一种获得具有草铵膦抗性的蛋白的方法及谷氨酰胺合成酶突变体

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体而言，涉及一种获得具有草铵膦抗性的蛋白的方法及谷氨酰胺合成酶突变体。

背景技术

谷氨酰胺合成酶(Glutamine synthetase,GS)是植物氮代谢的关键酶，它在谷氨酸合成酶循环中催化谷氨酸(Glu)与NH

草铵膦(glufosinate，glufosinate ammonium，商品名称Basta)是由安万特公司(现为拜耳公司)开发的谷氨酰胺合成酶(GS1)抑制剂，其有效成分为phosphinothricin(简称PPT)，化学名称为(RS)-2-氨基-4-(羟基甲基氧膦基)丁酸铵。该产品于1986年上市，销售额逐年上升。草铵膦的靶标酶是GS，在正常情况下，GS可以由ATP及glutamate形成λ-glutamyl phosphate。但在PPT处理后，PPT先与ATP结合，磷酸化的PPT占据GS分子的8个反应中心，使GS的空间构型发生变化，从而GS的活性受到抑制。PPT能抑制GS所有已知的形式。

草铵膦抑制GS的结果，可以导致植物体内氮代谢紊乱，铵的过量积累，叶绿体解体，从而致使光合作用受抑制，最终导致植物死亡。

目前培育抗草铵膦品种的主要方法是应用基因工程手段将来自细菌的抗草铵膦基因导入农作物中，从而培育出转基因抗草铵膦作物新品种。目前农业上应用最广的抗草铵膦基因是来源于菌株Streptomyces hygroscopicus的bar基因和菌株S.viridochromogenes的pat基因。bar基因和pat基因具有80％的同源性，都可以编码草铵膦乙酰化酶，而该酶可以使草铵膦乙酰化而失活。抗草铵膦品种具有极大的使用价值，其中抗性油菜、玉米等已大面积商业化种植。

但是由于反转基因浪潮，转基因作物在全世界的接受程度仍然较低，即使在转基因作物种植面积最大的美洲，转基因也主要局限于玉米、大豆、棉花等几个作物。特别是bar基因和pat基因来源于微生物，而不是来源于农作物本身，更容易造成消费者的抵触心理。

bar基因和pat基因编码的草铵膦乙酰化酶可以使草铵膦乙酰化而失活，但是在草铵膦接触GS之前，该酶很难使草铵膦完全失活，因为很多GS分布在细胞膜上，因此草铵膦在转bar基因和pat基因农作物上应用时，会不同程度的干扰植物的氮代谢，同时影响植物正常的生长和发育。虽然在植物中过量表达野生型GS可以降低转基因植物对草铵膦的敏感程度，但其耐性程度不足以商业化应用。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种获得具有草铵膦抗性的蛋白的方法及谷氨酰胺合成酶突变体以解决上述技术问题。

本发明是这样实现的：

本发明提供了一种获得具有草铵膦抗性的蛋白的方法，包括如下步骤：

1)以具有SEQ ID NO.1所示的参考序列、或以与参考序列相比具有至少85％同一性的氨基酸序列的蛋白作为目标蛋白；

2)将目标蛋白的氨基酸序列与参考序列比对，将目标蛋白的氨基酸序列对应于参考序列第55位氨基酸残基S和/或第64位氨基酸残基P进行突变；

3)选择草铵膦抗性增强的蛋白。

发明人发现，将目标蛋白的氨基酸序列与参考序列进行比对，将其序列上对应于参考序列第55位的氨基酸残基S和/或第64位氨基酸残基P进行突变，经选择可以获得草铵膦抗性增强的蛋白。

该蛋白具有草铵膦抗性，同时可以保持自身的生物酶催化活性，从而满足植物的正常氮代谢，维持植物的正常生长和发育。

转化本发明提供的具有草铵膦抗性的蛋白的植株或重组菌均能够在草铵膦存在的条件下正常生长和发育，该具有草铵膦抗性的蛋白突变体不仅用于转基因作物培育，也可应用于培育抗草铵膦非转基因植物或转基因植物例如水稻、烟草、大豆、玉米、小麦、油菜、棉花和高粱等，具有广阔的应用前景。

上述的参考序列为水稻来源的野生型谷氨酰胺合成酶。

序列比对方法可使用Blast网站(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行Protein Blast比对；采用本领域熟知的其他序列比对方法或工具也可以得到相同的结果。

上述目标蛋白包括不限于：与植物天然蛋白序列近似的蛋白(如人工设计合成)、植物来源的野生型谷氨酰胺合成酶。通过对上述氨基酸残基位点进行突变可以获得草铵膦抗性增强的蛋白。

上述85％以上的同一性，例如85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％等以上的同一性。

本发明中的“草铵膦”又名草丁膦，是指2-氨基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸铵。

本发明还提供了一种具有草铵膦抗性的谷氨酰胺合成酶突变体，其具有如下至少一种的氨基酸序列：

(1)谷氨酰胺合成酶突变体的氨基酸序列由野生型谷氨酰胺合成酶的第n位发生突变得到；第n位的位置通过如下方式确定：野生型谷氨酰胺合成酶与参考序列比对，野生型谷氨酰胺合成酶的第n位对应于参考序列的第55位；

突变后的谷氨酰胺合成酶突变体的第n位的氨基酸为X1，X1＝D、L或T；

(2)谷氨酰胺合成酶突变体的氨基酸序列与(1)所示的谷氨酰胺合成酶突变体至少具有85％以上的同一性、且与(1)所示的谷氨酰胺合成酶突变体在第n位的氨基酸相同、以及具有草铵膦抗性；

