一种葛根总黄酮的含量测定方法

技术领域：

本发明属于中药材检测技术领域，具体涉及一种葛根总黄酮的含量测定方法。

背景技术：

葛根(PuerariaeLobataeRadix)是豆科植物野葛(PuerariaLobata(Willd)Ohwi)的干燥根。葛根中含有丰富的营养成分，《神农本草经》中记载葛根可“主消渴、身大热、呕吐、诸痹、起阴气、解诸毒”。现代医学研究表明其在心血管疾病的治疗中具有显著作用，也被应用于解酒、免疫调节、肝脏保护、抗糖尿病、抗肿瘤、抗病毒、抗炎等方面，是我国应用最为广泛的中药材之一。

现代科学研究证明，根中存在诸多化学成分，除淀粉外，还有异黄酮类、三萜类、香豆素类、皂苷类、生物碱类、多糖类及人体所必需的氨基酸和矿物质等。目前我国葛根种植地域众多，而各地种植的葛根药材的化学成分及含量均有差异，若化学成分和含量不能达到质量要求，势必会影响临床应用的安全性以及有效性。为确保中药使用的安全有效，对中药材进行准确可靠的质量检测是十分必要。

目前，《中国药典》仅制定了采用液相色谱对葛根中葛根素进行含量测定的方法，为了更好地控制药材质量，有必要对葛根中的主要药效成分总黄酮进行含量测定，以进一步有效地控制葛根质量，从而保证临床用药疗效。

发明内容：

本发明要解决的技术问题是提供一种葛根总黄酮的含量测定方法。该方法操作简便，试剂和设备成本低廉，测定葛根总黄酮稳定性好，便于推广。

本发明提供的技术方案是：

一种葛根总黄酮的含量测定方法，包括如下步骤：

(1)绘制标准曲线：精密称定葛根素对照品10mg，加溶剂制成80μg/mL的葛根素对照品母液，取适量对照品母液用溶剂稀释为浓度为1.60～22.40μg/mL的系列标准溶液，以溶剂为空白对照，在190～400nm用紫外-可见分光光度计测定吸光度，绘制标准曲线，得到线性回归方程；

(2)供试品溶液的制备：精密称取过三号筛的葛根药材粉末适量，置于具塞锥形瓶中，精密加入溶剂50ml，称定重量，提取15～45min，放冷，再称定重量，用溶剂补足减失重量，摇匀，滤过，精密吸取滤液0.5ml，置于50ml量瓶中，加溶剂至刻度，摇匀，即得；

(3)供试品的测定：在190～400nm用紫外-可见分光光度计测定步骤(2)所述供试品溶液的吸光度，根据线性回归方程计算样品中总黄酮的含量。

优选为，所述紫外-可见分光光度计的检测波长为250～350nm。

进一步优选为，所述紫外-可见分光光度计的检测波长为250nm。

本发明所用溶剂为水或30％～95％乙醇。

优选为，溶剂为30％～75％乙醇。

进一步优选为，溶剂为30％乙醇。

上述步骤(2)中，所述提取方法为加热回流或超声提取。

优选为，步骤(2)中，提取方法为加热回流，提取时间为30min。

优选为，步骤(1)中，所述系列标准溶液浓度分别为1.6μg/mL,3.2μg/mL,4.8μg/mL,6.4μg/mL,8.0μg/mL,9.6μg/mL,12.8μg/mL,16.0μg/mL,19.2μg/mL,22.4μg/mL。

本发明的线性回归方程为y＝0.0709255x+0.00378142，R

本发明有益效果如下：

1、本发明提供了一种葛根总黄酮的含量测定方法，在《中国药典》制定的葛根中葛根素含量测定的基础上，增加了对葛根中总黄酮的含量测定，进一步完善了葛根药材的质量检测内容，对葛根药材及相关中成药质量检测标准具有重要意义；

2、本发明葛根总黄酮的检测方法经方法学验证结果表明：总黄酮(以葛根素计)在1.60～22.40μg/mL浓度范围内与吸光度线性关系良好，线性方程为y＝0.0709255x+0.00378142，R

