卵形鼠孢菌-纳米半导体杂化体系、及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物固碳领域，具体涉及一种卵形鼠孢菌-纳米半导体杂化体系、及其制备方法和应用。

背景技术

鉴于日益严重的温室效应和对可再生能源的迫切需球，亟需开发和利用可再生能源将CO

在生物电合成过程中通常需要额外的光伏器件将光能转换为电能以驱动二氧化碳固定，这限制了整体能量转换效率。鉴于此，常用技术将纳米半导体材料直接整合到电自养菌表面构建杂化体系，在光激发下实现光电子向电自养菌的直接转移，降低了原有体系在光电转化过程中所带来的能量损耗，有效提升整个过程中的能量转换效率。这种生物杂化物还可以结合无机半导体的高效光吸收能力和生物催化剂的高特异性催化能力，从而超突破单一化学或生物途径的性能。然而，成功培养这些微生物并保持其在基于半导体的生物混合系统中的稳定性基本上通常需要严苛的培养环境，这严重限制了它们的经济可行性和实际应用的适用性。

除此之外，受制于微生物的生理特性，微生物的固碳转化率难以实现越阶式提升，这进一步限制了光电体系的发展。

发明内容

旨在解决上述常用技术难以兼顾微生物培养的环境普适性以及优异的固碳转化率的技术问题，本发明提供了一种卵形鼠孢菌-纳米半导体杂化体系的制备方法，包括步骤：

在无菌厌氧条件下，将卵形鼠孢菌接种至厌氧培养基进行厌氧培养，直至所述厌氧培养基中卵形鼠孢菌菌液的吸光度达到OD

将纳米半导体材料加入所述卵形鼠孢菌菌液中进行复合处理，得卵形鼠孢菌复合体系；其中，所述纳米半导体材料在所述卵形鼠孢菌菌液中的浓度为0.1～1.0mM；

将所述卵形鼠孢菌复合体系离心，分离沉淀，并将所述沉淀接种至光养培养基中；

向所述沉淀中加入空穴牺牲剂，得所述卵形鼠孢菌-纳米半导体杂化体系。

进一步的，所述厌氧培养的温度为25～35℃，所述厌氧培养的时间为45～50h。

进一步的，所述纳米半导体材料包括硫化镉纳米材料和/或硫化锌纳米材料。

进一步的，所述复合处理包括：将加入了所述纳米半导体材料的所述卵形鼠孢菌菌液置于黑暗环境中，于25～35℃温度下培养6～8h。

进一步的，所述空穴牺牲剂包括L-半胱氨酸。

进一步的，所述空穴牺牲剂的浓度为0.2～0.4wt％，所述空穴牺牲剂在所述卵形鼠孢菌-纳米半导体杂化体系中的质量分数为0.01～0.1％。

本发明还提供了一种卵形鼠孢菌-纳米半导体杂化体系，由如上任意所述的制备方法制备得到。

进一步的，所述卵形鼠孢菌表面分布有粒径为20～50nm的球形纳米半导体颗粒。

本发明还提供了一种如上任意所述的卵形鼠孢菌-纳米半导体杂化体系在固碳中的应用。

进一步的，所述卵形鼠孢菌-纳米半导体杂化体系在固碳中的应用在光照条件下进行。

与现有技术相比，本发明至少包括以下优点：

本发明构建了卵形鼠孢菌-纳米半导体材料杂化体系，包括纳米半导体材料和卵形鼠孢菌：将纳米半导体材料整合到电自养菌卵形鼠孢菌表面，不需要再添加额外的电能或光伏器件将光能转换为电能以驱动二氧化碳固定，有效提高了整体的能量转换效率。其中，光电固碳的原理在于：在可见光照射下，杂化体系中的纳米半导体材料被激发产生光电子和空穴对。光电子传递给卵形鼠孢菌作为还原力进行固碳，将二氧化碳转化为具有高利用价值的多碳产物——乙酸。

