。表皮生长因子受体是ErbB受体家族的成员，ErbB受体家族是四种密切相关的受体酪氨酸激酶的亚家族：EGFR(ErbB-1)、HER2/neu(ErbB-2)、Her 3(ErbB-3)和Her 4(ErbB-4)。在许多癌症类型中，影响EGFR表达或活性的突变可能导致癌症。人EGFR和其他受体酪氨酸激酶的信号传导缺乏与阿尔茨海默病等疾病有关，而过表达与多种肿瘤的发展有关。通过阻断受体的细胞外结构域上的EGFR结合位点或通过抑制细胞内酪氨酸激酶活性来中断EGFR信号传导，可以防止表达EGFR的肿瘤生长并改善患者的病情。

如本文所用，术语“EGFR-AS1”是指对应于由EGFR基因表达的内含子和外显子20的2.8kb序列。

如本文所用，术语“同种型”或“蛋白质同种型”是指从同一基因编码的不同形式的蛋白质。这些蛋白质在结构和组成上可能不同，这些差异是通过单个基因的mRNA的可变剪接、可变启动子使用或其他转录后修饰而调节的。已证明该可变剪接对蛋白质组的多样性有很大的影响。所产生的蛋白质的特异性取决于蛋白质结构/功能、发育阶段甚至细胞类型。当蛋白质具有多个亚基并且每个亚基具有多个同种型时，同种型形成变得更加复杂。

如本文所用，术语“酪氨酸激酶”是指能够将磷酸基团从三磷酸腺苷(ATP)转移到细胞中靶蛋白的酶。它在许多细胞功能中充当“开”或“关”的开关。酪氨酸激酶是蛋白激酶的一个亚类，其中酪氨酸激酶如此命名是因为它将磷酸基团从ATP转移至靶蛋白内的酪氨酸残基。有两个已知的酪氨酸激酶家族，即受体酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase，RTK)和非受体或细胞质酪氨酸激酶，其中受体酪氨酸激酶包含跨膜结构域和一个或多个细胞外配体结合结构域。细胞质酪氨酸激酶不具有此种跨膜结构域或任何细胞外配体结合结构域。

鉴于上述情况，术语“TKI”是指酪氨酸激酶抑制剂，其是抑制酪氨酸激酶的化合物或药物。酪氨酸激酶是负责通过信号转导级联激活许多蛋白质的酶。蛋白质通过向其添加磷酸基团(磷酸化)而被激活，这即为TKI所抑制的步骤。TKI通常用作抗癌药物。第一代酪氨酸激酶抑制剂通过与ATP结合位点结合来阻断EGFR诱导的下游信号传导激活而起作用，并且通常包含可逆抑制剂。第二代酪氨酸激酶抑制剂是更有效的药物，并且扩大了对吉非替尼/厄洛替尼耐药的广谱突变的抑制；这些主要但不限于ErbB家族阻断剂；并且通常包含不可逆的抑制剂。创建了具有嘧啶核心结构的第三代酪氨酸激酶抑制剂，以靶向T790M克隆，其中保持了对原始外显子19缺失(19del)和L858R突变的活性。第三代抑制剂结合在C797位点并对T790M突变具有选择性，对在第一代抑制剂后耐药的T790M患者具有应答。

如本文所用，术语“外泌体的”或“外泌体”是指在大多数真核细胞的内体区室中产生的膜结合性细胞外囊泡(EV)。多泡体(multivesicular body，MVB)是特殊的内体子集，其含有膜结合性腔内囊泡(intraluminal vesicle，ILV)，该腔内囊泡由于内体的限位膜内陷和出芽进入内体腔而形成。如果MVB与细胞表面(质膜)融合，这些ILV作为外泌体释放。外泌体可以含有不同的货物，诸如但不限于蛋白质、脂质和核酸。这些货物经过专门分选而被包装成外泌体。包装成外泌体的内容物是细胞类型特异性的，并且还受到细胞条件的影响。例如，外泌体微小RNA(exomiR)和蛋白质被分选包装在外泌体中。

在多细胞生物中，外泌体和其他细胞外囊泡(EV)存在于组织中，也可以在包括血液、尿液和脑脊液在内的生物体液中找到。它们也通过经培养的细胞在体外释放到它们的生长培养基中。由于外泌体的大小受到亲本MVB的限制，外泌体通常被认为比大多数其他细胞外囊泡小，直径约30至150纳米(nm)：与许多脂蛋白的大小大致相同，但比细胞小得多。在本公开的上下文中，术语“外泌体”和“细胞外囊泡”可互换使用。

如本文所用，术语“SNP”是指“单核苷酸多态性”，它是当基因组序列中的单个核苷酸(A、T、C或G)在生物物种的成员之间或人的成对染色体之间改变或不同时发生的DNA序列变异。因此，如本文所用，SNP是任何特征为在至少一个等位基因中的特定物理位置处具有不同的单核苷酸的多态性。给定群体中的每个个体都有许多单核苷酸多态性，这些多态性共同形成了该个体独特的DNA模式。