3、通过本发明的方法对不同地区的葛根中总黄酮(以葛根素计)进行测定，实验结果显示葛根素回收率范围为92％～105％，表明回收率良好。

4、本发明采用紫外-可见分光光度计对葛根中的总黄酮含量进行测定，该方法操作简便，试剂和设备成本低廉，测定葛根总黄酮稳定性好，便于推广。

附图说明

图1为葛根总黄酮专属性考察结果；

图2为葛根素标准曲线图。

具体实施方式：

下面通过具体实施例对本发明做进一步的说明，但不用于限制本发明的保护范围。

实施例1：

(1)绘制标准曲线：精密称定葛根素对照品10mg，加30％乙醇制成80μg/mL的葛根素对照品母液，取适量对照品母液用30％乙醇稀释为浓度为1.6μg/mL,3.2μg/mL,4.8μg/mL,6.4μg/mL,8.0μg/mL,9.6μg/mL,12.8μg/mL,16.0μg/mL,19.2μg/m L,22.4μg/mL的系列标准溶液，以30％乙醇为空白对照，在250nm用紫外-可见分光光度计测定吸光度，绘制标准曲线，得到线性回归方程；

(2)供试品溶液的制备：精密称取过三号筛的葛根药材粉末适量，置于具塞锥形瓶中，精密加入30％乙醇50ml，称定重量，加热回流提取30min，放冷，再称定重量，用30％乙醇补足减失重量，摇匀，滤过，精密吸取滤液0.5ml，置于50ml量瓶中，加30％乙醇至刻度，摇匀，即得；

(3)供试品的测定：在250nm用紫外-可见分光光度计测定步骤(2)所述供试品溶液的吸光度，根据线性回归方程计算样品中总黄酮的含量。

实施例2：

(1)绘制标准曲线：精密称定葛根素对照品10mg，加水制成80μg/mL的葛根素对照品母液，取适量对照品母液用水稀释为浓度为1.6μg/mL,

3.2μg/mL,4.8μg/mL,6.4μg/mL,8.0μg/mL,9.6μg/mL,12.8μg/mL,16.0μg/mL,19.2μg/m L,22.4μg/mL的系列标准溶液，以水为空白对照，在190nm用紫外-可见分光光度计测定吸光度，绘制标准曲线，得到线性回归方程；

(2)供试品溶液的制备：精密称取过三号筛的葛根药材粉末适量，置于具塞锥形瓶中，精密加入水50ml，称定重量，加热回流提取15min，放冷，再称定重量，用水补足减失重量，摇匀，滤过，精密吸取滤液0.5ml，置于50ml量瓶中，加水至刻度，摇匀，即得；

(3)供试品的测定：在190nm用紫外-可见分光光度计测定步骤(2)所述供试品溶液的吸光度，根据线性回归方程计算样品中总黄酮的含量。

实施例3：

(1)绘制标准曲线：精密称定葛根素对照品10mg，加50％乙醇制成80μg/mL的葛根素对照品母液，取适量对照品母液用50％乙醇稀释为浓度为1.6μg/mL,3.2μg/mL,4.8μg/mL,6.4μg/mL,8.0μg/mL,9.6μg/mL,12.8μg/mL,16.0μg/mL,19.2μg/m L,22.4μg/mL的系列标准溶液，以50％乙醇为空白对照，在300nm用紫外-可见分光光度计测定吸光度，绘制标准曲线，得到线性回归方程；

(2)供试品溶液的制备：精密称取过三号筛的葛根药材粉末适量，置于具塞锥形瓶中，精密加入50％乙醇50ml，称定重量，加热回流提取30min，放冷，再称定重量，用50％乙醇补足减失重量，摇匀，滤过，精密吸取滤液0.5ml，置于50ml量瓶中，加50％乙醇至刻度，摇匀，即得；

