一株具有降胆固醇、抑菌作用的戊糖片球菌及其高密度工业生产发酵培养基

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一株具有降胆固醇、抑菌作用的戊糖片球菌及其高密度工业生产发酵培养基。

背景技术

高脂血症是由机体内脂代谢平衡被破坏从而导致血脂高于平均水平的代谢性疾病。经世界卫生组织调查研究，动脉粥样硬化及冠心病等疾病发作的主要因素是高脂血症。相关报道指出，如果机体内的胆固醇水平高于正常平均水平1mmol/L，就会有35％的概率患冠状动脉心脏病。数据显示，由高脂血症及其相关疾病引起的死亡率占全世界死亡率的二分之一。

调节机体血液中的胆固醇水平主要采用药物阻止内源胆固醇的自身合成、通过饮食调整减少外源胆固醇的吸收和促进胆固醇的外排来实现。上世纪七八十年代，国外开始对益生菌降血脂展开研究。国内针对降血脂功能研究比较深入的两个菌株同属于植物乳杆菌，分别是L.plantarum P8和ST-III。动物实验表明，L.plantarum P8和ST-III这两株菌均具有显著的降血脂作用。因此，开发安全、有效调节血脂平衡的乳酸菌在食品和医药领域具有广阔的前景。戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)作为一种动物肠道微生物的固有菌种，通过自身繁殖抑制病原菌增殖，提高机体抗病能力和免疫功能。但现有生产工艺生产的戊糖片球菌活菌数不高且生产成本高，直接影响其使用效果和应用推广。因此，戊糖片球菌的发酵生产有待进一步发展。

发明内容

本发明针对现有技术中戊糖片球菌活菌数低、生产成本高的不足和缓解国内高血脂人群日益增长的严峻形势，提供一种具有降胆固醇兼且具有广谱抑菌效果的戊糖片球菌和其高密度工业生产发酵培养基，利用该培养基，能够获得较高密度菌体量，其发酵后的活菌数比MRS培养基显著高，提高了戊糖片球菌活菌数，降低了生产发酵成本。

本发明的第一个目的是提供一株戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)PG-2，其保藏编号为：GDMCC No：62392。

所述戊糖片球菌PG-2来源于亚洲小爪水獭粪便。肉眼观察菌落形态，菌落呈乳白色、表面光滑、边缘整齐、不透明；革兰氏染色呈紫色，为革兰氏阳性菌，在显微镜下观察菌体形状为圆形。戊糖片球菌PG-2的16S rRNA序列长度为1356bp，具体序列如SEQ ID NO.1所示，鉴定为戊糖片球菌，将其命名为戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)PG-2。

本发明的第二个目的是提供一种制剂，含有上述的戊糖片球菌PG-2或其发酵液作为活性成分。

本发明的第三个目的是提供上述的戊糖片球菌PG-2或制剂在以下(1)-(4)至少一项中的应用：

(1)防治病原菌；

(2)制备降胆固醇的药品或保健品；

(3)制备动物饲料或饲料添加剂；

(4)制备食品或食品添加剂。

优选地，所述的病原菌包括有金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠杆菌(Escherichia coli)、肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis)。

本发明的第四个目的是提供一种戊糖片球菌的高密度工业生产发酵培养基，所述发酵培养基含有甘蔗糖蜜液30-40g/L，玉米浆干粉20-25g/L，磷酸氢二钾1.5g/L，乙酸钠5g/L，Tween80 1mL/L，柠檬酸三铵2g/L，七水硫酸镁0.2g/L，四水硫酸锰0.05g/L，溶剂为水。

优选地，所述发酵培养基含有甘蔗糖蜜液40g/L，玉米浆干粉20g/L，磷酸氢二钾1.5g/L，乙酸钠5g/L，Tween80 1mL/L，柠檬酸三铵2g/L，七水硫酸镁0.2g/L，四水硫酸锰0.05g/L，溶剂为水。