如本文所用，术语“可变剪接”是指在基因表达过程中导致单个基因编码多种蛋白质的调节过程。在该过程中，基因的特定外显子(即成为成熟RNA一部分的遗传密码部分)可被包含在由该基因产生的最终加工信使RNA(mRNA)内或被排除于其外。被排除的序列被称为内含子，来自基因内区域，即基因内部的区域。术语内含子和外显子是指基因内的DNA序列和RNA转录本中的相应序列。因此，由可变剪接的mRNA翻译的蛋白质将在其氨基酸序列方面有差异，并且通常在其生物学功能方面有差异。

如本文所用，术语“多态性”是指在例如动物物种中存在两种或两种以上明显不同的形式(形态)。在遗传学中，(遗传)多态性用于描述DNA序列中基本上在个体间、功能上沉默的差异，这些差异使每个人的基因组独一无二。换句话说，遗传多态性是在同一种群中出现的多个离散等位基因状态，其中至少两个具有高频率。传统上，高频被定义为所讨论人群的1％或更多。遗传多态性的一个实例是单核苷酸多态性(SNP)，它是发生在基因组中特定位置处的单个核苷酸变异，其中每种变异在群体内以某种可感知的程度存在(例如，超过所述群体的1％)。

具体实施方式

基于队列的测序研究未能证明在头颈部鳞状细胞癌中激活了表皮生长因子受体(EGFR)外显子18至21的突变。此外，这些研究也未能鉴定或证明已知的应答预测因子(诸如EGFR扩增)，尽管这些肿瘤的一部分将对酪氨酸激酶抑制剂疗法产生应答。这表明这些肿瘤仍然通过非基因组机制由EGFR驱动。

本文公开了从基因组和RNA改变鉴定的生物标志物套件(suite)，其最终调节表皮生长因子受体(EGFR)的抑制作用。该信息通过研究对表皮生长因子受体(EGFR)酪氨酸激酶抑制剂(TKI)有异常应答的患者获得。该数据表明，在少数患者中，表皮生长因子受体单核苷酸多态性(SNP)导致特异性长非编码RNA(lncRNA)，EGFR-AS1，其改变表皮生长因子受体剪接，从而使肿瘤对常用的表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂敏化。不受理论束缚，该作用被认为是通过调节表皮生长因子受体(EGFR)同种型D的固有细胞水平而介导的。实验数据显示，调节表皮生长因子受体同种型D的固有细胞水平在体外/离体(在培养的患者来源细胞中、在患者来源的异种移植模型中等)足以使肿瘤细胞对这些药物敏化，并且已在体内(在临床病例中)观察到这一点。

本文还公开了EGFR同种型D，例如外泌体EGFR同种型D，作为联合治疗或联合疗法以增强或调节表皮生长因子受体-酪氨酸激酶抑制剂疗法在野生型EGFR(其为没有任何突变的EGFR基因)患者中的作用的用途。

在一个实例中，公开了同种型D的外部应用。在另一个实例中，此种外部应用可以以联合药物、联合疗法和/或作为表皮生长因子受体-酪氨酸激酶抑制剂疗法的附加治疗剂的形式，但不限于这些形式。

在一个实例中，EGFR同种型D在外泌体中分泌。在另一个实例中，这些含有EGFR同种型D的外泌体被施用于有需要的人。在又一个实例中，含有EGFR同种型D的外泌体被施用于有需要的人。

外泌体EGFR同种型D也可以应用于培养的患者来源细胞，其中已证明EGFR同种型D的此种外部应用提高了细胞对酪氨酸激酶抑制剂疗法或酪氨酸激酶抑制剂的敏感性。

EGFR同种型D的这种外部或外在应用使用内吞途径来提升野生型EGFR中的酪氨酸激酶抑制剂敏感性。

在EGFR信号传导期间，受体稳态和下调通过内吞过程受到监管。此外，有报告表明，内吞过程可能对EGFR信号传导至关重要，特别是在EGFR特定突变的背景下。因此，试图测试外泌体EGFR同种型D是否通过这些内吞过程发挥其表型以实现其敏化效应。为此，使用了网格蛋白介导的内吞作用的抑制剂PitStop2。已知PitStop2抑制大多数EGFR依赖性内吞作用。结果表明，PitStop2与含有EGFR同种型D的外泌体的共处理逆转了单独用EGFR同种型D处理细胞时获得的敏化效应(图9)。该结果证明了EGFR同种型D介导的敏感性需要通过内吞过程进行的EGFR信号传导。