(3)供试品的测定：在300nm用紫外-可见分光光度计测定步骤(2)所述供试品溶液的吸光度，根据线性回归方程计算样品中总黄酮的含量。

实施例4：

(1)绘制标准曲线：精密称定葛根素对照品10mg，加稀乙醇制成80μg/mL的葛根素对照品母液，取适量对照品母液用稀乙醇稀释为浓度为1.6μg/mL,3.2μg/mL,4.8μg/mL,6.4μg/mL,8.0μg/mL,9.6μg/mL,12.8μg/mL,16.0μg/mL,19.2μg/m L,22.4μg/mL的系列标准溶液，以稀乙醇为空白对照，在350nm用紫外-可见分光光度计测定吸光度，绘制标准曲线，得到线性回归方程；

(2)供试品溶液的制备：精密称取过三号筛的葛根药材粉末适量，置于具塞锥形瓶中，精密加入稀乙醇50ml，称定重量，加热回流提取45min，放冷，再称定重量，用稀乙醇补足减失重量，摇匀，滤过，精密吸取滤液0.5ml，置于50ml量瓶中，加稀乙醇至刻度，摇匀，即得；

(3)供试品的测定：在350nm用紫外-可见分光光度计测定步骤(2)所述供试品溶液的吸光度，根据线性回归方程计算样品中总黄酮的含量。

实施例5：

(1)绘制标准曲线：精密称定葛根素对照品10mg，加75％乙醇制成80μg/mL的葛根素对照品母液，取适量对照品母液用75％乙醇稀释为浓度为1.6μg/mL,3.2μg/mL,4.8μg/mL,6.4μg/mL,8.0μg/mL,9.6μg/mL,12.8μg/mL,16.0μg/mL,19.2μg/m L,22.4μg/mL的系列标准溶液，以75％乙醇为空白对照，在400nm用紫外-可见分光光度计测定吸光度，绘制标准曲线，得到线性回归方程；

(2)供试品溶液的制备：精密称取过三号筛的葛根药材粉末适量，置于具塞锥形瓶中，精密加入75％乙醇50ml，称定重量，加热回流提取30min，放冷，再称定重量，用75％乙醇补足减失重量，摇匀，滤过，精密吸取滤液0.5ml，置于50ml量瓶中，加75％乙醇至刻度，摇匀，即得；

(3)供试品的测定：在400nm用紫外-可见分光光度计测定步骤(2)所述供试品溶液的吸光度，根据线性回归方程计算样品中总黄酮的含量。

实施例6：

(1)绘制标准曲线：精密称定葛根素对照品10mg，加95％乙醇制成80μg/mL的葛根素对照品母液，取适量对照品母液用95％乙醇稀释为浓度为1.6μg/mL,3.2μg/mL,4.8μg/mL,6.4μg/mL,8.0μg/mL,9.6μg/mL,12.8μg/mL,16.0μg/mL,19.2μg/m L,22.4μg/mL的系列标准溶液，以95％乙醇为空白对照，在250nm用紫外-可见分光光度计测定吸光度，绘制标准曲线，得到线性回归方程；

(2)供试品溶液的制备：精密称取过三号筛的葛根药材粉末适量，置于具塞锥形瓶中，精密加入95％乙醇50ml，称定重量，加热回流提取30min，放冷，再称定重量，用95％乙醇补足减失重量，摇匀，滤过，精密吸取滤液0.5ml，置于50ml量瓶中，加95％乙醇至刻度，摇匀，即得；