(3)谷氨酰胺合成酶突变体的氨基酸序列由野生型谷氨酰胺合成酶的第m位发生突变得到；第m位的位置通过如下方式确定：野生型谷氨酰胺合成酶与参考序列比对，野生型谷氨酰胺合成酶的第m位对应于参考序列的第64位；

突变后的谷氨酰胺合成酶突变体的第m位的氨基酸为X2，X2＝Q、R、S、T、V、W、A、D、F、M、Y或X；X为删除；

(4)谷氨酰胺合成酶突变体的氨基酸序列与(3)所示的谷氨酰胺合成酶突变体至少具有85％以上的同一性、且与(3)所示的谷氨酰胺合成酶突变体在第m位的氨基酸相同、以及具有草铵膦抗性；

参考序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的研究发现，将植物来源的野生型谷氨酰胺合成酶与参考序列进行比对，将其序列上对应于参考序列第55位的氨基酸位点即第n位进行突变，突变为D、L或T；或者将其序列上对应于参考序列第64位的氨基酸位点即第m位进行突变，突变为Q、R、S、T、V、W、A、D、F、M、Y或X，所得到的谷氨酰胺合成酶突变体具有草铵膦抗性，同时保持自身的生物酶催化活性。转化本发明提供的植物谷氨酰胺合成酶突变体的植株或重组菌均能够在草铵膦存在的条件下正常生长和发育，该植物谷氨酰胺合成酶突变体不仅用于转基因作物培育，也可应用于培育抗草铵膦非转基因植物或转基因植物例如水稻、烟草、大豆、玉米、棉花和高粱等，具有广阔的应用前景。

上述参考序列为水稻来源的野生型谷氨酰胺合成酶。

序列比对方法可使用Blast网站(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行Protein Blast比对；采用本领域熟知的其他序列比对方法或工具也可以得到相同的结果。

需要说明的是，野生型谷氨酰胺合成酶的第n位在其自身序列上可能也是第55位(例如玉米、小麦、大豆、油菜等)，但也可能不是第55位，第n位的具体位置根据前述序列比对后确定，只要其通过与参考序列比对后，对应于参考序列第55位的位点即为本发明所述的第n位，也就是突变位点。

需要说明的是，野生型谷氨酰胺合成酶的第m位在其自身序列上可能也是第64位(例如玉米、小麦、大豆、油菜等)，但也可能不是第64位，第m位的具体位置根据前述序列比对后确定，只要其通过与参考序列比对后，对应于参考序列第64位的位点即为本发明所述的第m位，也就是突变位点。

所有植物的野生型谷氨酰胺合成酶都具有同源性，在植物体内具有基本相同的功能和结构域。因此，任意植物来源的野生型谷氨酰胺合成酶在第55或64位作上述突变后所得到的谷氨酰胺合成酶突变体都具有草铵膦抗性。因此，由任意植物来源的野生型谷氨酰胺合成酶作上述突变后得到的谷氨酰胺合成酶突变体均属于本发明的保护范围。

此外，本领域技术人员知晓并容易实现，在(1)或(3)所示的谷氨酰胺合成酶突变体的非保守区域进行简单的氨基酸替换、删除或增加等操作并维持第n位为上述突变后的氨基酸，并使进一步突变得到的谷氨酰胺合成酶突变体与(1)(或(3))所示的谷氨酰胺合成酶突变体具有至少具有85％(例如85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％等)以上的同一性，且其功能包括酶催化活性和草铵膦抗性与(1)或(3)所示的谷氨酰胺合成酶突变体相当或略有下降或略有提高或大幅提高等。因此，此类谷氨酰胺合成酶也应属于本发明的保护范围。

当野生型谷氨酰胺合成酶的植物为水稻时，X1＝D、L或T；X2＝Q、R、S、T、V、W或X，X为删除；

当野生型谷氨酰胺合成酶的植物为大豆或玉米时，X1＝D；X2＝T或X，X为删除；

当野生型谷氨酰胺合成酶的植物为油菜时，X2＝A、D、F、M、Q、W、Y或X，X为删除。

可选的，在本发明的一些实施方案中，当植物为水稻时，水稻野生型谷氨酰胺合成酶为SEQ ID NO.1：

可选的，在本发明的一些实施方案中，当植物为玉米时，玉米野生型谷氨酰胺合成酶为SEQ ID NO.2：

可选的，在本发明的一些实施方案中，当植物为大豆时，大豆野生型谷氨酰胺合成酶为SEQ ID NO.3：

可选的，在本发明的一些实施方案中，当植物为油菜时，油菜野生型谷氨酰胺合成酶为SEQ ID NO.4：

部分植物来源的野生型谷氨酰胺合成酶相互间的相似性(Similarity)和同一性(Identity)如下表所示。图1为不同植物野生型谷氨酰胺合成酶的氨基酸序列比对结果；图中：OsGS1-WT：水稻野生型谷氨酰胺合成酶体；ZmGS1-WT：玉米野生型谷氨酰胺合成酶体；GmGS1-WT：大豆野生型谷氨酰胺合成酶体；BnGS1-WT：油菜野生型谷氨酰胺合成酶体，箭头所示分别为第55位和第64位氨基酸。

上述相似性(Similarity)和同一性(Identity)的比对方法为：将一个物种的氨基酸序列输入到Blast网站(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行ProteinBlast比对，从比对结果中查找此物种和其他需要比对的物种的相似性(Similarity)和同一性(Identity)。

