用于治疗脊髓损伤的AIE-N3-Zn-MOF及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，特别涉及用于治疗脊髓损伤的AIE-N

背景技术

脊髓损伤（Spinal cord injury， SCI）是脊柱损伤的严重并发症，通常继发于直接或间接外力所致的脊柱骨折，比如直接暴力、运动、跌倒、交通事故、高处坠落等因素。脊髓损伤可能导致患者的四肢、肠道、膀胱以及性功能障碍等，从而给患者造成了严重的身体以及精神上的伤害，极大地降低了患者的生活质量。据统计，全球约有2000多万脊髓损伤的患者，并且以每年约70万名患者的数量在增加，其中男女比例约为2：1，且成人数量多于儿童。目前对于脊髓损伤的治疗主要集中在手术治疗、药物治疗、干细胞治疗等，尚无确切有效的治疗方法。因此，急需对脊髓损伤进行更深入的研究。

脊髓损伤涉及了一系列复杂的病理生理过程，比如氧化应激、炎症反应、细胞凋亡、胶质瘢痕形成等。神经元是中枢神经系统中最容易受到氧化应激影响的细胞类型，损伤脊髓中高水平的ROS在触发继发性损伤级联反应中起着关键的作用。许多研究表明，在脊髓损伤的过程中产生了过量的ROS，接着ROS与许多生物分子发生反应，从而引起氧化应激性损伤，导致损伤部位神经元的功能出现障碍。有报道称，通过清除或抑制脊髓损伤过程中过量ROS的产生可以促进神经细胞以及神经功能的恢复。并且，通过清除炎性细胞所产生的过量ROS，可以有效地减轻脊髓损伤治疗中的继发性损伤。

金属-有机框架材料（MOFs）又称多孔性配位聚合物，是一类由金属离子/簇合物和功能性有机配体通过强配位键组装而成的多孔性晶体材料。MOFs具有多种多样的结构，它具有合成简单、易于表面功能化、高孔隙率、低密度、高比表面积和负载量、孔道规则、孔径可调、拓扑结构多样性和可裁剪性、良好的生物相容性和可生物降解性等优点，已经被广泛应用于药物输送、生物成像与传感、气体吸附/分离/储存、海水淡化以及生物医学应用等领域。在MOFs的药物运输与释放等领域上表现出很好的药物承载以及控制释放的能力。然而，常规搭载的金属是锰和铬，具有较大的毒性，因此并不适用于生物医学的应用。为了将MOFs成功应用于生物领域上，比如细胞内成像、药物载体等，必须确保MOFs的无毒性。

发光体在聚集的时候通常会导致两种不同的发光效应：聚集荧光淬灭（Aggregation-caused Quenching，ACQ）和聚集诱导发光（Aggregation-inducedEmission，AIE）。ACQ是指发光体在疏水性作用力的驱动下，通过分子间的π-π堆积作用，在其聚集的时候发生荧光淬灭的现象；ACQ的现象很普遍并且不利于生物成像。AIE是指某些有机物或聚合物在其稀溶液中只发出很微弱的光，而在其聚集体或固态却强烈发光的一种新的光物理现象。AIE现象主要是由两个因素引起的：（1）在溶液中，由于通过锥形交点的快速能量耗散而导致了在溶液中的发光效率很低；（2）在AIE固体中，由于分子间的弱耦合减缓了分子间的能量/电荷转移，有效地防止了猝灭，因此具有较高的发光效率。AIE的发光效率可以通过改变分子的相态、机械刺激以及电刺激等来调节，其中，通过改变分子的相态来控制分子跨越或不跨越锥形交点而调节发光效率是AIE的关键，而分子跨越锥形交点的速度则取决于异构化的能量屏障。聚集诱导发光体（AIEgens）分子内的芳香环（如苯环）在稀溶液中的自由转动以非辐射的方式释放激发能，从而使荧光淬灭。而在聚集体形成后，可以通过限制分子内运动来阻止非辐射能量的耗散，此外，AIEgens高度扭曲的分子构象可以阻止其分子间的π-π堆积作用，从而避免了激发能的损失。AIEgens具有稳定发光的特性，已经被广泛应用于对药物的实时跟踪。

现有技术中关于脊髓损伤治疗的药物和方法十分有限。尽管有研究表明了MOFs可以作为有效的药物载体用于药物的运输，然而，目前Zn-MOF在脊髓损伤方面的研究几乎一篇空白，并且更是未有现有技术报道AIE标记的Zn-MOF对脊髓损伤后的修复作用。

发明内容

本发明的目的在于解决现有技术中所存在的不足，提供一种可生物降解的AIE-N

为了解决上述技术问题，本发明是通过如下技术方案得以实现的。

本发明第一方面提供了一种AIE-N

（1）将ZnCl

（2）使用NaOH溶液将pH值调整为7-9，并在马弗炉中进行加热，得到混合物；

（3）加入N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）和1-（3-二甲基氨基丙基）-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐（EDC），室温进行充分搅拌；

