化合物在制备用于抑制SARS-CoV-2 E蛋白的离子通道活性的产品中的应用

技术领域

本申请涉及抗病毒药物技术领域，尤其是涉及化合物在制备用于抑制SARS-CoV-2E蛋白的离子通道活性的产品的应用。

背景技术

新型冠状病毒肺炎COVID-19是由新型冠状病毒SARS-CoV-2感染导致的肺炎，目前除了对其诊断试剂、疫苗的开发外，还需要能够直接治疗COVID-19的药物。多种高致病性病毒均编码具有离子通道活性的小分子膜蛋白，而病毒的离子通道对病毒的致病性至关重要，可作为理想的药物靶点，如抗甲型流感病毒药物金刚烷胺是一种离子通道拮抗剂。现有研究结果显示，包括SARS-CoV-2在内的所有冠状病毒都编码一种疏水小包膜(E)蛋白，以严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)为例，其E蛋白的离子通道活性对病毒的致病性和发病机制至关重要。SARS-CoV和SARS-CoV-2的E蛋白序列具有很高的同源性。鉴于此，SARS-CoV-2的E蛋白很可能也具有离子通道活性并对病毒的致病性起到至关重要的作用。所以，以SARS-CoV-2的E蛋白为靶点的SARS-CoV-2 E蛋白抑制剂极有可能在COVID-19的治疗中发挥重要作用。而目前尚未发现有效的新型冠状病毒SARS-CoV-2的E蛋白抑制剂。

发明内容

本申请旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本申请提出一种化合物在制备用于抑制SARS-CoV-2 E蛋白的离子通道活性的产品的应用。

本申请的第一方面，提供化合物或其药学上可接受的盐在制备：

(a)用于抑制SARS-CoV-2 E蛋白的离子通道活性的产品；和/或

(b)用于降低SARS-CoV-2的致病力的产品；和/或

(c)用于预防和/或治疗SARS-CoV-2引起的新型冠状病毒肺炎的产品中的应用；

其中，化合物的通式如下所示：

其中，X为卤素；R

根据本申请实施例的应用，至少具有如下有益效果：

申请人在实验过程中发现，具有上述结构的化合物或其药学上可接受的盐对于抑制SARS-CoV-2 E蛋白的离子通道活性具有良好的效果，因而可以用于制备具有相应功用的产品。

其中，离子通道是指由特殊的蛋白构成，聚集并镶嵌在细胞上，形成特定的孔隙以使部分水溶性物质能够快速进出细胞的通道。离子通道活性是指离子通道对于这部分特殊的离子运输的快慢程度，而在本申请中，离子通道活性特指病毒编码的E蛋白的离子通道活性，即SARS-CoV-2 E蛋白对于特殊的离子(如Na

致病力是指病毒引起宿主感染的能力，病毒对宿主的感染程度的指标包括致病力(pathogenicity)和毒力(virulence)。现有研究表明，病毒的离子通道蛋白对病毒的复制和释放具有非常重要的影响。因此，通过抑制病毒特定蛋白的离子通道活性也就成为抑制病毒的致病力的一个重要途径。具体到本方案，上述化合物能够在很大程度上影响SARS-CoV-2 E蛋白的离子通道活性，自然也就能够对其致病力造成重要影响，进而能够在一定程度上预防和/或治疗SARS-CoV-2引起的新型冠状病毒肺炎。

在本申请的一些实施方式中，X为Cl。

在本申请的一些实施方式中，R

在本申请的一些实施方式中，R

在本申请的一些实施方式中，化合物的结构式如下：

本申请的第二方面，提供一种用于抑制SARS-CoV-2 E蛋白的离子通道活性的药物组合物，该药物组合物包括药学上可接受的载体和具有如下通式的化合物：

其中，X为卤素；R

药学上可接受的载体的非限制性实例包括用于溶解或分散上述化合物的溶剂或分散介质，或能够将上述化合物进行包覆的包膜载体等，进一步还可以包括其它助剂，如抗菌剂、调味剂等。