(3)供试品的测定：在250nm用紫外-可见分光光度计测定步骤(2)所述供试品溶液的吸光度，根据线性回归方程计算样品中总黄酮的含量。

实施例7-12：

分别按实施例1-6的方法检测葛根总黄酮含量，区别在于，用超声提取替换加热回流。

实验例：

1、供试品溶液前处理方法考察

对葛根总黄酮含量测定方法的提取溶剂、提取方式以及提取时间进行考察，确定样品前处理方法。

1.1提取溶剂考察

取葛根药材粉末(样品批次：JY2021K001)适量，精密称定，平行4组，每组2份，置具塞锥形瓶中，分别精密加入水、30％乙醇、稀乙醇、50％乙醇、75％乙醇、95％乙醇50ml，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用相应溶剂补足减失重量，摇匀，滤过，精密吸取滤液0.5ml，置50ml量瓶中，加相应溶剂至刻度，摇匀，即得。分别取供试品溶液和对照品溶液，以相应溶剂为空白，照紫外-可见分光光度法(通则0401)，在250nm波长处测定吸光度，计算，即得。实验结果见表1。

表1不同提取溶剂葛根总黄酮含量测定结果

实验结果表明：通过对比4种提取溶剂样品中总黄酮含量，可发现30％乙醇对葛根中总黄酮的提取率较高，故选择30％乙醇作为葛根总黄酮含量测定的最佳提取溶剂。

1.2提取方式考察

取葛根药材粉末(过三号筛)适量，精密称定，平行2组，每组2份，置具塞锥形瓶中，分别精密加入30％乙醇50ml，称定重量，分别超声处理(功率250W，频率40kHz)60分钟，加热回流60分钟，放冷，再称定重量，分别用30％乙醇补足减失重量，摇匀，滤过，精密吸取滤液0.5ml，置50ml量瓶中，加30％乙醇至刻度，摇匀，即得。分别取供试品溶液和对照品溶液，以30％乙醇为空白，照紫外-可见分光光度法(通则0401)，在250nm波长处测定吸光度，计算，即得。实验结果见表2。

表2不同提取方式葛根总黄酮含量测定结果

实验结果表明：通过对比超声与回流两种提取方式的总黄酮含量，发现提取方式为加热回流时总黄酮含量最高，故选择加热回流为最佳提取方式。

1.3提取时间考察

取葛根药材粉末(过三号筛)适量，精密称定，平行3组，每组2份，置具塞锥形瓶中，分别精密加30％乙醇50ml，称定重量，分别加热回流15分钟、30分钟、45分钟，放冷，再称定重量，分别用30％乙醇补足减失重量，摇匀，滤过，精密吸取滤液0.5ml，置50ml量瓶中，加30％乙醇至刻度，摇匀，即得。分别取供试品溶液和对照品溶液，以30％乙醇为空白，照紫外-可见分光光度法(通则0401)，在250nm波长处测定吸光度，计算，即得。实验结果见表3。

表3不同提取时间葛根总黄酮含量测定结果

实验结果表明：通过对比不同加热回流时间的总黄酮含量，发现加热回流30min效果最好，故选择30min为最佳加热回流提取时间。

1.4供试品溶液制备方法的确定

根据样品前处理考察实验结果，确定供试品最佳制备方法可确定为：

取葛根药材粉末(过三号筛)适量，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加30％乙醇50ml，称定重量，加热回流30分钟，放冷，再称定重量，用30％乙醇补足减失重量，摇匀，滤过，精密吸取滤液0.5ml，置50ml量瓶中，加30％乙醇至刻度，摇匀，即得。

2、本发明葛根总黄酮含量测定方法学验证试验

2.1专属性考察

精密吸取本发明葛根总黄酮供试品溶液、葛根素对照品溶液与空白溶剂，在190nm～400nm进行全波长扫描。结果见图1。

实验结果表明：葛根总黄酮供试品溶液与葛根素对照品溶液在250nm处均有最大吸收，但空白溶剂在此处无干扰，故以本法测定葛根中总黄酮(以葛根素计)的含量具有专属性。

2.2线性考察

精密称定葛根素对照品10mg，加30％乙醇(溶剂)制成80μg/mL的葛根素对照品溶液母液。

标准曲线的制备：分别将上述母液稀释为浓度1.6μg/mL,3.2μg/mL,4.8μg/mL，6.4μg/mL,8.0μg/mL,9.6μg/mL,12.8μg/mL,16.0μg/mL,19.2μg/mL,22.4μg/mL的标准溶液，以30％乙醇溶为空白，照紫外-可见分光光度法(通则0401)，在250nm的波长处分别测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，结果见表4、同时绘制标准曲线，标准曲线见图2。