对于大多数患有鳞状细胞癌(例如但不限于头颈癌、肺癌、食道癌、膀胱癌和宫颈癌)的患者(>80％-90％)，这些癌症依赖于表皮生长因子受体(EGFR)通路。然而，由于EGFR通常不会突变，表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR TKI)几乎没有作用。在此类EGFR以野生型形式存在的病例中，外泌体EGFR同种型D可以作为联合药物用于或施用于这些患者，从而增强EGFR TKI对这些在其他情况下无应答的癌症的作用，并增加肿瘤对酪氨酸激酶抑制剂类药物的敏感性和/或易感性(vulnerability)。

EGFR依赖性癌症的实例包括但不限于头颈癌、鳞状细胞癌、头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)、口腔鳞状细胞癌(OSCC)、食管癌、膀胱癌、宫颈癌、肺癌、鳞状细胞皮肤癌(也称为皮肤鳞状细胞癌；cSCC)和非小细胞肺癌(NSCLC)。在一个实例中，EGFR相关癌症是头颈癌、食道癌、膀胱癌、宫颈癌、皮肤癌和肺癌，但不限于此。在另一个实例中，头颈癌是头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)或口腔鳞状细胞癌(OSCC)。在又一个实例中，肺癌是非小细胞肺癌(NSCLC)。在进一步的实例中，癌症是皮肤癌。在另一个实例中，皮肤癌是鳞状细胞皮肤癌。

发现了具有EGFR单核苷酸多态性(SNP)的细胞系，特别是Q787QA/A，对表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR TKI)敏感。此类具有突变EGFR的细胞也显示出具有提高的EGFR同种型D的mRNA表达(见图1)。

为了研究EGFR同种型D的定位，测试了来自这些细胞系中的一种：NCC-HN19的分泌级分。发现了EGFR同种型D存在于培养物上清液中，确切地说，存在于细胞的外泌体成分中(图2)。先前的研究表明，细胞中EGFR同种型D与同种型A表达的高比值导致了表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR TKI)敏感性，并且EGFR同种型D被分泌到细胞外区室中。不受理论束缚，认为该敏化效应可被转移。为此，使用分子量截止过滤器从含有高水平EGFR同种型D的细胞(NCC-HN19)培养上清液分离外泌体，随后应用于通常对表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂吉非替尼耐药的细胞(NCC-HN1)。然后在有或没有外泌体处理的情况下，用吉非替尼处理这些细胞以确定IC

接下来，试图确定外泌体EGFR同种型D本身是否是赋予表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR TKI)敏感性所必需的。为了确定EGFR同种型D是调节靶细胞对吉非替尼治疗敏感性的必需蛋白质，使用两种不同的shRNA敲低EGFR同种型D的表达(图5)。数据表明，与对照(含有正常水平的EGFR同种型D表达的外泌体)相比，使用EGFR同种型D表达降低(敲低)的外泌体处理靶细胞导致对吉非替尼的敏感性降低。这表明EGFR同种型D对于向对酪氨酸激酶抑制剂(TKI)处理不敏感的细胞赋予敏化效应是必需的。

为了确定EGFR同种型D本身是否足以使细胞对酪氨酸激酶抑制剂(TKI)处理敏化，在胚肾细胞系HEK 293T中过表达EGFR同种型D蛋白，该细胞系不含EGFR同种型D，通常用于衍生治疗性外泌体。然后纯化经表达的蛋白质/外泌体并将其应用于靶细胞(在该情况下为HCC-HN1细胞)。发现含有过表达EGFR同种型D的外泌体增强了对随后吉非替尼处理的敏感性(图6)。

通过将293T来源的外泌体EGFR同种型D应用于许多种不同的患者来源的细胞系并随后用不同的EGFR酪氨酸激酶抑制剂(TKI)处理，重复了后一个实验。结果表明，酪氨酸激酶抑制剂(TKI)与含有EGFR同种型D的外泌体的共处理提升了对EGFR TKI的敏感性(图7)。

显示出，使用增加量的含过表达的EGFR同种型D的来自293T细胞的外泌体，剂量依赖性地提升了针对EGFR TKI的敏感性(图8)。进一步表明，在上述任意系统中，经纯化的非外泌体EGFR同种型D的应用对酪氨酸激酶抑制剂的应答几乎没有影响(图10)。结果表明，细菌系统表达的EGFR同种型D版本(缺乏外泌体包装)对细胞的作用与施用外泌体EGFR同种型D的作用不同。为了研究经分离的EGFR同种型D蛋白的功能，在细菌系统中过表达EGFR同种型D蛋白并随后纯化。然后用经纯化的EGFR同种型D蛋白和吉非替尼共处理NCC-HN1细胞。数据表明，当在细菌中产生EGFR同种型D而未将其包装成外泌体时，无法使细胞对吉非替尼处理敏化。该数据如图10所示。此外，认为经表达的EGFR同种型D蛋白是膜结合性的，从而进一步强调了外泌体形式的蛋白质的必要性。

