一种鉴定美丽硬仆骨舌鱼亲子关系的微卫星标记方法

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种鉴定美丽硬仆骨舌鱼亲子关系的微卫星标记方法。

背景技术

美丽硬仆骨舌鱼(Scleropages formosus)俗称“亚洲龙鱼”，隶属于骨舌鱼目(Osteoglossiformes)、骨舌鱼科(Osteoglossidae)。有金龙鱼(Gold Arowana)、红龙鱼(Red Arowana)和青龙鱼(Green Arowana)三个自然群体。

因珍稀名贵被誉为“观赏鱼之王”。在其原产地东南亚地区，深受民众喜爱，由于“龙文化”等因素，被当地华人称为“龙鱼”。因在观赏鱼市场上需求急剧增长而导致的过渡捕捞使其濒临绝种，被列入《濒危野生动植物种国际贸易公约》(CITES，简称华盛顿公约)附录I，成为国际一级保护鱼类。目前注册渔场进行人工繁殖时尚不能实现一对一繁殖，主要是通过模拟自然环境条件，根据池塘面积投放数十尾亲鱼进行群体繁殖。产卵后雄鱼会将卵含在口中孵化，可由其颊部明显突出下垂加以判断，3-4周后将含卵雄鱼捞出，从雄鱼口中取出仔鱼。由于这种繁殖特征无法确定仔鱼的母本。若检查不及时，雄鱼已将仔鱼吐出，则在池塘内收集到的仔鱼双亲均不能确定。无法确定子代的亲本来源，会导致养殖群体的系谱混乱。因此，在不影响鱼体生长的情况下寻找到一种准确鉴定亲子关系的方法，将有效提高美丽硬仆骨舌鱼人工繁殖效率，促进种质资源的保护及合理性开发。

文献“美丽硬仆骨舌鱼全基因组微卫星分布规律特征，CNKI:SUN:ZNTB.0.2019-23-025”及“应用微卫星多态分析美丽硬仆骨舌鱼三个品系遗传结构，第十二届中国科协年会论文集，2010-11-01”公开了美丽硬仆骨舌鱼的微卫星分布规律特征及遗传结构，但如何利用上述特征并建立合适、准确的方法对美丽硬仆骨舌鱼的亲子关系进行鉴定的技术却鲜有报道。

发明内容

针对以上现有技术存在的缺点和不足之处，本发明的首要目的在于提供一种鉴定美丽硬仆骨舌鱼亲子关系的微卫星标记方法。本发明方法利用10对特异性微卫星引物对美丽硬仆骨舌鱼的亲子关系进行鉴定，具有多态性高、累计排除率高的优点。

本发明目的通过以下技术方案实现：

一种鉴定美丽硬仆骨舌鱼亲子关系的微卫星标记方法，包括如下步骤：

(1)采集美丽硬仆骨舌鱼子代及候选亲本的DNA；

(2)以步骤(1)所取DNA为模板，采用如下SF-1～10共10对微卫星标记引物分别进行PCR扩增，对PCR扩增产物进行检测分析，计算10对微卫星标记的累计排除率，完成亲本与子代的亲子关系鉴定；