本申请的第三方面，提供一种用于降低SARS-CoV-2的致病力的药物组合物，该药物组合物包括药学上可接受的载体和具有如下通式的化合物：

其中，X为卤素；R

药学上可接受的载体的非限制性实例包括用于溶解或分散上述化合物的溶剂或分散介质，或能够将上述化合物进行包覆的包膜载体等，进一步还可以包括其它助剂，如抗菌剂、调味剂等。

本申请的第四方面，提供一种用于预防和/或治疗SARS-CoV-2引起的新型冠状病毒肺炎的药物组合物，该药物组合物包括药学上可接受的载体和具有如下通式的化合物：

其中，X为卤素；R

药学上可接受的载体的非限制性实例包括用于溶解或分散上述化合物的溶剂或分散介质，或能够将上述化合物进行包覆的包膜载体等，进一步还可以包括其它助剂，如抗菌剂、调味剂等。

本申请的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本申请的实践了解到。

附图说明

图1是本申请的实施例1中的SARS-CoV-2 E蛋白的离子通道活性测定结果。

图2是本申请的实施例2中化合物Ⅰ对SARS-CoV-2 E蛋白的离子通道活性的抑制效果的测定结果。

图3是本申请的实施例2中化合物Ⅰ与SARS-CoV-2E蛋白的结合模型。

图4是本申请的实施例3中化合物Ⅰ对突变后的SARS-CoV-2E蛋白的离子通道活性的抑制效果的测定结果。

具体实施方式

以下将结合实施例对本申请的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本申请的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本申请的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本申请的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本申请保护的范围。

下面详细描述本申请的实施例，描述的实施例是示例性的，仅用于解释本申请，而不能理解为对本申请的限制。

在本申请的描述中，若干的含义是一个以上，多个的含义是两个以上，大于、小于、超过等理解为不包括本数，以上、以下、以内等理解为包括本数。如果有描述到第一、第二只是用于区分技术特征为目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量或者隐含指明所指示的技术特征的先后关系。

本申请的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示意性实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本申请的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

实施例1

SARS-CoV-2 E蛋白离子通道活性测定

(1)表达SARS-CoV-2 E蛋白

SARS-CoV-2 E蛋白基因(NCBI参考序列：NC_045512.2)由GENEWIZ公司合成，并亚克隆至带有IRES-GFP的pcDNA3.1载体上。使用Lipofectamine 3000试剂将上述质粒瞬时转染至中国仓鼠卵巢细胞系(CHO)中表达SARS-CoV-2 E蛋白。

(2)测试SARS-CoV-2 E蛋白的离子通道活性

以未转染的CHO细胞作为对照，通过全细胞电压钳实验检测SARS-CoV-2 E蛋白的离子通道活性。具体过程如下：

将细胞钳制在0mV，给予细胞从-100mV至100mV的阶梯电压，增量为10mV。检测不同电压下细胞被激发出的最大电流，结果如图1所示。

-100mV电压下，未转染的CHO细胞的电流大小为-88.5±24.4pA(n＝13)，表达SARS-CoV-2 E蛋白的CHO细胞的电流大小为-169.9±73.7pA(n＝15)；100mV电压下，未转染的CHO细胞的电流大小为154.9±42.8pA(n＝13)，表达SARS-CoV-2 E蛋白的CHO细胞的电流大小为300.6±136.5pA(n＝15)。与不表达SARS-CoV-2 E蛋白的CHO细胞相比，在电压刺激下，表达SARS-CoV-2 E蛋白的CHO细胞被激发出了明显增大的内向电流和外向电流，不成对t检验表明两组细胞在同样的电压刺激下电流大小有显著性差异(p<0.05)。

上述实验结果表明SARS-CoV-2 E蛋白具有离子通道活性。

实施例2

通过同源建模，建立SARS-CoV-2 E蛋白的五聚体结构模型。利用SARS-CoV-2 E蛋白的结构模型，利用列出的药物库、临床期药物库和天然产物库进行了共计5000个化合物的虚拟筛选。筛选结果包括具有如下结构式的化合物Ⅰ：