为了确定EGFR同种型D在外泌体中的定位，利用了外泌体的脂质膜阻止大分子扩散到外泌体腔中的生化特性。在不存在或存在脂质干扰洗涤剂1％ Triton-X 100的情况下，将蛋白酶K施加于经纯化的外泌体一段限定的时间(0至60分钟)。是否存在由此产生的EGFR同种型D与外泌体表面结合蛋白EpCAM或外泌体管腔蛋白ALIX具有相关性。从蛋白质印迹分析中可以看出(见图13)，EGFR同种型D消化谱与EpCAM水平密切相关，表明EGFR同种型D位于外泌体表面。

因此，在一个实例中，表皮生长因子受体同种型D是外泌体表皮生长因子受体同种型D，在本文中也称为“EGFR IsoD”或其变体。在又一个实例中，表皮生长因子受体同种型D作为外泌体制剂(例如纳米颗粒)提供。在另一个实例中，表皮生长因子受体同种型D作为以下中的一种或多种提供：外泌体制剂、脂质体制剂、纳米载体和纳米颗粒。

本文所示的数据表明，外泌体EGFR同种型D可以在用于头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)的吉非替尼疗法中作为共处理剂/共治疗剂提供，以提高吉非替尼治疗方案的效率。

本文还公开了使用如本文公开的表皮生长因子受体同种型D在制造用于治疗EGFR相关癌症的联合疗法的药物中的用途，其中所述药物与酪氨酸激酶抑制剂联合施用。在此类实例中，酪氨酸激酶抑制剂在表皮生长因子受体同种型D之前、之后待单独施用或单独施用、或与表皮生长因子受体同种型D联合施用。

数据显示，EGFR同种型D依赖性细胞敏化对一系列不同的靶向野生型EGFR的酪氨酸激酶抑制剂(TKI)有效。为了测试在EGFR外泌体同种型D存在下头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)细胞系对酪氨酸激酶抑制剂(TKI)的应答，使用了三种原代细胞系，即NCC-HN1、NCC-HN120M和NCC-HN182M。选择了代表临床中使用的三个代系的酪氨酸激酶抑制剂(TKI)的一组八种TKI，即吉非替尼和厄洛替尼(第一代)；阿法替尼和达克替尼(第二代)；以及拉帕替尼、那扎替尼、WZ4002和奥希替尼(第三代)。在来源于NCC-HN19和NCC-HN137P细胞的外泌体(EV)的存在下，分别用八种酪氨酸激酶抑制剂单独处理NCC-HN1、NCC-HN120M和NCC-HN182M细胞。结果(如图11所示)表明，当与含有内源性表达的EGFR同种型D的外泌体(来自NCC-HN19和NCC-HN137P的EV)共处理时，针对第一代和第二代酪氨酸激酶抑制剂实现的细胞敏化最高效(图11A-G)。图11H显示，当与含有过表达的EGFR同种型D的外泌体(来自293T的EV)共处理时，针对第一代(吉非替尼)和第二代(阿法替尼和达克替尼)酪氨酸激酶抑制剂，HNSCC细胞也实现了敏化。

因此，在一个实例中，酪氨酸激酶抑制剂是EGFR抑制剂。在另一个实例中，酪氨酸激酶抑制剂是第一代酪氨酸激酶抑制剂。在又一个实例中，酪氨酸激酶抑制剂是第二代酪氨酸激酶抑制剂。在又一实例中，酪氨酸激酶抑制剂是第三代酪氨酸激酶抑制剂。

酪氨酸激酶抑制剂的实例包括但不限于吉非替尼、厄洛替尼、盐酸厄洛替尼(erlotinib HCl)、拉帕替尼、达克替尼、TAE684、阿法替尼、达沙替尼、塞卡替尼、来那替尼(veratinib)、AEE788、WZ4002、埃克替尼、奥希替尼、BI1482694、ASP8273、EGF816、AZD3759、那扎替尼及其组合。第一代酪氨酸激酶抑制剂的实例包括但不限于吉非替尼和厄洛替尼。第二代酪氨酸激酶抑制剂的实例包括但不限于阿法替尼和达克替尼。第三代酪氨酸激酶抑制剂的实例包括但不限于拉帕替尼、那扎替尼、WZ4002和奥希替尼。在一个实例中，酪氨酸激酶抑制剂是(但不限于)吉非替尼、厄洛替尼和拉帕替尼，及其组合。在另一个实例中，酪氨酸激酶抑制剂是(但不限于)吉非替尼、阿法替尼和达克替尼，及其组合。