所述10对微卫星标记引物序列分别如下：

SF-1：

F:TCTCTGAGCTGAAACGACCG(SEQ ID NO:1)；

R:TAAATATGTGTGTGCGCGCG(SEQ ID NO:2)；

SF-2：

F:GCAGAGAGCCAGGAAGTGAG(SEQ ID NO:3)；

R:GTTGCACCATGGTCTCCAGA(SEQ ID NO:4)；

SF-3：

F:TGCAAAGAAGGAGGTGGGAC(SEQ ID NO:5)；

R:GCAACAACCATGGGCTTTCC(SEQ ID NO:6)；

SF-4：

F:GGAGCCATCACCTTTGTGGA(SEQ ID NO:7)；

R:AGGTCCATCCCCTATTGCCT(SEQ ID NO:8)；

SF-5：

F:ACCTCCTCCATTAGTGGCCT(SEQ ID NO:9)；

R:AGGTTGTACAAGGTGGAGCG(SEQ ID NO:10)；

SF-6：

F:TGTGCTGGGAGGCATGAATT(SEQ ID NO:11)；

R:TGGTTGTTGTCCTGTGGCTT(SEQ ID NO:12)；

SF-7：

F:GAGTAGGGTTGCGCTGAACT(SEQ ID NO:13)；

R:CCCTGTGTCTGTGTGGGTTT(SEQ ID NO:14)；

SF-8：

F:CGCCATTTAACCAGCATGCA(SEQ ID NO:15)；

R:TCAACTGGTGTTCCACAGGG(SEQ ID NO:16)；

SF-9：

F:ATGTGCGCTTTCAGGGATCA(SEQ ID NO:17)；

R:TGCAGCCGTTTCAGATACCA(SEQ ID NO:18)；

SF-10：

F:CCGTTGGAGGGAAGTGTCAT(SEQ ID NO:19)；

R:TGTTCATTGACTGCGGGAGG(SEQ ID NO:20)。

进一步地，步骤(1)中采集DNA的步骤为：取美丽硬仆骨舌鱼子代及候选亲本的臀鳍组织，用DNA提取试剂盒提取基因组DNA。

进一步地，步骤(2)中所述PCR扩增的反应体系包括：

10×Buffer 2.5μL；

Mg

dNTPs，各2mmol/L，1μL；

上下游引物，10μmol/L，各1μL；

模版DNA，50ng/μL，1μL；

Taq DNA聚合酶，1U；

ddH

进一步地，步骤(2)中所述PCR扩增的反应程序如下：

首先94℃预变性3min；然后94℃变性30s，56～60℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环；最后72℃延伸10min。

进一步地，步骤(2)中所述对PCR扩增产物进行检测分析是指将PCR扩增产物通过QIAGEN核酸蛋白分析系统检测，用QIAxcel ScreenGel 1.4.0软件进行数据采集，用CERVUSVersion 3.0进行分析。

进一步地，所述QIAGEN核酸蛋白分析系统检测的检测卡夹为QIAxcel DNA HighResolution kit，标记大小为25～500bp，线向标为15～600bp。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

(1)本发明方法利用10对特异性微卫星引物对美丽硬仆骨舌鱼的亲子关系进行鉴定，具有多态性高、累计排除率高的优点。

(2)本发明鉴定方法准确，不影响鱼体生长，能有效提高美丽硬仆骨舌鱼人工繁殖效率，促进种质资源的保护及合理性开发。

附图说明

图1为实施例2中QIAGEN核酸蛋白分析系统检测结果图；

图2为实施例2中QIAxcel ScreenGel 1.4.0软件数据采集结果图；

图3为实施例2中CERVUS Version 3.0分析结果图；

图4为实施例3中CERVUS Version 3.0分析结果图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

以下实施例中编号为F2-1，F2-2、F2-3和F2-4家系是2009年引进美丽硬仆骨舌鱼亲本群体自繁所得的4个F2代家系。

实施例1

本实施例选用46对特异微卫星引物(通过美丽硬仆骨舌鱼全基因组测序结果筛选微卫星位点，从中随机选取46个设计特异性引物，如表1所示)进行PCR反应，筛选出多态性较高的10对特异微卫星引物，具体步骤如下：

(1)采集亲鱼群体(2009年引进亲鱼60尾)的鳍条，采用Omega基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA。

(2)用步骤(1)的基因组DNA为模板，所选择的46对微卫星引物进行PCR扩增。

(3)对步骤(2)的PCR扩增产物通过QIAGEN核酸蛋白分析系统检测。

(4)将步骤(3)的检测结果利用QIAxcel ScreenGel 1.4.0软件进行数据采集，用遗传分析软件进行分析。计算每个微卫星标记的排除率(见表1)。按照排除率的高低，挑选排序前10位的微卫星标记(见表2)。