本发明还提供了一种核酸分子，其编码上述的谷氨酰胺合成酶突变体。

在本发明提供了上述氨基酸序列的情况下，本领域技术人员根据密码子的简并性容易获得编码上述谷氨酰胺合成酶突变体的核酸序列。例如，可以在编码野生型谷氨酰胺合成酶的核酸序列上作对应的核苷酸突变得到编码上述谷氨酰胺合成酶突变体的核酸序列。这对本领域技术人员来说是容易实现的。

例如，水稻野生型谷氨酰胺合成酶的编码核酸序列为SEQ ID NO.5：

据此，在序列基础上，在对应于其编码氨基酸序列第55位或64位的密码子进行对应的核苷酸突变，即可得到编码如上所述的水稻谷氨酰胺合成酶突变体。

玉米野生型谷氨酰胺合成酶的编码核酸序列为SEQ ID NO.6：

大豆野生型谷氨酰胺合成酶的编码核酸序列为SEQ ID NO.7：

油菜野生型谷氨酰胺合成酶的编码核酸序列为SEQ ID NO.8：

本发明还提供了一种表达盒或载体，其含有上述的核酸分子。

在一种可选的实施方式中，上述表达盒连接有用于的调控上述核酸分子表达的调控序列。

本发明还提供了一种重组菌或重组细胞，其含有上述的核酸分子，或表达盒或载体。

重组菌可以选自农杆菌；重组细胞可以是感受态细胞。

本发明还提供了一种产生耐受草铵膦除草剂的植物的方法，包括向植物的基因组中引入编码上述具有草铵膦抗性的谷氨酰胺合成酶突变体的基因。

在一种可选的实施方式中，引入的方法选自遗传转化方法、基因组编辑方法或基因突变方法。

上述遗传转化方法包括不限于：通过带有草铵膦抗性的谷氨酰胺合成酶突变体的基因的亲本植物自交或与其他植物个体杂交产生带有草铵膦抗性的个体。

在其他实施方式中，上述转化的方法包括不限于农杆菌介导基因转化法，基因枪转化法、花粉管通道法。

基因组编辑方法或基因突变方法是指本领域技术人员容易想到通过本领域常规的转基因技术、基因编辑技术(如通过锌指核酸内切酶(ZFN，zinc-finger nucleases)技术、类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN，transcription activator-like effectornucleases)技术或CRISPR/Cas9)、诱变育种技术(如化学、辐射诱变等)等对目标植物进行改造，使其具有编码如上谷氨酰胺合成酶突变体的基因，进而获得草铵膦抗性并能够正常生长和发育的植物新品种。因此，无论采用何种技术，只要其利用了本发明提供的谷氨酰胺合成酶突变体赋予植物草铵膦抗性，均属于本发明的保护范围。

在一种可选的实施方式中，植物包括不限于小麦、水稻、大麦、燕麦、玉米、高粱、谷子、荞麦、黍稷、甘薯、马铃薯、棉花、油菜、芝麻、花生、向日葵、萝卜、胡萝卜、花椰菜、番茄、茄子、辣椒、韭菜、大葱、洋葱、韭葱、菠菜、芹菜、苋菜、莴苣、茼蒿、黄花菜、葡萄、草莓、甘蔗、烟草、芸薹属蔬菜、葫芦科植物、豆科植物、牧草、茶或木薯。

在一种可选的实施方式中，牧草包括不限于禾本科牧草或豆科牧草。禾本科牧草包括不限于：草坪草。

在一种可选的实施方式中，芸薹属蔬菜包括不限于芜菁、白菜、芥菜、甘蓝、芥蓝、菜苔、苦芥、擎蓝、芸苔、青菜或甜菜。

在一种可选的实施方式中，葫芦科植物包括不限于黄瓜、西葫芦、南瓜、冬瓜、苦瓜、丝瓜、菜瓜、西瓜或甜瓜。

在一种可选的实施方式中，豆科植物包括不限于绿豆、蚕豆、豌豆、扁豆、大豆、菜豆、豇豆或毛豆。

本发明还提供了谷氨酰胺合成酶突变体、核酸分子、表达盒或载体，或重组菌或重组细胞在培育具有草铵膦抗性的植物品种中的应用。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述应用包括：对植物细胞、组织、个体或群体进行诱变和筛选，使其编码谷氨酰胺合成酶突变体。

在一种可选的实施方式中，诱变为非致死剂量的理化诱变方式对植物进行诱变以获得植物材料。

上述非致死剂量是指将剂量控制在半致死剂量上下浮动20％的范围。

理化诱变方式包括以下物理诱变、化学诱变方式中的一种或多种的组合：物理诱变包括紫外线诱变、X射线诱变、γ射线诱变、β射线诱变、α射线诱变、高能粒子诱变、宇宙射线诱变、微重力诱变；化学诱变包括烷化剂诱变、叠氮化物诱变、碱基类似物诱变、氯化锂诱变、抗生素诱变、嵌入染料诱变；烷化剂诱变包括甲基环酸乙酯诱变、硫酸二乙酯诱变、乙烯亚胺诱变。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述应用还包括：修饰目的植物的内源谷氨酰胺合成酶基因，使其编码谷氨酰胺合成酶突变体。

修饰目的植物的内源谷氨酰胺合成酶基因是指本领域技术人员容易想到通过本领域常规的转基因技术、基因编辑技术(如通过锌指核酸内切酶(ZFN，zinc-fingernucleases)技术、类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN，transcription activator-likeeffector nucleases)技术或CRISPR/Cas9)、诱变育种技术(如化学、辐射诱变等)等对目标植物进行改造，使其具有编码如上谷氨酰胺合成酶突变体的基因，进而获得草铵膦抗性并能够正常生长和发育的植物新品种。因此，无论采用何种技术，只要其利用了本发明提供的谷氨酰胺合成酶突变体赋予植物草铵膦抗性，均属于本发明的保护范围。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述应用包括如下至少一种的应用方式：