进一步的数据示出了与所用剂量(EGFR同种型D的任意和预期定量)相比，敏化程度的剂量应答。为了观察增加量的外泌体同种型D是否调节对酪氨酸激酶抑制剂处理的敏感性，对NCC-HN1、NCC-HN120M和NCC-HN182M细胞施加增加剂量的含有NCC-HN19(内源性表达的同种型D)、293T和NCC-HN1(强制表达的同种型D)来源的EGFR同种型D的外泌体(EV)，同期联合吉非替尼、阿法替尼或达克替尼处理。这些实验清楚地表明，细胞对酪氨酸激酶抑制剂处理的敏感性存在剂量依赖性效应，由此，提高外泌体EGFR同种型D的量导致对EGFR酪氨酸激酶抑制剂的敏感性提高。该信息如图12所示。

因此，在一个实例中，公开了一种提高EGFR相关癌症对表皮生长因子受体(EGFR)酪氨酸激酶抑制剂(TKI)的敏感性的方法，该方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的表皮生长因子受体同种型D。在另一个实例中，该方法或用途进一步包括施用酪氨酸激酶抑制剂(TKI)。本文还公开了表皮生长因子受体同种型D在制造用于提高EGFR相关癌症对表皮生长因子受体(EGFR)酪氨酸激酶抑制剂(TKI)的敏感性的药物中的用途。还公开了表皮生长因子受体同种型D用于提高EGFR相关癌症对表皮生长因子受体(EGFR)酪氨酸激酶抑制剂(TKI)的敏感性。

在另一个实例中，公开了一种治疗患有EGFR相关癌症的受试者的方法，其包括向受试者施用有效量的表皮生长因子受体同种型D；以及向受试者施用有效量的用于治疗EGFR相关癌症的酪氨酸激酶抑制剂。同样，本文公开了使用表皮生长因子受体同种型D联合酪氨酸激酶抑制剂在制造用于治疗EGFR相关癌症的药物中的用途，其中酪氨酸激酶抑制剂能够治疗EGFR相关癌症。联合意指表皮生长因子受体同种型D和酪氨酸激酶抑制剂可以一起或单独施用和/或还可以以单独或组合剂型施用。

进一步表明，具有更高分泌性EGFR同种型D的HNSCC细胞系(图14A)对酪氨酸激酶抑制剂(TKI)更敏感(图14B)。将来自固有的(酪氨酸激酶抑制剂-)敏感细胞(诸如，但不限于HN19和HN137P)的细胞外囊泡应用到酪氨酸激酶抑制剂耐药细胞(诸如，但不限于HN1、HN120M和HN182M)使得这些耐药细胞对吉非替尼、阿法替尼和达克替尼敏化(图14C)。用本文公开的八种EGFR酪氨酸激酶抑制剂中的任何一种共处理耐药细胞显示了类似的效果(图11G)。

通过使用两条shRNA链敲低另外的细胞系(HN137P)中的同种型D来进行敲低研究(图15)。图16通过示出相对mRNA(图16A)和蛋白质(图16B)定量来显示敲低的结果。如HN19和HN137P细胞系所示，同种型D的敲低降低了含有EGFR同种型D的细胞外囊泡在与吉非替尼、阿法替尼和达克替尼共处理时赋予提高的敏感性的能力。

为了示出对网格蛋白介导的内吞作用的抑制降低了与TKI共处理时含有同种型D的细胞外囊泡的敏化效应，使用网格蛋白介导的内吞抑制剂(PitStop2)进行了实验。在该实验中，包括了另外两种细胞系HN120M和HN182M细胞(除HN1之外)，并用吉非替尼(图17A)、阿法替尼(图17B)和达克替尼(图17C)进行共处理。在所有三种HNSCC细胞系中，PitStop2被示出可以持续降低EGFR同种型D细胞外囊泡的敏化效应。不受理论束缚，认为PitStop2阻止了含有EGFR同种型D的细胞外囊泡的内吞作用，从而阻止了EGFR同种型D进入靶细胞。认为这反过来会降低(或至少不会提高)靶细胞对酪氨酸激酶抑制剂的敏感性。免疫荧光测定的结果表明，用PitStop2处理的细胞显示EGFR同种型D位于细胞膜上，而不是在内部细胞区室中(图18)。

为了进一步确定有助于EGFR同种型D的敏化效应的靶细胞中内吞过程的作用和要求，系统性地敲低了一系列将内吞货物从细胞膜转运到细胞内的管腔区室所必需的蛋白质。例如，一种这样的蛋白质是Rab5A蛋白，其对于将货物从细胞表面转运到早期内体区室很重要。另一种蛋白质Rab7A在将货物从早期内体转运到晚期内体区室中发挥作用。EEA1是存在于早期内体区室中的支架蛋白。

首先，敲低了HN1、HN120M和HN182M细胞中的Rab5A。随后用从过表达HEK293T细胞中获得的EGFR同种型D细胞外囊泡共处理这些细胞。与对照相比，观察到表达EGFR同种型D的细胞外囊泡赋予了降低的敏化(图19A)。图19B示出了siRab5A敲低的相对mRNA。