表1. 46对特异微卫星引物序列

表2. 10个微卫星标记的排除率

实施例2

本实施例采用实施例1中筛选的10对特异性微卫星引物对实际美丽硬仆骨舌鱼样本的亲子关系进行鉴定。具体步骤为：

美丽硬仆骨舌鱼子代共46尾，候选亲本30尾(其中F2-1共18尾，父本编号A186，ID号201308172336，候选母本30尾；F2-2共28尾，父本编号A91，ID号201405052465，候选母本30尾)，从中国水产科学研究院珠江水产研究所采得。采集每尾鱼的臀鳍组织，用Omega基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA。以所取基因组DNA为模板，用实施例1筛选出的排除率前10位的微卫星标记引物SF-1～10分别进行PCR扩增，PCR反应总体积为25μL，包括：10×Buffer 2.5μL、Mg

表3. 2个家系的亲子鉴定结果

通过以上结果可以看出，采用本发明方法的鉴定结果与实际情况完全相符，能准确鉴定美丽硬仆骨舌鱼的亲子关系。

实施例3

本实施例采用实施例1中筛选的10对特异性微卫星引物对实际美丽硬仆骨舌鱼样本的亲子关系进行鉴定。具体步骤为：

美丽硬仆骨舌鱼子代共80尾，候选亲本33尾(其中F2-3共41尾，父本编号A186，ID号201308172336，候选母本30尾；F2-4共39尾，父本编号A177，ID号201405052465，候选母本30尾)，从中国水产科学研究院珠江水产研究所采得。采集每尾鱼的臀鳍组织，用Omega基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA。以所取基因组DNA为模板，用实施例1筛选出的排除率前10位的微卫星标记分别进行PCR扩增，PCR反应总体积为25μL，包括：10×Buffer 2.5μL、Mg

表4. 2个家系的亲子鉴定结果

通过以上结果可以看出，采用本发明方法的鉴定结果与实际情况完全相符，能准确鉴定美丽硬仆骨舌鱼的亲子关系。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 中国水产科学研究院珠江水产研究所