本发明的第五个目的是提供上述的高密度工业生产发酵培养基在高效发酵戊糖片球菌中的应用。

本发明的第六个目的是提供一种高效发酵戊糖片球菌的方法，是将上述的戊糖片球菌PG-2接种于上述的高密度工业生产发酵培养基中进行发酵培养。

优选地，包括以下步骤：将保存的戊糖片球菌PG-2在MRS琼脂培养基平板上活化，挑取单菌落接种于MRS液体培养基中进行培养后，将菌液转接于高密度工业生产发酵培养基中进行发酵培养。

优选地，所述的挑取单菌落接种于MRS液体培养基中进行培养，其培养条件为：37℃培养14小时；所述的转接，是将菌液按体积分数1％的接种量进行转接；所述的发酵培养，其培养条件为：37℃发酵48小时。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明的戊糖片球菌PG-2能产生抗菌类抑菌物质，对常见畜禽水产养殖病原菌有很好的抑菌效果，包括对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、肠炎沙门氏菌都有较好的抑制作用，且同时具有优良的降胆固醇效果，胆固醇清除率高达(40.66±0.25)％；

(2)本发明的戊糖片球菌PG-2高密度工业生产发酵培养基，适用于大规模发酵戊糖片球菌。采用工业副产物甘蔗糖蜜作为碳源、玉米浆干粉作为主要氮源培养戊糖片球菌，降低了生产成本，并且有利于戊糖片球菌的快速生长，其发酵后的活菌数比MRS培养基显著提高。

本发明的戊糖片球菌Pediococcus pentosaceus PG-2，于2022年4月18日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编为：510070，保藏编号为：GDMCC No：62392。

附图说明

图1为本发明戊糖片球菌PG-2菌落形态图。

图2为本发明戊糖片球菌PG-2在显微镜下形态图。

图3为本发明戊糖片球菌PG-2发酵液离心后的上清液对3种病原菌抑制效果的柱形示意图和抑菌图片。

图4为单一无机盐对戊糖片球菌PG-2活菌数的影响。

图5为多种无机盐对戊糖片球菌PG-2活菌数的影响。

具体实施方式

以下是对本发明的内容结合实施案例进行进一步的阐述，但不是对本发明的限制。以下实施例中，如无特殊说明，所有耗材、仪器等相关用品和检测方法均为常规的。

实施例1：戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)PG-2的分离纯化、鉴定及保藏

(1)戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)PG-2的分离、筛选与保存

本发明的戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)PG-2是从亚洲小爪水獭粪便中分离得到。

MRS琼脂培养基：酪蛋白酶消化物10g、牛肉膏粉10g、酵母膏粉4g，葡萄糖20g，磷酸氢二钾2g，柠檬酸三铵2g，乙酸钠5g，七水硫酸镁0.2g，四水硫酸锰0.05g，吐温-801.08g，琼脂15g，将上述成分混合加水定容至1000mL，调pH至5.7±0.2，分装至250mL三角瓶中，每瓶100mL；于121℃高温高压灭菌20min，倒平板。

将亚洲小爪水獭粪便采用稀释涂布法涂布到含MRS琼脂培养基的平板上，经纯化获得菌株PG-2。肉眼观察菌落形态，结果见图1。菌落呈乳白色、表面光滑、边缘整齐、不透明；革兰氏染色呈紫色，为革兰氏阳性菌；在显微镜下观察菌体形状为圆形(图2)。

提取菌株PG-2的基因组DNA，用细菌16S rRNA基因扩增通用引物27F/1492R(27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’和1492R：5’-TACGACTTAACCCCAATCGC-3’)扩增得到PCR产物，并送至上海美吉生物医药科技有限公司(广州分公司)进行序列测序，测序后得到的16SrRNA序列长度为1356bp，具体序列如SEQ ID NO.1所示。将测序结果与EzBioCloud数据库中的16S rRNA序列进行同源性比对分析，结合形态学观察，初步鉴定分离得到的菌株PG-2是戊糖片球菌。将其命名为：戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)PG-2。该菌株于2022年4月18日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510070，保藏编号为GDMCC No：62392。