将分离的核酸分子送入目的植物细胞，分离的核酸分子含有编码谷氨酰胺合成酶突变体的编码基因；

将载体转化目的植物，载体含有编码谷氨酰胺合成酶突变体的编码基因；

将重组菌或重组细胞导入目的植物，重组菌或重组细胞含有编码谷氨酰胺合成酶突变体的编码基因。

分离的核酸分子可以是质粒或DNA片段，在可选的实施方式中，可以通过基因枪法将分离的核酸分子送入目的植物细胞。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供的谷氨酰胺合成酶突变体及具有草铵膦抗性的蛋白，具有用于构建转化植物的表达载体、及培育抗草铵膦作物的应用潜力。本发明提供的谷氨酰胺合成酶突变体原始来源于植物，更容易被消费者接受。通过突变后具有了草铵膦抗性，转化该谷氨酰胺合成酶突变体的植物不仅具有适于商业化应用的草铵膦抗性，也能够保持谷氨酰胺合成酶正常的酶催化活性，可以满足植物正常的生长和发育。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为不同植物野生型谷氨酰胺合成酶的氨基酸序列比对结果；图中：OsGS1-WT：水稻野生型谷氨酰胺合成酶体；ZmGS1-WT：玉米野生型谷氨酰胺合成酶体；GmGS1-WT：大豆野生型谷氨酰胺合成酶体；BnGS1-WT：油菜野生型谷氨酰胺合成酶体；

图2为本发明实施例1提供的水稻GS1突变体R55D、R55T、R55L和野生型水稻GS1OsGS1-WT的氨基酸序列部分比对结果；

图3为本发明实施例2提供的大豆GS1突变体G55D和野生型大豆GS1 GmGS1-WT的氨基酸序列部分比对结果；

图4为本发明实施例3提供的玉米GS1突变体Z55D和野生型玉米GS1 ZmGS1-WT的氨基酸序列部分比对结果；

图5为本发明实施例4提供的水稻GS1突变体R64Q、R64R、R64S、R64T、R64V、R64W、R64X和野生型水稻GS1 OsGS1-WT的氨基酸序列部分比对结果；

图6为本发明实施例5提供的大豆GS1突变体G64X和野生型大豆GS1 GmGS1-WT的氨基酸序列部分比对结果；

图7为本发明实施例6提供的玉米GS1突变体Z64X和野生型玉米GS1 ZmGS1-WT的氨基酸序列部分比对结果；

图8为本发明实施例7提供的油菜GS1突变体B64A、B64D、B64F、B64M、B64Q、B64Y、B64W、B64X和野生型油菜GS1 BnGS1-WT的氨基酸序列部分比对结果；

图9为本发明实验例1提供的pADV7载体的结构示意图；

图10为本发明实验例1提供的转化实施例1提供的水稻GS1突变体R55D、R55T、R55L和野生型水稻GS1 OsGS1-WT的大肠杆菌在含不同浓度草铵膦的培养基上的生长结果；

图11为本发明实验例2提供的转化实施例2提供的大豆GS1突变体G55D和野生型大豆GS1GmGS1-WT的大肠杆菌在含不同浓度草铵膦的培养基上的生长结果；

图12为本发明实验例3提供的转化实施例3提供的玉米GS1突变体Z55D和野生型玉米GS1ZmGS1-WT的大肠杆菌在含不同浓度草铵膦的培养基上的生长结果；

图13为本发明实验例4提供的水稻GS1突变体R55D、大豆GS1突变体G55D、玉米GS1突变体Z55D、野生型水稻GS1 OsGS1-WT、野生型大豆GS1 GmGS1-WT和野生型玉米GS1ZmGS1-WT的酶动力学参数和草铵膦抗性参数IC50；

图14为本发明实验例5提供的转化实施例4提供的水稻GS1突变体R64Q、R64R、R64S、R64T、R64V、R64W、R64X和野生型水稻GS1 OsGS1-WT的大肠杆菌在含不同浓度草铵膦的培养基上的生长结果；

图15为本发明实验例6提供的转化实施例5提供的大豆GS1突变体G64X和野生型大豆GS1GmGS1-WT的大肠杆菌在含不同浓度草铵膦的培养基上的生长结果；

图16为本发明实验例7提供的转化实施例6提供的玉米GS1突变体Z64X和野生型玉米GS1ZmGS1-WT的大肠杆菌在含不同浓度草铵膦的培养基上的生长结果；

图17为本发明实验例8提供的转化实施例7提供的油菜GS1突变体B64A、B64D、B64F、B64M、B64Q、B64Y、B64W、B64X和野生型油菜GS1 BnGS1-WT的大肠杆菌在含不同浓度草铵膦的培养基上的生长结果；

图18为本发明实验例9提供的水稻GS1突变体R64X、大豆GS1突变体G64X、玉米GS1突变体Z64X、油菜GS1突变体B64X、野生型水稻GS1 OsGS1-WT、野生型大豆GS1 GmGS1-WT、野生型玉米GS1 ZmGS1-WT和野生型油菜GS1 BnGS1-WT的酶动力学参数和草铵膦抗性参数IC50。

具体实施方式

现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开内容所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管与本文描述的那些方法和材料类似或等同的任何方法和材料都可用于本文的制剂或单位剂量的实践或测试，但现在描述一些方法和材料。除非另有说明，否则本文采用或考虑的技术是标准方法。材料、方法和实例仅是说明性而非限制性的。