本发明独创性地将卵形鼠孢菌应用于生物电合成体系中，而卵形鼠孢菌兼具优异的电子接受率、产物选择性。其中，优异的产物选择性使得卵形鼠孢菌能够将碳源专一导向高附加价值的乙酸；高电子接受率使得卵形鼠孢菌能够及时有效接受来自纳米半导体材料的光生电子，减少光生电子在运输过程中的损耗，有效地提升了乙酸的生产效率。

除此之外卵形鼠孢菌还有两个效益显著的特性。一方面，卵形鼠孢菌利用WL途径固碳，有效保证了胞内高效的催化效率，进一步提升了卵形鼠孢菌的固碳能力；另一方面，卵形鼠孢菌的适宜培养温度为30℃，保证了卵形鼠孢菌在常规培养环境中的存活、繁殖效率，进一步保证了卵形鼠孢菌-纳米半导体材料杂化体系的构建与应用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图示出的结构获得其他的附图。

图1为本申请实施例1中制备得到的卵形鼠孢菌-硫化镉杂化体系的扫描电子显微镜(SEM)图；

图2为本申请实施例1和实施例3中分别制备得到的卵形鼠孢菌-硫化镉杂化体系和卵形鼠孢菌-硫化锌杂化体系在光照3天后卵形鼠孢菌胞内ATP含量对比图；

图3为本申请实施例1中制备得到的卵形鼠孢菌-硫化镉杂化体系光驱动固碳产乙酸性能图；

图4为本申请实施例1中制备得到的卵形鼠孢菌-硫化镉杂化体系的卵形鼠孢菌活性变化图；

图5为本申请实施例1和实施例3中制备得到的卵形鼠孢菌-硫化镉杂化体系和卵形鼠孢菌-硫化锌杂化体系的光电流响应图；

图6为本申请实施例2中，不同硫化镉纳米颗粒添加量对卵形鼠孢菌-硫化镉杂化体系光驱动固碳产乙酸性能影响的对比图；

图7为本申请实施例3中制备得到的卵形鼠孢菌-硫化锌杂化体系的扫描电子显微镜(SEM)图；

图8为本申请实施例3中，制备得到的卵形鼠孢菌-硫化锌杂化体系光驱动固碳产乙酸性能图。

其中，“Gurrent(μA)”为电流，“Time(s)为时间”，“Accumulated Acetate(mM)”为光驱动杂化体系还原二氧化碳产乙酸的最终累积量。

具体实施方式

下面将结合附图对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式仅仅是本发明的一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。

并且，本发明各个实施方式之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

本发明提供了一种卵形鼠孢菌-纳米半导体杂化体系的制备方法，包括步骤：

S1.在无菌厌氧条件下，将卵形鼠孢菌接种至厌氧培养基进行厌氧培养，直至所述厌氧培养基中卵形鼠孢菌菌液的吸光度达到OD

在一些实施例中，厌氧培养的温度为25～35℃，所述厌氧培养的时间为45～50h。

优选的，可以将接种了卵形鼠孢菌的厌氧培养基置于厌氧培养箱中培养。

在另一些实施例中，厌氧培养基可以在被接种前进行除氧，具体可以包括步骤：将厌氧培养基煮沸5～8min后，通过氮气/二氧化碳体积比为60～90:40～10的混合气曝气30～40min。

优选的，卵形鼠孢菌与厌氧培养基的体积比可以为5～15％。

S2.将纳米半导体材料加入所述卵形鼠孢菌菌液中进行复合处理，得卵形鼠孢菌复合体系；其中，所述纳米半导体材料在所述卵形鼠孢菌菌液中的浓度为0.1～1.0mM。

示例性的，所述纳米半导体材料包括硫化镉纳米材料和/或硫化锌纳米材料。

在一些实施例中，复合处理包括：将加入了所述纳米半导体材料的所述卵形鼠孢菌菌液置于黑暗环境中，于25～35℃温度下培养6～8h，得所述卵形鼠孢菌-纳米半导体杂化体系。