验证该化合物Ⅰ对SARS-CoV-2 E蛋白的离子通道活性抑制

在细胞记录外液中加入终浓度为10μM的化合物Ⅰ，使用实施例1中的方法检测SARS-CoV-2 E蛋白具有离子通道活性，结果如图2所示。

在化合物Ⅰ作用下，-100mV电压下，表达SARS-CoV-2 E蛋白的CHO细胞的电流大小为-89.8±35.0pA(n＝16)；100mV电压下，表达SARS-CoV-2 E蛋白的CHO细胞的电流大小为167.8±69.1pA(n＝16)。与未添加化合物Ⅰ时相比，细胞电流有明显的降低，不成对t检验表明两组细胞在同样的电压刺激下电流大小有显著性差异(p<0.05)。

上述实验结果表明该化合物Ⅰ对SARS-CoV-2 E蛋白的离子通道活性具有很强的抑制作用。

参考图3，为化合物Ⅰ与SARS-CoV-2 E蛋白的结合模型，其中，a为E蛋白，b为E蛋白形成的五聚体(A～E)的两个视图，c为化合物Ⅰ与该五聚体的结合模型，从c中可以看出，该化合物Ⅰ主要通过其两侧的七元环、胍基和中间的吡嗪基团与相邻两个E蛋白的Leu28、Leu51以及Tyr57、Ser50等残基发生作用从而影响其离子通道活性。相比较而言，SARS-CoVE蛋白的Asn15和Val25是决定SARS-CoV E蛋白离子通道活性的关键氨基酸，而SARS-CoV-2的E蛋白虽然与SARS-CoV E蛋白具有较高的同源性(94.7％)，但其离子通道的结构仍有明显不同，对能够抑制其离子通道活性的抑制剂也有不同的要求。因此，在面临SARS-CoV-2的E蛋白的离子通道活性抑制剂的选择时，并不能够直接从SARS-CoV E蛋白的离子通道活性抑制剂进行直接的参考。

而本申请所公开的上述化合物通过和上述的一些残基发生作用，从而通过改变E蛋白五聚体的空间位阻，抑制阳离子在其间传导，进而影响SARS-CoV-2 E蛋白的离子通道活性。在此基础上，由于E蛋白的离子通道活性与病毒的增殖和致病性存在一定关联，因而通过对其离子通道活性的抑制可以进一步用于降低SARS-CoV-2病毒的致病力。另外，部分研究显示，E蛋白的离子通道活性与炎症反应有关，那么基于此可以合理推测该离子通道活性抑制剂可以进一步用于预防和/或治疗SARS-CoV-2引起的新型冠状病毒肺炎。

实施例3

对SARS-CoV E蛋白的Leu28、Leu51分别进行定点突变，对突变后的L28A和L51A突变体采用实施例2中的方法验证化合物Ⅰ对SARS-CoV-2 E蛋白的离子通道活性抑制效果，结果如图4所示。其中，a为L28A突变体的验证结果，b为L51A突变体的验证结果。从图中可以看出，与未转染的CHO细胞相比，表达突变体L28A和L51A的细胞的电流大小存在显著性差异(p<0.05)，但化合物Ⅰ作用与未作用的实验组之间电流大小并不存在显著性差异，表明化合物Ⅰ对于SARS-CoV-2 E蛋白的离子通道活性的抑制效果在发生上述突变后失效了，证明这些残基是化合物Ⅰ的关键作用位点。那么，与上述化合物Ⅰ结构类似的其它化合物因为也能够与这些残基发生作用，自然也就具备相似的离子通道活性抑制效果。

实施例4

分别取结构式如下的化合物，采用实施例2中的方法验证其对SARS-CoV-2 E蛋白的离子通道活性抑制效果：

结果显示，与未添加对应化合物时相比，加入后细胞电流存在显著的降低，表明这些化合物同样对SARS-CoV-2 E蛋白的离子通道活性具有明显的抑制效果。

综合上述实施例，本申请所提供的具有特定结构的化合物能够作为SARS-CoV-2 E蛋白的离子通道活性抑制剂使用，并进而用于降低SARS-CoV-2病毒的致病力、预防和/或治疗SARS-CoV-2引起的新型冠状病毒肺炎。

上面结合实施例对本申请作了详细说明，但是本申请不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本申请宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本申请的实施例及实施例中的特征可以相互组合。