除非另外指明，否则实践本发明将采用植物生理学、植物分子遗传学、细胞生物学、分子生物学(包含重组技术)、微生物学、生物化学和免疫学的常规技术，所述常规技术在本领域技术人员的能力范围内。文献中充分解释了这种技术，如《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)》，第二版(Sambrook等人，1989)；《寡核苷酸合成(Oligonucleotide Synthesis)》(M.J.Gait编，1984)；《植物生理学》(苍晶等人，2017)；《酶学方法(Methods in Enzymology)》(学术出版社有限公司(Academic Press，Inc.)；《实验免疫学手册(Handbook of Experimental Immunology)》(D.M.Weir和C.C.Blackwell编)；《当代分子生物学方法(Current Protocols in Molecular Biology)》(F.M.Ausubel等人编，1987)；《植物分子遗传学》(Monica A.Hughes等人著)；《PCR:聚合酶链反应(PCR:The Polymerase Chain Reaction)》(Mullis等人编，1994)，所述文献中的每个文献均通过引用明确并入本文中。

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例提供的水稻(Oryza sativa)谷氨酰胺合成酶(GS1)突变体，其由野生型水稻谷氨酰胺合成酶自身(命名为OsGS1-WT，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码核苷酸序列为SEQ ID NO.5)的第55位氨基酸残基S突变为D、T、L，得到的水稻GS1突变体分别命名为R55D、R55T、R55L。

水稻GS1突变体R55D、R55T、R55L和野生型水稻GS1的氨基酸序列比对如图2所示，图中：箭头所指示的位置为突变位点。

本实施例中，各水稻GS1突变体的编码序列在编码第55位氨基酸的位置上，对应氨基酸所用的密码子如下表所示，其余位置的核苷酸同相应的野生型编码序列。

本实施例提供的水稻GS1突变体R55D、R55T和R55L和编码它们的核酸分子均可以通过化学合成的方法获得。

实施例2

本实施例提供的大豆(Glycine max)GS1突变体，其由野生型大豆GS1自身((命名为GmGS1-WT，氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，编码核苷酸序列为SEQ ID NO.7)的第55位(对应于参考序列(SEQ ID NO.1)的第55位)由氨基酸残基S突变为D得到。得到的大豆GS1突变体分别命名为G55D。

大豆GS1突变体G55D和野生型大豆GS1的氨基酸序列比对如图3所示，图中：箭头所指示的位置为突变位点。

本实施例中，各大豆GS1突变体的编码序列在编码第55位氨基酸的位置上，对应氨基酸所用的密码子如下表所示，其余位置的核苷酸同相应的野生型编码序列。

本实施例提供的大豆GS1突变体G55D和编码它们的核酸分子均可以通过化学合成的方法获得。

实施例3

本实施例提供的玉米(Zea mays)GS1突变体，其由野生型玉米GS1自身(命名为ZmGS1-WT，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，编码核苷酸序列为SEQ ID NO.6)的第55位(对应于参考序列(SEQ ID NO.1)的第55位)由氨基酸残基S突变为D得到。得到的玉米GS1突变体分别命名为Z55D。

玉米GS1突变体Z55D和野生型玉米GS1的氨基酸序列比对如图4所示，图中：箭头所指示的位置为突变位点。

本实施例中，各玉米GS1突变体的编码序列在编码第55位氨基酸的位置上，对应氨基酸所用的密码子如下表所示，其余位置的核苷酸同相应的野生型编码序列。

本实施例提供的玉米GS1突变体Z55D和编码它们的核酸分子均可以通过化学合成的方法获得。

实施例4

本实施例提供的水稻(Oryza sativa)谷氨酰胺合成酶(GS1)突变体，其由野生型水稻谷氨酰胺合成酶自身(命名为OsGS1-WT，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码核苷酸序列为SEQ ID NO.5)的第64位氨基酸残基P突变为Q、R、S、T、V、W或删除(X)得到，得到的水稻GS1突变体分别命名为R64Q、R64R、R64S、R64T、R64V、R64W、R64X。

水稻GS1突变体R64Q、R64R、R64S、R64T、R64V、R64W、R64X和野生型水稻GS1的氨基酸序列比对如图5所示，图中：箭头所指示的位置为突变位点。

本实施例中，各水稻GS1突变体的编码序列在编码第64位氨基酸的位置上，对应氨基酸所用的密码子如下表所示，其余位置的核苷酸同相应的野生型编码序列。

本实施例提供的水稻GS1突变体R64Q、R64R、R64S、R64T、R64V、R64W、R64X和编码它们的核酸分子均可以通过化学合成的方法获得。

实施例5

本实施例提供的大豆(Glycine max)GS1突变体，其由野生型大豆GS1自身((命名为GmGS1-WT，氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，编码核苷酸序列为SEQ ID NO.7)的第64位(对应于参考序列(SEQ ID NO.1)的第64位)由氨基酸残基P突变为X得到。得到的大豆GS1突变体分别命名为G64X和野生型大豆GS1 GmGS1-WT。

大豆GS1突变体G64X和野生型大豆GS1氨基酸序列比对如图6所示，图中：箭头所指示的位置为突变位点。

本实施例中，各大豆GS1突变体的编码序列在编码第64位氨基酸的位置上，对应氨基酸所用的密码子如下表所示，其余位置的核苷酸同相应的野生型编码序列。

本实施例提供的大豆GS1突变体G64X和编码它们的核酸分子均可以通过化学合成的方法获得。

实施例6

本实施例提供的玉米(Zea mays)GS1突变体，其由野生型玉米GS1自身(命名为ZmGS1-WT，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，编码核苷酸序列为SEQ ID NO.6)的第64位(对应于参考序列(SEQ ID NO.1)的第64位)由氨基酸残基P突变为X得到。得到的玉米GS1突变体命名为Z64X。

