巯嘌呤用药检测方法

技术领域

本发明涉及一种用药检测方法。

背景技术

化疗是治疗儿童急性淋巴白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)的标准方案，但治疗后肿瘤常会耐药复发。尽管现在五年生存率接近90％，但是20％左右病例仍会复发，且复发后治愈率仅20％～50％。耐药复发是造成儿童ALL治疗失败和患者死亡的重要原因。

巯嘌呤(Mercaptopurine，6-MP)属于抑制嘌呤合成途径的细胞周期特异性药物，化学结构与次黄嘌呤相似，因而能竞争性地抑制次黄嘌呤的转变过程。本品进入体内，在细胞内必须由磷酸核苷糖转移酶转变为6-巯基嘌呤核糖核苷酸后，方具有活性。适用于绒毛膜上皮癌、恶性葡萄胎、急性淋巴细胞白血病及急性非淋巴细胞白血病、慢性粒细胞性白血病的急变期；是ALL临床常用化疗药物。

ALL的不良反应有：1.较常见的为骨髓抑制，可有白细胞及血小板减少。2.肝脏损害：可致胆汁淤积出现黄疸。3.消化系统：恶心、呕吐、食欲减退、腹泻和口腔炎，但较少发生，可见于服药量过大的患者。4.高尿酸血症：多见于白血病治疗初期，严重的可发生尿酸性肾病。5.间质性肺炎及肺纤维化少见。不仅如此，临床使用过程中还发现患者的巯嘌呤治疗效果和复发率波动异常，部分采用巯嘌呤治疗的患者治疗效果差且复发率高，而其他患者的情况则恰恰相反。

发明内容

本发明提供了一种巯嘌呤用药检测方法，该方法可作为巯嘌呤用药指导，对使用巯嘌呤类药物的患者进行筛选，进而降低巯嘌呤类药物用药风险，提高治疗效果、降低复发率；也可以避免不必要的治疗和费用支出，更为患者争取了宝贵的治疗时间。

本发明巯嘌呤用药检测方法按以下步骤进行：

一、抽提服用巯嘌呤类药物患者的白血病样本基因组DNA进行全基因组测序；

二、分析全基因组测序数据，得到SNV(单核苷酸变异)信息和indels(插入或缺失)信息；

三、判断患者是否存在Thio-dMMR突变印记，

若不存在Thio-dMMR突变印记则患者可以继续使用巯嘌呤治疗，

若患者存在Thio-dMMR突变印记，则须停止并不得采用巯嘌呤类药物治疗；

其中，所述Thio-dMMR突变印记位于CpG双核苷酸位点，且NCG三核苷酸中心处C位点发生G:C>A:T变异(以下简称为C>T变异)。

本发明测定为停止并不得采用巯嘌呤类药物治疗的患者，若继续使用巯嘌呤类药物进行治疗，不仅白血病复发率高，而且在复发后采用长春新碱、柔红霉素和阿糖胞苷等其他药物治疗的效果依然不理想。

具体实施方式

下面结合实例对本发明作进一步的详细说明。以下实例旨在说明本发明，并不限制本发明的范围。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明均为常规方法。所用材料、试剂、方法和仪器，未经特殊说明，均为本领域常规材料、试剂、方法和仪器，本领域技术人员均可通过商业渠道获得。

具体实施方式一：本实施方式嘌呤用药检测方法按以下步骤进行：

一、抽提服用巯嘌呤类药物患者的白血病样本基因组DNA进行全基因组测序；

二、分析全基因组测序数据，得到SNV(单核苷酸变异)信息和indels(插入或缺失)信息；

三、判断患者是否存在Thio-dMMR突变印记，

若不存在Thio-dMMR突变印记则患者可以继续使用巯嘌呤治疗，

若患者存在Thio-dMMR突变印记，则须停止并不得采用巯嘌呤类药物治疗；

其中，所述Thio-dMMR突变印记位于CpG双核苷酸位点，且NCG三核苷酸中心处C位点发生G:C>A:T变异。

具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一的不同点在于：Thio-dMMR突变印记具有显著的转录链和CpG的偏好性。其它步骤和参数与具体实施方式一相同。