优选的，上述复合处理可以在80～120rpm搅拌条件下进行。

其中，将纳米半导材料加入卵形鼠孢菌菌液的步骤可以包括：将纳米半导材料加入除氧无菌水中，超声30min使得纳米半导材料充分分散，并将分散完毕的纳米半导材料打入卵形鼠孢菌菌液中。

S3.将所述卵形鼠孢菌复合体系离心，分离沉淀，并将所述沉淀接种至光养培养基中。

在一些实施例中，离心过程中的转速可以为5000～10000rpm，所述离心处理的时长为5～10min。卵形鼠孢菌-纳米半导体杂化体系离心得到的沉淀即为半导体材料与卵形鼠孢菌的复合物。

优选的，可以将卵形鼠孢菌复合体系离心过后得到的沉淀洗涤，具体可以利用除氧灭菌水洗涤沉淀2次以上。

在另一些实施例中，光养培养基可以包括以下成分：7.6～8.4g/L的NaCl，0.40～0.55g/L的KCl，0.3～0.5g/L的NH

所述微量元素溶液包括：0.08～0.12g/L的ZnSO

所述维生素溶液包括：1.5～2.5mg/L的生物素，1.5～2.5mg/L的叶酸，9.0～11.0mg/L的吡哆醇盐酸盐，4.5～5.5mg/L的硫胺素盐酸盐，4.5～5.5mg/L的核黄素，4.5～5.5mg/L的烟酸，4.5～5.5mg/L的D-(+)-泛酸钙，0.08～0.13mg/L的维生素B12，4.5～5.5mg/L的p-氨基苯甲酸，4.5～5.5mg/L的硫辛酸。

S4.向所述沉淀中加入空穴牺牲剂，得所述卵形鼠孢菌-纳米半导体杂化体系。

在一些实施例中，空穴牺牲剂可以包括L-半胱氨酸，空穴牺牲剂的浓度可以为0.25％，所述空穴牺牲剂在所述卵形鼠孢菌-纳米半导体杂化体系中的质量浓度为0.01～0.1％。

需要说明的是，卵形鼠孢菌-纳米半导体杂化体系可以包括沉淀、空穴牺牲剂以及光养培养基。

本发明构建了卵形鼠孢菌-纳米半导体材料杂化体系，包括纳米半导体材料和卵形鼠孢菌：将纳米半导体材料整合到电自养菌卵形鼠孢菌表面，不需要再添加额外的电能或光伏器件将光能转换为电能以驱动二氧化碳固定，这有效提高了整体的能量转换效率。其中，光电固碳的原理在于：在可见光照射下，杂化体系中的纳米半导体材料被激发产生光电子和空穴对。光电子传递给卵形鼠孢菌作为还原力进行固碳，将二氧化碳转化为具有高利用价值的含碳有机物——乙酸。

本发明独创性地将卵形鼠孢菌应用于生物电合成体系中，而卵形鼠孢菌兼具优异的电子接受率、产物选择性。其中，优异的产物选择性使得卵形鼠孢菌能够将碳源专一导向高附加价值的乙酸；高电子接受率使得卵形鼠孢菌能够及时有效接受来自纳米半导体材料的光生电子，减少光生电子在运输过程中的损耗，有效地提升了乙酸的生产效率。

除此之外卵形鼠孢菌还有两个效益显著的特性。一方面，卵形鼠孢菌利用WL途径固碳，有效保证了胞内高效的催化效率，进一步提升了卵形鼠孢菌的固碳能力；另一方面，卵形鼠孢菌的适宜培养温度为30℃，保证了卵形鼠孢菌在常规培养环境中的存活、繁殖效率，进一步保证了卵形鼠孢菌-纳米半导体材料杂化体系的构建与应用。