玉米GS1突变体Z64X和野生型玉米GS1的氨基酸序列比对如图7所示，图中：箭头所指示的位置为突变位点。

本实施例中，玉米GS1突变体的编码序列在编码第64位氨基酸的位置上，对应氨基酸所用的密码子如下表所示，其余位置的核苷酸同相应的野生型编码序列。

本实施例提供的玉米GS1突变体Z64X和编码它们的核酸分子均可以通过化学合成的方法获得。

实施例7

本实施例提供的油菜(Brassica napus)GS1突变体，其由野生型油菜GS1自身(命名为BnGS1-WT，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，编码核苷酸序列为SEQ ID NO.8)的第64位(对应于参考序列(SEQ ID NO.1)的第64位)由氨基酸残基P突变为A、D、F、M、Q、Y、W、X得到。得到的油菜GS1突变体分别命名为B64A、B64D、B64F、B64M、B64Q、B64Y、B64W、B64X。

油菜GS1突变体B64A、B64D、B64F、B64M、B64Q、B64Y、B64W、B64X和野生型油菜GS1的氨基酸序列比对如图8所示，图中：箭头所指示的位置为突变位点。

本实施例中，各油菜GS1突变体的编码序列在编码第64位氨基酸的位置上，对应氨基酸所用的密码子如下表所示，其余位置的核苷酸同相应的野生型编码序列。

本实施例提供的油菜GS1突变体B64A、B64D、B64F、B64M、B64Q、B64Y、B64W和B64X和编码它们的核酸分子均可以通过化学合成的方法获得。

实验例1

检测实施例1提供的水稻GS1突变体R55D、R55T和R55L的草铵膦抗性，方法如下：

根据实施例1提供的核酸分子的序列，采用化学合成的方法合成编码水稻GS1突变体R55D、R55T和R55L的编码基因，两端引入酶切位点(Pac1和Sbf1)，酶切后，在连接酶的作用下连接至经相同酶切处理后的表达载体(例如pADV7载体，其结构如图9所示)上，然后分别转化谷氨酰胺合成酶缺陷型大肠杆菌，经验证后，挑取阳性克隆，接种至含不同浓度草铵膦的M9培养基上生长，观察缺陷型大肠杆菌生长情况。以野生型水稻GS1突变体作为负对照，检测含有GS1突变体R55D(S55D，水稻GS1的第55位的氨基酸S突变为D)、R55T(S55T)和R55L(S55L)的草铵膦抗性。结果如图10所示。

在含0mM草铵膦(KP0)的培养基上，转化编码野生型水稻GS1(OsGS1-WT)及水稻GS1突变体R55D、R55T和R55L的编码基因的缺陷型菌株均能正常生长，表明由R55D、R55T和R55L编码的GS1都具有正常GS1酶活力；

在含1mM草铵膦(KP1)的培养基上，转化野生型水稻GS1的大肠杆菌不能生长，但转化了水稻突变体R55D、R55T和R55L的大肠杆菌生长明显优于负对照，说明含R55D、R55T和R55L的单突变体抗草铵膦的能力明显优于野生型；在更好草铵膦浓度(20mM，KP20)的培养基上，转化水稻GS1突变体R55D的大肠杆菌都还有明显生长。

这些结果说明R55D、R55T和R55L的单突变体都具有抗草铵膦的能力，且水稻GS1突变体R55D的抗草铵膦能力更强。

实验例2

参考实验例1的检测方法，验证实施例2提供的大豆GS1突变体G55D(S55D，大豆GS1的第55位的氨基酸S突变为D)的草铵膦抗性。结果如图11所示。

根据图11的结果可看出：

在含0mM草铵膦(KP0)的培养基上，转化编码野生型大豆GS1(GmGS1-WT)及大豆GS1突变体G55D的编码基因的缺陷型菌株均能正常生长，表明由G55D编码的GS1都具有正常GS1酶活力；

在含2mM草铵膦(KP2)的培养基上，转化野生型大豆GS1的大肠杆菌基本上不能生长，但转化了大豆突变体G55D大肠杆菌生长明显优于负对照，说明含G55D的单突变体抗草铵膦的能力明显优于野生型。

这些结果说明G55D的单突变体都具有抗草铵膦的能力。

实验例3

参考实验例1的检测方法，验证实施例3提供的玉米GS1突变体Z55D(S55D，玉米GS1的第55位的氨基酸S突变为D)的草铵膦抗性。结果如图12所示。

根据图12的结果可看出：

在含0mM草铵膦(KP0)的培养基上，转化编码野生型玉米GS1(ZmGS1-WT)及玉米GS1突变体Z55D的编码基因的缺陷型菌株均能正常生长，表明由Z55D编码的GS1都具有正常GS1酶活力；

在含2mM草铵膦(KP2)的培养基上，转化野生型玉米GS1的大肠杆菌基本上不能生长，但转化了玉米突变体Z55D的大肠杆菌生长明显优于负对照，说明含Z55D的单突变体抗草铵膦的能力明显优于野生型；在更高草铵膦浓度(10mM，KP10)的培养基上，转化玉米GS1突变体Z55D的大肠杆菌都还有明显生长。

这些结果说明Z55D的单突变体都具有抗草铵膦的能力。

实验例4

检测实施例1提供的R55D、实施例2提供的G55D、实施例3提供的Z55D突变体的酶动力学参数和在有草铵膦时的酶动力学参数，以野生型水稻GS1 OsGS1-WT、野生型大豆GS1GmGS1-WT、野生型玉米GS1 ZmGS1-WT为对照，方法如下：