其次，敲低了HN1、HN120M和HN182M细胞中的Rab7A，随后用过表达EGFR同种型D细胞外囊泡的HEK293T共处理细胞。与siRab5A一样，与对照相比，观察到表达同种型D的EV赋予了降低的敏化(图20A)。图20B示出了siRab7A敲低的相对mRNA。

最后，在HN1和HN182M细胞中敲低了EEA1，随后用过表达EGFR同种型D细胞外囊泡的HEK293T共处理这些细胞。与上述一致，与对照相比，EGFR同种型D细胞外囊泡赋予的敏化降低(图21A)。图21B示出了siEEA1敲低的相对mRNA。

图20、21和22中的数据综合表明，细胞外囊泡逆行转运到细胞区室中是EGFR同种型D细胞外囊泡赋予其对细胞的敏化效应所必需的。

为了阐明溶酶体(内体下游的区室)在介导EGFR同种型D细胞外囊泡共处理的敏感性方面所起的作用，使用抑制剂巴佛洛霉素破坏溶酶体区室。敲低siRab11A进一步破坏了内吞循环过程，siRab11A对于货物从内吞区室到细胞表面的顺行转运很重要。

在本申请的早期已经表明，当与EGFR同种型D细胞外囊泡共同应用时，巴佛洛霉素引起的溶酶体抑制提高了HN1对吉非替尼的敏感性。对此，在另一种细胞系HN182M中观察到类似结果(图22)。

当用siRab11A破坏再循环过程时，EGFR同种型D细胞外囊泡处理的细胞显示对吉非替尼、阿法替尼和达克替尼的敏感性提高(图23)。

来自图25和图26的数据表明，EGFR同种型D细胞外囊泡在靶细胞的细胞内区室内的保留提高了敏化效应。

为了了解EGFR同种型D细胞外囊泡的下游靶标，并鉴于EGFR同种型D和EGFR同种型A之间存在保守的N末端结构域，进行了免疫沉淀测定以确定这两种蛋白质是否相互作用。图24A示出了EGFR同种型D在30分钟内下拉EGFR同种型A的结果。当进行反向下拉(图24B)时，在使用EGFR同种型A蛋白下拉时，EGFR同种型D的浓度增加。该数据表明EGFR同种型A和EGFR同种型D相互作用。

为了说明EGFR同种型D在体内环境中的治疗效果，通过皮下植入HN120M在Bulb/c裸鼠中生成异种移植模型。图25的数据显示了与对照相比，阿法替尼与EGFR同种型D的联合施用降低了肿瘤生长速率。

此外，还确定了细胞外囊泡包装对EGFR同种型D有效赋予其敏化效应的必要性和影响。单独产生EGFR同种型D蛋白并将其引入癌细胞。图26示出了细菌或哺乳动物细胞HEK293F中产生的EGFR同种型D蛋白未能赋予其敏化效应。该数据表明，EGFR同种型D需要包装到细胞外囊泡或外泌体中才能赋予其敏化效应。

本文提供的数据强调了外泌体表皮生长因子受体(EGFR)同种型D作为提高细胞对EGFR酪氨酸激酶抑制剂(TKI)敏感性的药剂的用途和应用，从而证实了其作为药物或联合用药物的用途。敲低和过表达研究还表明，EGFR同种型D以细胞外囊泡(EV)或外泌体形式存在是必要的，并且足以提高细胞对多种EGFR TKI的敏感性。在一个实例中，还显示来自过表达同种型D的HEK293T细胞的细胞外囊泡(EV)能够使头颈部小细胞癌(HNSCC)细胞对一组八种酪氨酸激酶抑制剂敏化。进一步证明，增加量的含有EGFR同种型D的细胞外囊泡(EV)或外泌体以剂量依赖性方式增强细胞外囊泡(EV)或外泌体的敏化效应。最后，使用网格蛋白介导的内吞抑制剂PitStop 2示出了内吞作用在赋予同种型D敏化效应方面的必要性。

本文示例性描述的本发明可以在不存在本文未具体公开的任何一个元素或多个元素、一个或多个限制的情况下适当地实施。因此，例如，术语“包含”、“包括”、“含有”等应被广泛地理解而不受限制。此外，本文采用的术语和表达作为描述而非限制的术语使用，并且在使用此类术语和表达时无意排除所示和所述特征或其部分的任何等同物，但是应该认识到，在要求保护的本发明的范围内可以进行各种修改。因此，应当理解，虽然已经通过优选实施方案和可选特征具体公开了本发明，但是本领域技术人员可以对本文所公开的本发明进行修改和变化，并且此类修改和变化被认为在本发明的范围内。