COSMIC MMR突变印记缺乏链偏倚，COSMIC突变印记1仅在ACG的C>T突变中存在链偏倚。Thio-dMMR突变印记突变印记和COSMIC突变印记1的余弦相似性为0.92，但根据链偏倚和突变率分析能够清楚地区分了thio-dMMR突变印记和COSMIC突变印记1。

量化了COSMIC的突变突变印记，包括突变印记87(巯嘌呤突变印记)，突变印记86(一种复发特异性的未知原因的ALL突变印记，以前称为新突变印记A4)和来自181名患者WGS数据的ALL复发特异性SNV目录中的Thio-dMMR突变印记。其中，153个具有可靠确定的cos≥0.85的特征剩下的大多数都为较低的突变负荷。实验中对上述患者使用巯嘌呤类药物进行治疗，选用复发样本中有但在诊断(初次患病诊断)样本中未发现的SNV进行检测(排除在诊断和复发或仅诊断时检测到的SNV)。当有两次复发时，只对最近一次复发所特有的SNV进行特征分析。

实验显示，thio-dMMR突变印记具有所有突变印记中最高的突变率(复发特异性SNVs/复发天数)，比巯嘌呤突变印记高10倍以上，并与增加的突变负荷相关。然而，thio-dMMR突变率变化很大，可能是因为突变在治疗时发生在每个患者的不同时间点，使得每次复发获得thio-dMMR突变的时间不同。

实施例1

用CRISPR/Cas9诱导的MSH2敲除(-/-)以及完整的MSH2(WT)等基因MCF10A人类乳腺细胞进行实验。

用或不用巯嘌呤(6-TG)处理每一株细胞15周(分成2组，一组用巯嘌呤处理细胞，另一组不用巯嘌呤处理细胞)，每组分离两个单细胞克隆，并进行WGS以确定在单细胞克隆中出现的突变和突变印记。6-TG处理的WT细胞获得标准巯嘌呤突变印记，COSINE相似性为0.95；而MSH2敲除6-TG处理的细胞中获得了具有突变印记Thio-dMMR突变印记的细胞，COSINE相似性为0.97。在6-TG治疗5周后，具有纯合MSH2缺失的Nalm6 ALL细胞也出现了具有Thio-dMMR突变印记特征的细胞，COSINE相似性为0.99，且6-TG使突变率增加10倍(平均每个克隆18390个SNVs)，而未经处理的细胞(平均每个克隆1748个SNVs)。相比之下，未经处理的Nalm6和未经处理的MCF10A MSH2敲除克隆具有标准的MMR缺陷特征6和26。因此，巯嘌呤治疗在癌症中所产生的Thio-dMMR突变印记是一种新的突变突变印记。

实施例2

采用本发明的方法对592个使用巯嘌呤类药物的儿童急性淋巴白血病的患者样本进行WGS检测和突变印记分析，其中181名患者具有复发样本。在591个初发样本中，均表现为COSMIC突变印记1；181例复发样本中，25例表现为Thiopurine突变印记，有14例表现为Thio-dMMR突变印记。经过细胞系中研究测试，Thio-dMMR突变印记阳性患者对长春新碱、柔红霉素、阿糖胞苷、甲氨喋呤等多种化疗药物耐药，抑制细胞周期监测点和细胞凋亡。

对585例使用巯嘌呤类药物的复发儿童急性淋巴白血病的复发时间进行比较，524例野生型患者中的170例(32.44％)表现为治疗中复发，而17例表现为Thio-dMMR突变印记患者中的14例(82.35％)表现为治疗中复发，出现Thio-dMMR突变印记仍采用巯嘌呤类药物治疗显著加快白血病复发速度，降低二线治疗效果。

实验结果说明本发明方法对于急性淋巴白血病患者是否采用巯嘌呤药物治疗具有指导意义。对于检测为不得用巯嘌呤治疗的患者，如果仍采用巯嘌呤药物治疗，不仅治愈率低、复发率高，而且复发后采用其他药物治疗效果也更差。

本发明检测方法对于患有其他癌症的患者用药也同样具有指导意义。