戊糖片球菌PG-2的16S rRNA序列(SEQ ID NO.1)具体如下所示：

GGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCGTGTAGGCGAGTTGCAGCCTACAGTCCGAACTGAGAATGGTTTTAAGAGATTAGCTTAACCTCGCGGTCTCGCGACTCGTTGTACCATCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCGTCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTCACTAGAGTGCCCAACTTAATGCTGGCAACTAGTAATAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCATTCTGTCCCCGAAGGGAACCTCTAATCTCTTAGACTGTCAGAAGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTAGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCTTTTGAGTTTCAACCTTGCGGTCGTACTCCCCAGGCGGATTACTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTGAAGGGCGGAAACCCTCCAACACTTAGTAATCATCGTTTACGGCATGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTACCCATGCTTTCGAGCCTCAGCGTCAGTTGCAGACCAGACAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCTTCCATATATCTACGCATTTCACCGCTACACATGGAGTTCCACTGTCCTCTTCTGCACTCAAGTCTCCCAGTTTCCAATGCACTTCTTCGGTTGAGCCGAAGGCTTTCACATTAGACTTAAAAGACCGCCTGCGCTCGCTTTACGCCCAATAAATCCGGATAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTAAATACCGTCACTGGGTAAACAGTTACTCTTACCCACGTTCTTCTTTAACAACAGAGCTTTACGAGCCGAAACCCTTCTTCACTCACGCGGCGTTGCTCCATCAGACTTGCGTCCATTGTGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAATGTGGCCGATTACCCTCTCAGGTCGGCTACGTATCACTGCCTTGGTGAGCCTTTACCTCACCAACTAGCTAATACGCCGCGGGTCCATCCAGAAGTGATAGCAGAGCCATCTTTTAAAAGAAAACCATGCGGTTTTCTCTGTTATACGGTATTAGCATCTGTTTCCAGGTGTTATCCCCTACTTCTGGGCAGGTTACCCACGTGTTACTCACCCGTTCGCCACTCACTTCGTGTTAAAATCTCAATCAGTACAAGTACG。

实施例2：戊糖片球菌PG-2抑菌效果测定

(1)供试菌上清液制备：将活化好的戊糖片球菌PG-2按照体积分数5％的接种量转接到MRS液体培养基(除了没有添加琼脂，配方与MRS琼脂培养基相同)中，置于37℃三气培养箱中培养18h，三气培养箱中的氧气含量为5％，二氧化碳含量为10％；培养液离心后取上清液，置于4℃中备用。

(2)含菌平板制作：将供试菌株转接到营养肉汤培养基(配方：蛋白胨10.0g/L，牛肉膏粉3.0g/L，氯化钠5.0g/L，pH 7.4±0.2，溶剂为水)中，在30℃恒温培养箱中培养(如下表1)，用紫外分光光度计调节OD

(3)抑菌试验

吸取戊糖片球菌PG-2离心后的上清菌液100μL分别加入到各个含供试病原菌平板的孔中，每组三个重复，置于30℃培养箱中培养约24h后，观察抑菌效果，并测量抑菌圈直径(结果见图3)。

表1.戊糖片球菌PG-2抑菌效果试验的供试菌株

从图3可以看出，本发明戊糖片球菌PG-2的上清菌液对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、肠炎沙门氏菌都有较好的抑制作用。