如本申请所用，无数量词修饰的名词包括多个所指代的名词，除非上下文另有明确规定。例如，术语“遗传标志物”包括多个遗传标志物，包括其混合物和组合。

如本文所用，术语“约”在制剂的组分浓度的上下文中，通常是指所述值的+/-5％，更通常地所述值的+/-4％，更通常地所述值的+/-3％，更通常地所述值的+/-2％，甚至更通常地表示值的+/-1％，甚至更通常地所述值的+/-0.5％。

在本公开内容通篇，某些实施方案可以以范围格式公开。应当理解，范围格式的描述仅仅是为了方便和简洁，不应被解释为对所公开范围的硬性限制。因此，范围的描述应该被认为已经具体公开了所有可能的子范围以及该范围内的单个数值。例如，对如1至6的范围的描述应该被认为已经具体公开了各子范围，如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等，以及该范围内的单个数字，例如1、2、3、4、5和6。这适用于任何广度的范围。

某些实施方案也可以在本文中广泛地和通用地描述。落入通用属别公开的每个较窄的种类和亚属分组也构成本公开的一部分。这包括对实施方案的通用属别描述，带有从该属别中删除任何主题的附带条件或负面限制，无论本文是否具体列举了所删减的材料。

已在本文对本发明进行了广泛和通用的描述。落入通用属别公开的每个较窄的种类和亚属分组也构成本发明的一部分。这包括对本发明的通用属别描述，带有从该属别中删除任何主题的附带条件或负面限制，无论本文是否具体列举了所删减的材料。

其他实施方案在以下权利要求和非限制性实例内。此外，在根据马库什组描述本发明的特征或方面的情况下，本领域技术人员将认识到本发明因此也根据马库什组的任何个体成员或成员亚组来描述。

实验部分

除HEK 293T细胞外，本文公开的实验是使用应用于未经修饰的患者来源的肿瘤培养物或细胞系的外泌体进行的。这些患者来源的肿瘤培养物或细胞系的身份已经通过将它们与它们所来自的个体患者肿瘤进行匹配而得到验证，从而确认其来源(Chia等，2017)。这些细胞系不是商业的、永生化的，也不是经修饰的。

细胞外囊泡(EV)

如前所述进行细胞外囊泡(EV)收集和分离*。简言之，使细胞在带有调节培养基(NCM)的T-175组织培养瓶中生长。孵育72小时后，收集NCM并以1,200rpm旋转10分钟以去除细胞碎片。然后将上清液通过0.22μm过滤器(PES)过滤，并将滤液装入

*参考文献：Rodrigues-Junior,D.M.等人，Circulating extracellularvesicle-associated TGFβ3modulates response to cytotoxic therapy in head andneck squamous cell carcinoma，Carcinogenesis，1-13(2019).doi：10.1093/carcin/bgz148

细胞增殖测定和IC

将细胞以1,000-3,000个细胞/孔的密度接种在96孔组织培养板中的100μl完全生长培养基中。在处理之前用1x PBS洗涤细胞以去除剩余的培养基残留物。在完全生长培养基中连续稀释EGFR酪氨酸激酶抑制剂(TKI)后，将相应比例的含细胞外囊泡的培养基添加到细胞中作为共处理。使用的EGFR酪氨酸激酶抑制剂(TKI)是吉非替尼、厄洛替尼、阿法替尼、拉帕替尼、达克替尼、那扎替尼、WZ4002或奥希替尼(Selleck化工，德克萨斯州休斯顿)，而二甲基亚砜(DMSO)用作对照。将板在37℃下孵育72小时，然后根据制造商的方案(Promega，威斯康星州麦迪逊)使用CellTitre-

RNA分析

根据制造商的说明，使用Qiagen RNeasy迷你试剂盒(Qiagen，加利福尼亚州瓦伦西亚)提取总mRNA。根据制造商的说明，使用SuperScript II(Thermo Fisher Scientific，马萨诸塞州沃尔瑟姆)将mRNA转化为cDNA，并根据制造商的说明，使用iTaq UniversalSYBR Green Supermix(Bio-Rad实验室，Hercules，加利福尼亚州)实时PCR试剂进行定量。如前所述，反应一式三份进行，TBP作为归一化对照。