载体构建：

将编码上述突变体的核酸序列克隆到原核表达载体pET32a中，测序验证克隆。

6His蛋白纯化：

通过6His和用标准方法纯化突变体酶蛋白，用Bradford法蛋白浓度测定试剂盒测定浓度，蛋白保存在蛋白贮存液中。

酶活测定：

1.仪器和试剂：酶标仪(德铁：HBS-1096A)，草铵膦，底物L-谷氨酸钠(CAS：6106-04-3)。

2.操作步骤：

谷氨酰胺合成酶酶活测定反应液组分为：100mM Tris-HCl(pH7.5)，5mM ATP，10mML-谷氨酸钠，30mM hydroxylamine，20mM MgCl

结果如图13所示。

根据图13的结果可以看出：

相对于野生型对照OsGS1-WT、GmGS1-WT和ZmGS1-WT，GS1突变体的Km值都较之略偏高，说明GS突变体在降低对草铵膦抑制剂的敏感度的同时，略为降低了对正常底物的敏感度。GS1突变体的V

实验例5

参考实验例1的检测方法，验证实施例4提供的水稻GS1突变体R64Q(P64Q，水稻GS1的第64位的氨基酸P突变为Q)、R64R(P64R)、R64S(P64S)、R64T(P64T)、R64V(P64V)、R64W(P64W)和R64X(P64X)的草铵膦抗性。结果如图14所示。

在含0mM草铵膦(KP0)的培养基上，转化编码野生型水稻GS1(OsGS1-WT)及水稻GS1突变体R64Q、R64R、R64S、R64T、R64V、R64W和R64X的编码基因的缺陷型菌株均能正常生长，表明由R64Q、R64R、R64S、R64T、R64V、R64W和R64X编码的GS1都具有正常GS1酶活力；

在含10mM草铵膦(KP10)的培养基上，转化野生型水稻GS1的大肠杆菌不能生长，但转化了水稻突变体R64Q、R64R、R64S、R64T、R64V、R64W和R64X的大肠杆菌生长明显优于负对照，说明含R64Q、R64R、R64S、R64T、R64V、R64W和R64X的单突变体抗草铵膦的能力明显优于野生型，这些结果说明R64Q、R64R、R64S、R64T、R64V、R64W和R64X的单突变体都具有抗草铵膦的能力。

实验例6

参考实验例1的检测方法，验证实施例5提供的大豆GS1突变体G64X(P64X，大豆GS1的第64位的氨基酸P突变为X)的草铵膦抗性。结果如图15所示。

根据图15的结果可看出：

在含0mM草铵膦(KP0)的培养基上，转化编码野生型大豆GS1(GmGS1-WT)及大豆GS1突变体G64X的编码基因的缺陷型菌株均能正常生长，表明由G64X编码的GS1都具有正常GS1酶活力；

在含2mM草铵膦(KP2)的培养基上，转化野生型大豆GS1的大肠杆菌基本上不能生长，但转化了大豆突变体G64X的大肠杆菌生长明显优于负对照，说明含G64X的单突变体抗草铵膦的能力明显优于野生型。这些结果说明G64X的单突变体都具有抗草铵膦的能力。

实验例7

参考实验例1的检测方法，验证实施例6提供的玉米GS1突变体Z64X(P64X，玉米GS1的第64位的氨基酸P突变为X)的草铵膦抗性。结果如图16所示。

根据图16的结果可看出：

在含0mM草铵膦(KP0)的培养基上，转化编码野生型玉米GS1(ZmGS1-WT)及玉米GS1突变体Z64X的编码基因的缺陷型菌株均能正常生长，表明由Z64X编码的GS1都具有正常GS1酶活力；

在含2mM草铵膦(KP2)的培养基上，转化野生型玉米GS1的大肠杆菌基本上不能生长，但转化了玉米突变体Z64X的大肠杆菌生长明显优于负对照，说明含Z64X的单突变体抗草铵膦的能力明显优于野生型；在高草铵膦浓度(5mM，KP5)的培养基上，转化玉米GS1突变体Z64X的大肠杆菌都还有明显生长。

这些结果说明Z64X的单突变体都具有抗草铵膦的能力。

实验例8

参考实验例1的检测方法，验证实施例7提供的油菜GS1突变体B64A(P64A，油菜GS1的第64位的氨基酸P突变为A)、B64D(P64D)、B64F、(P64F)、B64M(P64M)、B64Q(P64Q)、B64Y(P64Y)、B64W(P64W)、B64X(P64X)的草铵膦抗性。结果如图17所示。

根据图17的结果可看出：

在含0mM草铵膦(KP0)的培养基上，转化编码野生型油菜GS1(BnGS1-WT)及油菜GS1突变体B64A、B64D、B64F、B64M、B64Q、B64Y、B64W、B64X的编码基因的缺陷型菌株均能正常生长，表明由B64A、B64D、B64F、B64M、B64Q、B64Y、B64W、B64X编码的GS1都具有正常GS1酶活力；

在含1mM草铵膦(KP1)的培养基上，转化野生型油菜GS1的大肠杆菌基本上不能生长，但转化了油菜突变体B64A、B64D、B64F、B64M、B64Q、B64Y、B64W、B64X的大肠杆菌生长明显优于负对照，说明含B64A、B64D、B64F、B64M、B64Q、B64Y、B64W、B64X的单突变体抗草铵膦的能力明显优于野生型；在草铵膦浓度(5mM，KP5)的培养基上，转化油菜GS1突变体B64W、B64X的大肠杆菌都还有明显生长。

