一种甘油激酶高密度发酵方法

技术领域

本申请涉及微生物发酵领域，具体而言，涉及一种甘油激酶高密度发酵方法。

背景技术

血清中甘油三脂的含量是临床上诊断心血管系统疾病的重要指标，目前测定甘油三脂试剂盒中最为关键的酶之一就是甘油激酶。用于酶联试剂盒的反应酶要求颇为严格，目前最好的生产方式就是基因工程技术改造大肠杆菌用于表达甘油激酶，尽管国内目前已有厂家着手于甘油激酶的研发，但是市场上真正能够替代国外产品用于试剂盒的甘油激酶却无大规模生产。可见其生产工艺尚未成熟，在保证酶的质量的前提下未能形成工业化生产规模。

目前国内用于临床诊断的甘油激酶绝大部分依赖于进口产品，尽管已有相关报道研究重组大肠杆菌生产甘油激酶蛋白，但是大规模工业化生产除了需要构建出高效稳定表达目的蛋白的工程菌外，大规模培养工程菌的技术和工艺也颇为重要。通过提高发酵过程中菌体密度以及目的蛋白的表达水平是工业化生产的关键。但是目前国内缺乏甘油激酶重组大肠杆菌高密度发酵技术和工艺的相关研究。

专利申请CN109207453A公开了一种甘油激酶的制备方法，此专利公布的甘油激酶制备方法为适用于大多数重组大肠杆菌高密度发酵的方法，无法确认为甘油激酶重组大肠杆菌高密度发酵生产的最优方案，尤其是配方和诱导表达条件无法确认是否能够达到工业化生产的高酶活产量。孟尧等(“高纯度诊断用重组甘油激酶的制备和鉴定”，《生物医学工程学杂志》，第30卷第2期，2013，p327-332)也公开了一种甘油激酶的制备方法，但是此方法获得的湿菌酶活产量较低，仅为300U/g，且每升发获得的酵液湿菌总量仅为18g。

发明内容

本发明提供了一种甘油激酶高密度发酵方法，包括如下步骤：当发酵罐内菌体密度达到OD

进一步的，发酵罐内的发酵培养基中包括甘油；发酵罐内的发酵培养基配方优选为：蛋白胨12g/L，酵母提取物24g/L，甘油6g/L，磷酸氢二钾12.5g/L，磷酸二氢钾2.43g/L，消泡剂0.5g/L。

进一步的，诱导剂为异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，诱导剂的添加量为0.5mM。

进一步的，通过流加氨水和/或乙酸调节控制pH。

进一步的，补料用培养基配方为蛋白胨25g/L，酵母提取物100g/L，甘油400g/L，消泡剂0.5g/L，补料量不超过发酵培养基体积的20％，补料速度为3-6ml/min。

进一步的，诱导10h后每隔1h或2h取样测定单位菌液酶活，当酶活达到峰值开始回落时即可停止诱导。

进一步的，菌体为重组甘油激酶工程菌。

进一步的，本发明的甘油激酶高密度发酵方法，包括如下步骤：

(1)将制备好的重组甘油激酶大肠杆菌甘油管从-88℃冰箱中取出，按8.5％-2％(体积百分数，下述涉及的接种量百分数也均为体积百分数)比例接种于添加有终浓度188μg/ml抗生素的LB培养基中，转速288-228rpm，33℃培养3-12h。

(2)将步骤(1)所获菌液按8.5％-2％的比例接种于添加有终浓度58-188μg/ml抗生素的LB培养基中，转速288-228rpm，33℃培养9-12h。

(3)将步骤(2)所获菌液按1％-15％比例接种至种子罐中进行发酵，发酵温度37℃，转速200-1200rpm，通气量3％-15％联动控制溶氧在20％-40％，初始pH在7.0-7.5，加入相应的抗生素终浓度为50-100μg/ml，发酵时间为6-8h。