本发明还提供了一种卵形鼠孢菌-纳米半导体杂化体系，由如上任意所述的制备方法制备得到。

具体的，所述卵形鼠孢菌表面分布有粒径为20～50nm的球形纳米半导体颗粒。

本发明还提供了一种上任意一项所述的卵形鼠孢菌-纳米半导体杂化体系在固碳中的应用。

本领域技术人员需要知晓的是，固碳是指增加除大气之外的碳库碳含量的措施。主要包括物理固碳和生物固碳。本申请侧重于生物固碳，指将无机碳即大气中的二氧化碳转化为有机含碳化合物。

优选的，卵形鼠孢菌-纳米半导体杂化体系在固碳中的应用在光照条件下进行。

为了便于本领域技术人员对本发明做进一步理解，现举例说明：

需要说明的是，下述卵形鼠孢菌Sporomusa ovata购自宁波明舟生物，编号为DSM-2662。

下述光敏剂即纳米半导体材料，为硫化镉纳米材料或者硫化锌纳米材料。

实施例1

一种纳米半导体颗粒驱动电自养菌卵形鼠孢菌固碳的方法，包括：

(1)在无菌厌氧条件下，将卵形鼠孢菌(Sporomusa ovata ATCC 35899)以10％体积比接入除氧有机培养基中，于厌氧培养箱在30℃静置培养48h至OD

(2)称取定量硫化镉纳米颗粒溶入3mL除氧无菌水中，超声30min使光敏剂充分分散，用注射器将其打入菌液中(最终菌液中光敏剂浓度为0.5mM)，在转速100rpm下黑暗培养8h使光敏剂与微生物充分复合，得卵形鼠孢菌-硫化镉杂化体系，其扫描电子显微镜图如图1所示，可以看出卵形鼠孢菌表面均匀分布尺寸为20～50nm的超小球形纳米颗粒，卵形鼠孢菌-硫化镉杂化体系有效构建。

(4)将该卵形鼠孢菌-硫化镉杂化体系在厌氧条件下8000rpm离心6min。离心后用除氧无菌超纯水清洗2次，将沉淀物转接种到光养培养基中，添加1mL浓度为0.25％的L-半胱氨酸作为空穴牺牲剂，在光照条件下进行光驱动固碳产乙酸。

为了分析卵形鼠孢菌、光敏剂及光照在固碳过程的影响，还进行了对照组实验，包括：卵形鼠孢菌-硫化镉(黑暗)组，即不加光源，其他操作均相同；卵形鼠孢菌-硫化镉(灭活)组，即对卵形鼠孢菌-硫化镉杂化体系进行高温灭活处理，其他操作均相同；卵形鼠孢菌组，即不加光敏剂硫化镉，其他操作均相同；硫化镉组，即不加卵形鼠孢菌，其他操作均相同。

其中，由实施例1制备得到的卵形鼠孢菌-硫化镉杂化体系的ATP含量图如图2所示，相比卵形鼠孢菌和黑暗对照组，在光照情况下，卵形鼠孢菌-硫化镉杂化体系卵形鼠孢菌具有更高的ATP含量，产生足够的ATP用来来驱动CO

由实施例1制备得到的卵形鼠孢菌-硫化镉杂化体系的光驱动固碳产乙酸性能图如图3所示，硫化镉在光照下有效驱动卵形鼠孢菌固碳产乙酸，且其他四组对照组未发现明显的固碳产乙酸。

由实施例1制备得到的卵形鼠孢菌-硫化镉杂化体系的细胞活性图如图4所示，相比卵形鼠孢菌和黑暗对照组，在光照情况下，卵形鼠孢菌-硫化镉杂化体系卵形鼠孢菌实现固碳增殖，对照中在第一天过后就快速下降。

由实施例1制备得到的卵形鼠孢菌-硫化镉杂化体系的光电响应如图5所示，在光激发下卵形鼠孢菌-硫化镉杂化体系具有较高的光捕获能力和光生电子和空穴的分离效率，有效产生光电流。

所述厌氧培养基的配方如下：

所述光养培养基的配方如下：

实施例2

(1)在无菌厌氧条件下，将卵形鼠孢菌(Sporomusa ovata ATCC 35899)以10％体积比接入厌氧培养基中，于厌氧培养箱在30℃静置培养48h至OD