这些结果说明B64A、B64D、B64F、B64M、B64Q、B64Y、B64W、B64X的单突变体都具有抗草铵膦的能力，且油菜GS1突变体B64W、B64X的抗草铵膦能力强。

实验例9

参考实验例4的检测方法，检测实施例4提供的R64X、实施例5提供的G64X、实施例6提供的Z64X、实施例7提供的B64X突变体的酶动力学参数和在有草铵膦时的酶动力学参数，以野生型水稻GS1 OsGS1-WT、野生型大豆GS1 GmGS1-WT、野生型玉米GS1 ZmGS1-WT和野生型油菜GS1 BnGS1-WT为对照。结果如图18所示。

根据图18的结果可以看出：

相对于野生型对照OsGS1-WT、GmGS1-WT、ZmGS1-W和BnGS1-WT，GS1突变体的Km值都较之略偏高，说明GS突变体在降低对草铵膦抑制剂的敏感度的同时，略微降低了对正常底物的敏感度。水稻和大豆GS1突变体的V

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 四川天豫兴禾生物科技有限公司

<120> 一种获得具有草铵膦抗性的蛋白的方法及谷氨酰胺合成酶突变体

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 356

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Ala Ser Leu Thr Asp Leu Val Asn Leu Asn Leu Ser Asp Thr Thr

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50 55 60

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Trp Pro Val Gly Gly Phe Pro Gly Pro Gln Gly Pro Tyr Tyr Cys Gly

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Glu Arg Arg Leu Thr Gly Arg His Glu Thr Ala Asp Ile Asn Thr Phe

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Thr Glu Gln Asn Gly Lys Gly Tyr Phe Glu Asp Arg Arg Pro Ala Ser

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Asn Met Asp Pro Tyr Ile Val Thr Ser Met Ile Ala Glu Thr Thr Ile

340 345 350

Ile Trp Lys Pro

355

<210> 2

<211> 356

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

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Glu Lys Ile Ile Ala Glu Tyr Ile Trp Ile Gly Gly Ser Gly Met Asp

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Leu Arg Ser Lys Ala Arg Thr Leu Ser Gly Pro Val Thr Asp Pro Ser

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<210> 3

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<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Met Ser Leu Leu Ser Asp Leu Ile Asn Leu Asn Leu Ser Asp Thr Thr

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Glu Lys Val Ile Ala Glu Tyr Ile Trp Ile Gly Gly Ser Gly Met Asp

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Leu Trp Lys Pro

355

<210> 4

<211> 356

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Met Ser Leu Leu Thr Asp Leu Val Asn Leu Asn Leu Ser Glu Thr Thr

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Asp Lys Ile Ile Ala Glu Tyr Ile Trp Val Gly Gly Ser Gly Met Asp

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Met Arg Ser Lys Ala Arg Thr Leu Pro Gly Pro Val Ser Asp Pro Ser

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Trp Pro Ile Gly Gly Phe Pro Gly Pro Gln Gly Pro Tyr Tyr Cys Ser

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ccattcagga agggaaacaa catccttgtc atgtgcgatt gctacacgcc agccggagaa 300

ccgatcccca ccaacaagag gcacaatgct gccaagatct tcagctcccc tgaggttgct 360

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atcggcgccg aaaagtcgtt cggccgcgac atcgtggacg cccactacaa ggcctgcttg 540

tatgcgggca tcaacatcag tggcatcaac ggggaggtga tgccagggca gtgggagttc 600

caagtcgggc cttccgtggg tatatcttca ggcgaccagg tctgggtcgc tcgctacatt 660

cttgagagga tcacggagat cgccggtgtg gtggtgacgt tcgacccgaa gccgatcccg 720

ggcgactgga acggcgccgg cgcgcacacc aactacagca cggagtcgat gaggaaggag 780

ggcgggtacg aggtgatcaa ggcggccatc gagaagctga agctgcggca cagggagcac 840

atcgcggcat acggcgaggg caacgagcgc cggctcaccg gcaggcacga gaccgccgac 900

atcaacacgt tcagctgggg cgtggccaac cgcggcgcgt cggtgcgcgt gggccgggag 960

acggagcaga acggcaaggg ctacttcgag gaccgccgcc cggcgtccaa catggacccc 1020

tacgtggtca cctccatgat cgccgagacc accatcatct ggaagccctg a 1071

<210> 7

<211> 1071

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

atgtcgctgc tctcagatct catcaacctt aacctctcag acactactga gaaggtgatc 60

gcagagtaca tatggatcgg tggatcagga atggacctga ggagcaaagc aaggactctc 120

ccaggaccag ttagcgaccc ttcaaagctt cccaagtgga actatgatgg ttccagcaca 180

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gctgaagaga catggtatgg tattgagcag gaatacacct tgttgcagaa agatatccaa 420

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<210> 8

<211> 1071

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

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cctttccgta gaggcaacaa cattcttgtc atgtgcgatg cttacactcc agcgggcgaa 300

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ttggagagga tcacagagat tgctggtgtg gtggtatctt ttgacccaaa accgattccc 720

ggtgactgga atggtgctgg tgctcactgc aactatagta ccaagtcaat gagggaagat 780

ggtggttacg agattattaa gaaggcaatc gataaactgg gactgagaca caaagaacac 840

attgcagctt acggtgaagg caatgagcgc cgtctcacgg gtcaccacga gactgctgac 900

atcaacactt tcctctgggg tgttgcgaac cgtggagcat caatccgtgt aggacgtgac 960

acagagaaag aagggaaagg atactttgag gataggaggc cagcttcgaa catggatcct 1020

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