(4)将步骤(3)所获菌液按1％-15％接种至发酵罐中发酵，发酵温度控制在33℃，转速288-488rpm，罐压8.3-1.8Kpa，通气量2L/min，初始pH控制在6.5-3.5，诱导前无需调控pH，溶氧反馈补料，总补料量不超过发酵液体积的28％，待菌液密度OD

本发明的有益效果包括：

本发明提供了一个切实可行的甘油激酶高密度发酵生产方法，本方法通过改进发酵罐培养基配方，尤其是在配方中添加了适量甘油，并配合特定的诱导方法和诱导条件，能够保障发酵生产稳定获得高产量的酶活。从而降低了生产成本，达到规模化生产要求。采用本发明的技术方案获得的湿菌的酶活产量较高，能够达到760U/g，每升发酵液湿菌总量能够达到68g，每升发酵液生产酶活产量均能达到50KU以上。

附图说明

图1为整个发酵过程的细菌生长曲线图；

图2为不同诱导时间点的SDS-PAGE电泳图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行进一步说明和描述，但所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明和实施例中，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他发明和实施例，都属于本发明保护的范围。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、一种甘油激酶高密度发酵方法

包括如下步骤：

(1)一级种子液制备：将制备好的重组甘油激酶大肠杆菌甘油管从-80℃冰箱中取出，按0.5％-2％(体积百分数，下述涉及的接种量百分数也均为体积百分数)比例接种，培养基为LB培养基，抗生素终浓度为100μg/ml，转速200-220rpm，37℃培养3-12h。

(2)二级种子液制备：将活化好的一级种子菌液按0.5％-2％的比例接种，培养基为LB培养基，抗生素终浓度为50-100μg/ml，转速200-220rpm，37℃培养9-12h。应严格控制二级种子培养温度与时间否则种子活性不够接种至大罐后无法生长。

(3)种子罐发酵：将制备的种子菌液按1％-15％比例接种至种子罐中进行发酵，发酵温度37℃，转速200-1200rpm，通气量3％-15％联动控制溶氧在20％-40％，初始pH在7.0-7.5，加入相应的抗生素终浓度为50-100μg/ml，发酵时间为6-8h。

(4)发酵罐发酵：种子发酵完成后，按接种比例1％-15％接种至发酵罐中进行下一步发酵，发酵温度控制在37℃，转速200-400rpm，罐压0.3-1.0Kpa，通气量2L/min，初始pH控制在6.5-7.5，诱导前无需调控pH，溶氧反馈补料(具体操作为：设定发酵罐的溶氧系数为30-40％，当溶氧系数大于50％时开始以6ml/min的补料速度开始补料)，总补料量不超过发酵液体积的20％，待菌液密度OD

其中，LB培养基配方为：酵母粉5g/L，胰蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L；种子罐和发酵罐培养基配方为：蛋白胨12g/L，酵母提取物24g/L，甘油6g/L，磷酸氢二钾12.5g/L，磷酸二氢钾2.43g/L，消泡剂0.5g/L；补料培养基配方为：蛋白胨25g/L，酵母提取物100g/L，甘油400g/L，消泡剂0.5g/L。所有培养基混合均匀后121℃高压灭菌20-25min，降至37℃或常温时加入相应抗生素至终浓度100μg/ml。

实施例2、一种甘油激酶高密度发酵方法

包括如下步骤：

(1)菌种活化：取出冻存于-80℃冰箱的25％甘油保存的菌种，划线接种于添加有终浓度100μg/ml氨苄抗生素的LB固体培养基中，37℃恒温培养12-15h。

LB固体培养基配方为：酵母提取物5g/L，胰蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，琼脂粉20g/L；121℃高压灭菌20min，待培养基温度降至45℃以下时加入终浓度为100μg/ml的氨苄抗生素混合均匀后倒入培养皿中，凝固后封存与4℃保存备用。

(2)一级种子：从划线后的平板上挑取生长良好的单菌落于培养管中，转速200-220rpm，37℃恒温培养4-12h。

培养基配方为酵母提取物5g/L，胰蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L；121℃高压灭菌20min，接种时添加终浓度100μg/ml氨苄抗生素。