蛋白质分析

对于蛋白质印迹分析，将细胞沉淀或细胞外囊泡(EV)样品在RIPA缓冲液(1％Triton X-100，0.5％脱氧胆酸钠，0.1％SDS，1x PBS)中裂解，通过以14,000g离心30分钟澄清，并根据制造商的说明通过Pierce BCA蛋白质测定试剂盒(Thermo Fisher Scientific，马萨诸塞州沃尔瑟姆)对蛋白质进行定量。将等量的蛋白质上样到SDS-PAGE凝胶的每个泳道中(Bio-Rad实验室，Hercules，加利福尼亚州)。使用的抗体如前所述*，添加了CD9(#13174，Cell Signaling，马萨诸塞州丹弗斯)，EpCAM(#2626，Cell Signaling)和ALIX(#2171，Cell Signaling)。

shRNA敲低和RNA转染

含有以下质粒pLKO.1载体的shRNA慢病毒颗粒购自Sigma(密苏里州圣路易斯)：pLKO.1-shIsoD_A：TTGCTGAGTGAATGAACAAAT(SEQ ID NO：1)、pLKO.1-shIsoD_B：AGCCAGCTGTGGGACAATTAT(SEQ ID NO：2)和pLKO.1-shIsoD_C：GCCAGCCTTCTCCGTAATTAG(SEQID NO：3)。通过pLKO.1-shIsoD_A颗粒感染产生EGFR同种型D敲低细胞shIsoD_1；根据制造商的说明，通过与pLKO.1-shIsoD_B和pLKO.1-shIsoD_C颗粒共感染产生shIsoD_2细胞。

EGFR同种型D的过表达

用以下引物将EGFR同种型D开放阅读框(NM_201284)PCR克隆到经修饰的pCSC-SP-PW(也称为pBOB，Addgene)的NheI和XhoI位点中：GGATCCATTGGCTAGCATGCGACCCTCCGGGACG(SEQ ID NO：4)和CCTGCAGCTGCTCGAGTCAGTGGCAGGAGGAGGCC(SEQ ID NO：5)。根据制造商的说明，将构建体与ViraPower慢病毒表达系统(Invitrogen)共转染到HEK 293T细胞中，以产生慢病毒颗粒。按照制造商的说明转导NCC-HN1和HEK293T，并使用0.2μg/ml博莱霉素选择稳定的细胞。

细菌EGFR同种型D的生产

用以下引物将EGFR同种型D开放阅读框(NM_201284)PCR克隆到pet15b(Merck)的NdeI和XhoI位点中：CGCGCGGCAGCCATATGATGCGACCCTCCGGGACG(SEQ ID NO：6)和CAGCCGGATCCTCGAGTCAGTGGCAGGAGGAGGCC(SEQ ID NO：7)。根据制造商的说明，将构建体转化到BL21DE3细胞中(Invitrogen)。用1μM IPTG诱导EGFR同种型D蛋白，并用裂解缓冲液(50mMTris.HCl pH7.4，150mM NaCl，5mM βME，0.1％Triton X-100，10％甘油)收获。将含有EGFR同种型D的细菌裂解物用HisPur Ni-NTA色谱柱(ThermoFisher)亲和纯化，并用缓冲液A(50mM Tris.HCl pH7.4，150mM NaCl，5mM βME，0.1％Triton X-100，10％甘油，10mM咪唑)、缓冲液B(50mM Tris.HCl pH7.4，1M NaCl，5mM βME，0.1％Triton X-100，10％甘油)、并再次用缓冲液A顺序洗涤。将EGFR同种型D蛋白在洗脱缓冲液(50mM Tris.HCl pH 7.4，150mMNaCl，5mM βME，0.1％Triton X-100，10％甘油，250mM咪唑)中洗脱。将蛋白质印迹验证的EGFR同种型D级分用

蛋白酶K消化

在存在或不存在1％v/v Triton X-100的情况下，在37℃下对70μg分离的外泌体进行1μg/ml蛋白酶K处理指定时间(见图13)。在指定时间到期后，添加2x Laemmeli上样缓冲液(Bio-rad)以停止蛋白酶K活性。随后通过蛋白质印迹分析样品。

序列表

<110>新加坡保健服务集团有限公司

<120>调节对酪氨酸激酶抑制剂敏感性的方法

<130>72760PCT

<160>7

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列（Artificial sequence）

<220>

<223>pLKO.1-shIsoD_A

<400>1

ttgctgagtg aatgaacaaa t21

<210>2

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>pLKO.1-shIsoD_B

<400>2

agccagctgt gggacaatta t21

<210>3

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>pLKO.1-shIsoD_C

<400>3

gccagccttc tccgtaatta g21

<210>4

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>EGFR同种型D开放阅读框克隆引物1, 用于克隆进修饰的pCSC-SP-PW

<400>4

ggatccattg gctagcatgc gaccctccgg gacg34

<210>5

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>EGFR同种型D开放阅读框克隆引物2, 用于克隆进修饰的pCSC-SP-PW

<400>5

cctgcagctg ctcgagtcag tggcaggagg aggcc 35

<210>6

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>EGFR同种型D开放阅读框克隆引物 1, 用于克隆进pet15b

<400>6

cgcgcggcag ccatatgatg cgaccctccg ggacg 35

<210>7

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>EGFR同种型D开放阅读框克隆引物 2，用于克隆进pet15b

<400>7

cagccggatc ctcgagtcag tggcaggagg aggcc 35