(2)称取定量硫化镉纳米颗粒溶入3mL除氧无菌水中，超声30min使光敏剂充分分散，用注射器将其打入菌液中(最终菌液中光敏剂浓度为0.5mM)，在转速100rpm下黑暗培养8h使光敏剂与微生物充分复合。

(4)厌氧条件下8000rpm离心6min。离心后用除氧无菌超纯水清洗2次，将沉淀物转接种到光养培养基中，添加1mL浓度为0.25％的L-半胱氨酸作为空穴牺牲剂，在光照条件下进行光驱动固碳产乙酸。

为了分析光敏剂硫化镉浓度对卵形鼠孢菌-硫化镉杂化体系的固碳性能的影响，还设置了4组对比实验，只是将硫化镉添加量分别换成了0.1mM、0.3mM、0.7mM和1.0mM(指加入卵形鼠孢菌菌液后的硫化镉浓度)，其他操作均相同。

实施例2中各组乙酸累计量如图6所示，卵形鼠孢菌-硫化镉杂化体系中随着光敏剂硫化镉的浓度增加，固碳性能先增强后减弱，其中以0.5mM硫化锌浓度最佳。

所述厌氧培养基的配方如下：

实施例3

(1)在无菌厌氧条件下，将卵形鼠孢菌(Sporomusa ovata ATCC 35899)以10％体积比接入除氧有机培养基中，于厌氧培养箱在30℃静置培养48h至OD

(2)称取定量硫化锌纳米颗粒溶入3mL除氧无菌水中，超声30min使光敏剂充分分散，用注射器将其打入菌液中(最终菌液中光敏剂浓度为0.5mM)，在转速100rpm下黑暗培养8h使光敏剂与微生物充分复合，得卵形鼠孢菌-硫化锌杂化体系。卵形鼠孢菌-硫化锌杂化体系得扫描电子显微镜图如图7所示，可以看出，卵形鼠孢菌表面均匀分布尺寸为20～50nm的超小球形纳米颗粒，杂化体系有效构建。

由实施例3制备得到的卵形鼠孢菌-硫化锌杂化体系的光电响应如图5所示，在光激发下卵形鼠孢菌-硫化锌杂化体系具有较高的光捕获能力和光生电子和空穴的分离效率，有效产生光电流。

(4)将卵形鼠孢菌-硫化锌杂化体系在厌氧条件下8000rpm离心6min。离心后用除氧无菌超纯水清洗2次，将沉淀物转接种到光养培养基中，添加1mL浓度为0.25％的L-半胱氨酸作为空穴牺牲剂，在光照条件下进行光驱动固碳产乙酸。

由实施例3中制备得到的卵形鼠孢菌-硫化锌杂化体系在光照3天后卵形鼠孢菌胞内ATP含量如图2所示。

由实施例3制备得到的卵形鼠孢菌-硫化锌杂化体系的光驱动固碳产乙酸性能图如图8所示，在光照下卵形鼠孢菌-硫化锌杂化体系实现固碳产乙酸。

所述有机培养基的配方如下：

所述有机培养基的配方如下：

对比例1

实施例1其他操作不变，仅将卵形鼠孢菌替换为热醋穆尔氏菌(购自北京北纳创联生物技术研究院，编号为ATCC 70050)，构建的热醋穆尔氏菌-硫化镉杂化体系还原二氧化碳产得乙酸累积量为2.0mM，量子效率为2.44±0.62％。

对比例2

实施例1其他操作不变，仅将卵形鼠孢菌替换为自产醇梭菌(购自北京北纳创联生物技术研究院，编号为ATCC 70050)，构建的热醋穆尔氏菌-硫化镉杂化体系还原二氧化碳产得乙酸累积量为12.1mM。

本发明的上述技术方案中，以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是在本发明的技术构思下，利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构变换，或直接/间接运用在其他相关的技术领域均包括在本发明的专利保护范围。