表4葛根素线性考察结果

本发明线性回归方程为：y＝0.0709255x+0.00378142，R

2.3精密度考察

按照本发明的供试品制备方法，制备供试品溶液并测定，连续测定6次吸光度，经测定，精密度RSD为0.02％，结果表明仪器精密度良好，测定结果见表5。

表5精密度考察结果

2.4稳定性考察

按照“1.2.1.1”项下确定的供试品制备方法，制备供试品溶液并测定，分别在0，15，30，60，120，180分钟测定吸光度，经测定，稳定性RSD为1.10％，供试品溶液在180分钟内稳定，测定结果见表6。

表6稳定性考察结果

2.5重复性考察

取同一批葛根药材粉末约0.1g，精密称定，平行称定6份，按照“1.2.1.1”项下确定的供试品制备方法，制备供试品溶液及测定，测定供试品溶液中总黄酮含量，经测定，重复性RSD为1.79％，本发明的分析方法的重复性良好，测定结果见表7。

表7重复性考察结果

2.6总黄酮含量范围实验

按照本发明的供试品制备方法，测定不同产地葛根总黄酮含量，结果见表8。

表8贵州不同产地葛根总黄酮含量测定结果

本研究中，总黄酮的含量范围实验为含量的最大值和含量的最小值。根据不同产地葛根总黄酮含量测定结果可得：葛根黄酮含量最高批次为J22K0012，含量为21.58％，葛根黄酮含量最低批次为J22K0030，含量为0.92％。2020版中国药典要求本品按干燥品计算，含葛根素(C

2.6.1含量最大值

(1)重复性实验

取同一批葛根总黄酮含量最高的葛根药材粉末约0.1g(批号：J22K0012)，精密称定，按本发明的供试品溶液制备方法，制备供试品溶液6份。测定250nm条件下供试品溶液中总黄酮含量，计算RSD，测定结果见表9。

表9重复性考察结果

实验结果表明该分析方法的重复性良好。

(2)准确度实验

取已知含量的样品(批号：J22K0012，含量：20.15％)约0.1g，精密称定，每份加入约1/3倍量的葛根素对照品，按本发明的供试品溶液制备方法，制备供试品溶液6份。测定250nm条件下供试品溶液中总黄酮含量，计算RSD，并按以下列公式计算回收率及RSD，结果见表10。

表10准确度试验

实验结果显示葛根素回收率为94.82％，根据《中国药典》2020版四部“药品质量标准分析方法验证指导原则”规定样品中待测成分含量为10％时，回收率限度为92％～105％，表明回收率良好。

2.6.2含量最小值

(1)重复性实验

取同一批含量最低的葛根药材粉末(批号：JY2021K001，)0.1g，精密称定，按本发明的供试品溶液制备方法，制备供试品溶液6份。测定250nm条件下供试品溶液中总黄酮含量，计算RSD，测定结果见表11。

表11重复性考察结果

实验结果表明该分析方法的重复性良好。

(2)准确度实验

取已知含量的样品(批号：JY2021K001)0.1g，精密称定，每份加入0.5倍量葛根素对照品，按本发明的供试品溶液制备方法，制备供试品溶液6份。测定250nm条件下供试品溶液中总黄酮含量，计算RSD，并按以下列公式计算回收率及RSD，结果见表12。

表12准确度试验

实验结果显示葛根素回收率为102.29％，根据《中国药典》2020版四部“药品质量标准分析方法验证指导原则”规定样品中待测成分含量为10％时，回收率限度为92％～105％，表明回收率良好。

本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。应当理解，本领域技术人员在本发明提供的技术方案的基础上，通过合乎逻辑地分析、推理或者有限的试验得到的技术方案，均在本发明所附权利要求的保护范围内。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求的内容为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。