(3)二级种子：将生长良好的一级种子按1％的比例接种至摇瓶中，转速200-220rpm，37℃恒温培养9-12h获得二级种子菌液。培养基配方与一级种子培养基配方相同。

(4)发酵罐发酵：将二级种子菌液按1％-15％比例的接种量接种至发酵罐中进行发酵，25L发酵罐装液18L，初始转速200-400rpm，温度37℃，pH 6.5-7.5，通气量2L/min，罐压0.3-1.0Kpa，溶氧反馈补加补料培养基补料量(具体操作为：设定发酵罐的溶氧系数为30-40％，当溶氧系数大于50％时开始以6ml/min的补料速度开始补料)；

发酵培养基配方：蛋白胨12g/L，酵母提取物24g/L，甘油6g/L，磷酸氢二钾12.5g/L，磷酸二氢钾2.43g/L，消泡剂0.5g/L；补料培养基配方为：蛋白胨25g/L，酵母提取物100g/L，甘油400g/L，消泡剂0.5g/L。

(5)诱导表达：待发酵罐内菌液密度OD

(6)取样与酶活检测样品制备：诱导表达5h后每隔5h取样一次菌体密度与酶活检测；每次取样5-10ml，取1ml菌液用1×PBS将其稀释至OD

①试剂配制：

A.甘油溶液：0.3M(现配现用)；

B.4-AA溶液：0.1％(100mg 4-氨基安替比林溶于100ml的dd H

C.苯酚溶液：0.1％(100mg苯酚溶于100ml的dd H

D.过氧化物酶溶液：20mg过氧化物酶(酶活单位110 purpurogllin unit/mg)溶于100ml ddH

E.G-3-POD溶液：20U/ml(溶于200mM的HEPES缓冲液中，pH＝7.9)；

F.缓冲液：200mM HEPES，pH＝7.9，含20mM的MgCl

G.20mM的磷酸钾缓冲液，pH7.5(用20mM的磷酸二氢钾与磷酸氢二钾混合调pH)。

备注：配置500mM的HEPES缓冲液，调节pH时注意采用浓度为1M的NaOH溶液。

②酶活测定实验步骤：

1.取前述①中配制的溶液B10ml、C 20ml、D 20ml、E 40ml、F10ml混于棕色的瓶中得工作溶液，冰上保存。

2.取3ml工作溶液于比色皿中(d＝1cm)。

3.加入0.1ml酶溶液，轻轻倒转混匀，37℃平衡约5min。

4.加入0.05ml甘油溶液并轻轻倒转混匀。

5.在温度为37℃的分光光度计上记录500nm处的吸光度，用水作对照，反应3-5min，并从反应开始记录前5min内每分钟△OD。用加入酶稀释剂代替酶，用同样的方法测量空白(△OD blank)。备注：用酶稀释剂稀释酶，并且在测定前立即用酶稀释剂稀释至0.2-0.4U/ml。

酶活计算：将上述条件下每一分钟形成一为摩尔过氧化氢所需要的酶量定义为一个酶活力单位(U)。按以下公式计算酶活：

其中：Vt：总量(3.15ml)；Vs：样品量(0.1ml)；13.3：测定条件下醌亚胺染料的毫摩尔消光系数(cm

酶活测定结果如表1所示，表1中“未诱导”是指添加异丙基硫代半乳糖苷之前的发酵液所制备的粗酶液。从表1中可以看出，本实施例中诱导10h的菌体密度OD

表1.不同诱导时间点的菌体密度与取样测定的单位酶活数据

本实施例中整个发酵过程的细菌生长曲线如图1所示，从图1中可以看出，细菌的整体生长状况在诱导后的10-20h内为其最佳状态，在诱导20h以后发酵罐内的细菌整体密度开始下降。

本实施例中不同诱导时间点的SDS-PAGE电泳图如图2所示，其中，0h代表未诱导样品，从图2中可以看出，不同诱导时间的样品均可在粗酶液的上清中观察到明显的目的蛋白条带，而未诱导的样品无论是在上清还是沉淀中均无明显的目的蛋白条带。