<120> 一种鉴定美丽硬仆骨舌鱼亲子关系的微卫星标记方法

<130> 2021-3-25

<160> 92

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 1

tctctgagct gaaacgaccg 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

taaatatgtg tgtgcgcgcg 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

gcagagagcc aggaagtgag 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

gttgcaccat ggtctccaga 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 5

tgcaaagaag gaggtgggac 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 6

gcaacaacca tgggctttcc 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 7

ggagccatca cctttgtgga 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 8

aggtccatcc cctattgcct 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 9

acctcctcca ttagtggcct 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 10

aggttgtaca aggtggagcg 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 11

tgtgctggga ggcatgaatt 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 12

tggttgttgt cctgtggctt 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 13

gagtagggtt gcgctgaact 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 14

ccctgtgtct gtgtgggttt 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 15

cgccatttaa ccagcatgca 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 16

tcaactggtg ttccacaggg 20

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 17

atgtgcgctt tcagggatca 20

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 18

tgcagccgtt tcagatacca 20

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 19

ccgttggagg gaagtgtcat 20

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 20

tgttcattga ctgcgggagg 20

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 21

gtcacatggc ctcaaggtga 20

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 22

ccaaagtctt tgcttccggc 20

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 23

cctcgcaaaa acagtctggc 20

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 24

gttcgagaag gccgagttca 20

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 25

actccagtca tttccccgtc 20

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 26

tgctgatgag agtgtgctcc 20

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 27

gcacgtttcc actggaacac 20

<210> 28

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 28

ggagaaggag cgacacaa 18

<210> 29

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 29

caagagaagg gagtgagagg a 21

<210> 30

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 30

aatggggcca ttcaacctgt 20

<210> 31

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 31

acgacctcct ttgctctcaa 20

<210> 32

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 32

gtgttactgg gtaggctccg 20

<210> 33

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 33

gccttctacc ccatccttcc 20

<210> 34

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 34

gggtcctgtt gttgtctgca 20

<210> 35

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 35

agacacgctg ttcaggttcc 20

<210> 36

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 36

cttccgcatt ggggtcagat 20

<210> 37

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 37

gcttcggctg cttgtctttt 20

<210> 38

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 38

acacagctgc aaaggtgagt 20

<210> 39

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 39

atccagttca gcctgtgtgg 20

<210> 40

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 40

ggatgcttgc ccaacacatg 20

<210> 41

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 41

tgggacgtca gtgttgtagc 20

<210> 42

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 42

tgcgctaact ttcctgcaga 20

<210> 43

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

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ggaattccca cacaggagca 20

<210> 44

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<212> DNA

<213> 人工序列()

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acattggctc tcactgcgaa 20

<210> 45

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 45

tacgctacag aaacgagccc 20

<210> 46

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 46

cccggcaggt tattggacat 20

<210> 47

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 47

agtggagtgc tacccagact 20

<210> 48

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 48

tctctggtgg gtctgggatt 20

<210> 49

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 49

ggtgaaagtc gggaccagtt 20

<210> 50

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 50

gttttccctc ctcctccagc 20

<210> 51

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 51

ccctcattca gccctgtgtt 20

<210> 52

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 52

atggggagag aggggagttc 20

<210> 53

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 53

ccaggcagtc tcagaaggtg 20

<210> 54

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 54

ccttcagttt gctggccaac 20

<210> 55

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 55

gcctgaagat gctctggagg 20

<210> 56

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 56

acaaagcctg ggagatgtcc 20

<210> 57

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<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 57

cttgtgccct gtgttgttgg 20

<210> 58

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 58

ctactcaggc gctgtgacaa 20

<210> 59

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

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gcgggtaggc agatttgaga 20

<210> 60

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<212> DNA

<213> 人工序列()

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gggccatcag atctgcaagt 20

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<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 61

gggacaagcg gtttcagaca 20

<210> 62

<211> 21

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<213> 人工序列()

<400> 62

tcgatcatct caaagtcttc t 21

<210> 63

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 63

tcagacaagg cccttcatgc 20

<210> 64

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<213> 人工序列()

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ttttcctcag ctgcagtggt 20

<210> 65

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 65

cttccttctt cgtcccaccc 20

<210> 66

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 66

cctgtgctct ctgactcagc 20

<210> 67

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<210> 68

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<212> DNA

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<212> DNA

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ttcccaaacc actgcagtgt 20

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<212> DNA

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ttcaccaccg gtccagattg 20

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<213> 人工序列()

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tgatggtgac gtttggggtt 20

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<212> DNA

<213> 人工序列()

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acggcaacag caagtgtcta 20

<210> 73

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 73

gctcacgcaa ccaaaaagct 20

<210> 74

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 74

ttctcctctt tcgcaacccc 20

<210> 75

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 75

agatccccat cttccccaca 20

<210> 76

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 76

atcccgcacc aacacaaaga 20

<210> 77

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 77

cacagtttgt gcctgcatgt 20

<210> 78

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

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gctggaatta ccctggcact 20

<210> 79

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 79

tgcttgaaaa tgtcttccaa gagg 24

<210> 80

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 80

tatagcctgt tggggtcgga 20

<210> 81

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 81

gtccaagctt ctccctccac 20

<210> 82

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 82

gcctgagtct ccccctctaa 20

<210> 83

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 83

tccctgttgc ctatgtgctg 20

<210> 84

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 84

aagaacagtc gacggtggac 20

<210> 85

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 85

gagtccttcc agcaccaaca 20

<210> 86

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 86

gcatcagaca tgaggagcgt 20

<210> 87

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 87

ggtctggggt tcaagtcctg 20

<210> 88

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 88

catagtgctc ggctgtaggg 20

<210> 89

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 89

ggtgccttgt gatggactgg 20

<210> 90

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 90

gaaggagcgc aggaagaa 18

<210> 91

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 91

ctggtttcct cccacagtcc 20

<210> 92

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 92

aggacgtgag gcagagtact 20