实施例3：戊糖片球菌PG-2产BSH酶活力的测定

(1)牛磺酸标准曲线的绘制

标准曲线是以牛磺酸的浓度(μmol/mL)为横坐标，吸光值(A570 nm)为纵坐标，制得牛磺酸的标准曲线为：y＝0.2286x-0.0041，R

(2)样品的制备与测定

将本发明戊糖片球菌PG-2活化3次后，按体积分数3％的接种量接种到MRS液体培养基中，37℃培养24h，取适量的发酵液进行离心，收集菌体。将菌体用0.1mol/L(pH7.0)的磷酸盐缓冲液洗涤2次，在600nm下调整其吸光度为1.0，加入二硫苏糖醇防止胆盐水解酶(BSH)氧化。取调整后的菌液1mL超声破碎，离心得到无细胞提取液。取10μL无细胞提取液，加入180μL0.1mol/L的磷酸盐缓冲液、10μL 200mmol/L的牛磺胆酸钠和10μL的石蜡油，混匀置于37℃反应30min，加入相同体积的三氯乙酸终止反应，混匀后离心取上清液。取0.1mL上清液和1.9mL茚三酮显色液混合，沸水加热14min用自来水冷却，用酶标仪在570nm下测定其吸光值。阳性对照菌株采用植物乳杆菌GDMCC1.140。

BSH粗酶活的定义：单位时间和单位体积内，粗酶水解结合胆盐产生氨基酸的物质的量，单位是μmol/(h·mL)。BSH可以水解结合胆盐生成氨基酸和游离胆汁酸，游离胆汁酸可以和胆固醇形成复合体排出体外，从而降低血液中胆固醇的含量。因此，BSH可以作为降解胆固醇菌株筛选的重要指标。

结果表明，产BSH的戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)PG-2的粗酶活高达0.75μmol/(h·mL)，阳性对照植物乳杆菌GDMCC1.140的粗酶活是0.70μmol/(h·mL)，说明戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)PG-2具备高效降胆固醇的潜力。

实施例4：戊糖片球菌PG-2胆固醇去除效果的测定

(1)胆固醇标准曲线的绘制

标准曲线是以胆固醇的浓度(mg/mL)为横坐标，吸光值(A500 nm)为纵坐标，制得胆固醇标准曲线为：y＝24.393x-0.0125，R

(2)样品的制备与测定

将本发明戊糖片球菌PG-2活化3次后，按体积分数3％的接种量接种到含有胆固醇的MRS培养基(MRS-CHOL培养基)中，37℃培养24h，取1mL发酵液离心，得到上清液，再采用邻苯二甲醛法测定其胆固醇的含量，根据以下公式计算不同菌株胆固醇的去除率。MRS-CHOL培养基是在MRS液体培养基中添加3％胆盐和1％胆固醇。阳性对照菌株采用植物乳杆菌GDMCC1.140。

式中，A为接种前培养基中胆固醇的浓度；B为接种发酵后培养基中胆固醇的浓度。

结果表明，戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)PG-2的胆固醇清除率高达(40.66±0.25)％，阳性对照植物乳杆菌GDMCC1.140的胆固醇清除率为45％，说明戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)PG-2具有高效的降胆固醇能力。本发明菌株PG-2可应用于具有降解胆固醇作用功能的产品例如饲料添加剂。

实施例5：培养基中无机盐发酵单因素试验结果对比

发酵培养基各质量组分组成：

培养基1：MRS液体培养基；

培养基2：甘蔗糖蜜液40g/L，玉米浆干粉20g/L，磷酸氢二钾1.5g/L，乙酸钠5g/L，Tween801mL/L，柠檬酸三铵2g/L，七水硫酸镁0.2g/L，四水硫酸锰0.05g/L，溶剂为水；

培养基3：甘蔗糖蜜液40g/L，玉米浆干粉20g/L，溶剂为水；

培养基4：甘蔗糖蜜液40g/L，玉米浆干粉20g/L，磷酸氢二钾1.5g/L，溶剂为水；

培养基5：甘蔗糖蜜液40g/L，玉米浆干粉20g/L，乙酸钠5g/L，溶剂为水；

培养基6：甘蔗糖蜜液40g/L，玉米浆干粉20g/L，Tween80 1mL/L，溶剂为水；

培养基7：甘蔗糖蜜液40g/L，玉米浆干粉20g/L，柠檬酸三铵2g/L，溶剂为水；

培养基8：甘蔗糖蜜液40g/L，玉米浆干粉20g/L，七水硫酸镁0.2g/L，溶剂为水；

培养基9：甘蔗糖蜜液40g/L，玉米浆干粉20g/L，四水硫酸锰0.05g/L，溶剂为水；

上述培养基的pH均为6.0。

上述培养基的配制方法是：将上述培养基对应的各成分混合均匀，使用蒸馏水溶解，将配置好的培养基装入250mL三角瓶中，搅拌均匀，于115℃高温高压灭菌20min。

为达到培养基的最佳效果，使用上述的培养基发酵戊糖片球菌时，发酵过程如下：

(1)将冷冻保存的戊糖片球菌PG-2在MRS琼脂培养基平板(成分及制备方法同实施例1)上活化，挑取单菌落接种于含MRS液体培养基的试管，37℃培养14小时左右，直至液体培养基出现明显的浑浊，获得种子培养液；

(2)按照培养基配方，配制以上9种发酵培养基各50mL装入250mL三角瓶中，灭菌后将温度降至37℃；

(3)按体积分数1％的接种量将得到的种子培养液接种于装有不同发酵培养基的三角瓶中；每组3个重复。

(4)发酵条件设定为：温度37℃，发酵48小时，将发酵完成后的发酵液进行稀释涂布。

使用上述9种发酵培养基进行发酵培养得到的菌液的活菌数结果见图4。图4结果显示：戊糖片球菌PG-2在培养基2中的活菌数最高，其次是培养基1和培养基7。由于培养基7的活菌数显著高于基础培养基3，因此选择培养基7作为优化后的发酵培养基。

实施例6：培养基中多种无机盐发酵因素试验结果对比

发酵培养基各质量组分组成：

培养基1：MRS液体培养基；

培养基2：甘蔗糖蜜液40g/L，玉米浆干粉20g/L，磷酸氢二钾1.5g/L，乙酸钠5g/L，Tween801mL/L，柠檬酸三铵2g/L，七水硫酸镁0.2g/L，四水硫酸锰0.05g/L，溶剂为水；

培养基3：甘蔗糖蜜液40g/L，玉米浆干粉20g/L，溶剂为水；

培养基4：甘蔗糖蜜液40g/L，玉米浆干粉20g/L，柠檬酸三铵2g/L，磷酸氢二钾1.5g/L，溶剂为水；

培养基5：甘蔗糖蜜液40g/L，玉米浆干粉20g/L，柠檬酸三铵2g/L，Tween80 1mL/L，溶剂为水；

培养基6：甘蔗糖蜜液40g/L，玉米浆干粉20g/L，柠檬酸三铵2g/L，七水硫酸镁0.2g/L，溶剂为水；

培养基7：甘蔗糖蜜液40g/L，玉米浆干粉20g/L，柠檬酸三铵2g/L，四水硫酸锰0.05g/L，溶剂为水；

培养基8：甘蔗糖蜜液40g/L，玉米浆干粉20g/L，柠檬酸三铵2g/L，溶剂为水；

上述培养基的pH均为6.0。每组3个重复。

培养基配制方法以及发酵过程同实施例5。

使用上述8种发酵培养基进行发酵培养得到的菌液的活菌数结果见图5。图5结果显示：戊糖片球菌PG-2在培养基2中的活菌数最高，其次是培养基1和培养基4。其中培养基1和培养基2的活菌数明显高于培养基4，且培养基4和培养基8的活菌数相差不大，因此优选出培养基2作为戊糖片球菌PG-2工业高密度发酵培养基，其有助于戊糖片球菌PG-2的生长。并且此培养基的碳源和氮源采用工业副产物，所以其发酵成本显著低于MRS液体培养基。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。