（4）加入二苯并环辛炔胺（DBCO-NH

（5）反应完全后进行离心，取沉淀用去离子水洗涤后干燥即得。

作为优选地，步骤（1）中所述ZnCl

作为优选地，步骤（2）中所述NaOH的浓度为10mol/L。

作为优选地，步骤（2）中所述加热的温度为110-170℃，加热的时间为12-36h；最优选地，所述加热的温度为140℃，加热的时间为24h。

作为优选地，步骤（3）中所述N-羟基琥珀酰亚胺的加入量为步骤（2）中所述混合物质量的2-10%。

作为优选地，步骤（3）中所述1-（3-二甲基氨基丙基）-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐的加入量为步骤（2）中所述混合物质量的1-5倍。

作为优选地，步骤（3）中所述搅拌反应的时间为6h。

作为优选地，步骤（4）中所述二苯并环辛炔胺的加入量为步骤（2）中所述混合物质量的1-3倍。

作为优选地，步骤（4）中所述反应的时间为12h。

作为优选地，步骤（5）中所述洗涤的次数为1-3次；最优选地，所述洗涤的次数为2次。

本发明第二方面提供了一种AIE-N

（1）将ZnCl

（2）使用NaOH溶液将pH值调整为7-9，并在马弗炉中进行加热，得到混合物；

（3）加入N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）和1-（3-二甲基氨基丙基）-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐（EDC），室温进行充分搅拌；

（4）加入二苯并环辛炔胺（DBCO-NH

（5）反应完全后进行离心，取沉淀用去离子水洗涤后干燥即得。

作为优选地，步骤（1）中所述ZnCl

作为优选地，步骤（2）中所述NaOH的浓度为10mol/L。

作为优选地，步骤（2）中所述加热的温度为110-170℃，加热的时间为12-36h；最优选地，所述加热的温度为140℃，加热的时间为24h。

作为优选地，步骤（3）中所述N-羟基琥珀酰亚胺的加入量为步骤（2）中所述混合物质量的2-10%。

作为优选地，步骤（3）中所述1-（3-二甲基氨基丙基）-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐的加入量为步骤（2）中所述混合物质量的1-5倍。

作为优选地，步骤（3）中所述搅拌反应的时间为6h。

作为优选地，步骤（4）中所述二苯并环辛炔胺的加入量为步骤（2）中所述混合物质量的1-3倍。

作为优选地，步骤（4）中所述反应的时间为12h。

作为优选地，步骤（5）中所述洗涤的次数为1-3次；最优选地，所述洗涤的次数为2次。

本发明第三方面提供了上述AIE-N

作为优选地，所述与氧化应激相关的疾病选自脊髓损伤。

本发明第四方面提供了一种用于治疗与氧化应激相关的疾病的药物组合物，包括上述AIE-N

作为优选地，所述与氧化应激相关的疾病选自脊髓损伤。

作为优选地，所述药学上可接受的载体选自填充剂、崩解剂、润滑剂、粘合剂、抗氧剂、抑菌剂、矫味剂、芳香剂、螯合剂中的一种或多种。

脊髓损伤涉及非常复杂的病理生理机制，而氧化应激介导的炎症反应就是其中之一。有研究表明，神经退行性疾病的发病机制可能与氧化应激以及兴奋性毒素有关。兴奋性神经递质谷氨酸可能会导致某些神经系统疾病，它可以介导氧化应激性损伤和兴奋性毒性，这种现象被称为谷氨酸的神经毒性。它可以引起包括线粒体在内的许多细胞成分的损伤，最终导致细胞的死亡。在细胞死亡的过程中会产生大量的活性氧（ROS）比如超氧阴离子（O2·

神经元是中枢神经系统中最容易受到氧化应激影响的细胞类型，它特别容易受到ROS的影响。ROS可以损害细胞的核酸、蛋白质和脂质等，从而导致神经元功能障碍甚至神经元死亡。ROS参与了许多神经退行性疾病的发生发展，比如阿尔茨海默病、肌萎缩侧索硬化症、帕金森病等。以往认为内源性产生的ROS可以作为信号分子调节一系列神经系统的生理过程，比如神经元的发育、神经元的极性、突触的可塑性以及神经回路的调节等。然而，过量ROS的产生则会导致氧化与抗氧化机制的失衡，从而引起氧化应激。本发明通过统计神经元突起数目和长度以验证AIE-N

本发明相对于现有技术具有如下有益效果：

本发明所制备合成的AIE-N

附图说明

图1为傅里叶红外光谱仪和纳米粒度分析仪对AIE-N

图2为AIE-N

图3为不同浓度AIE-N

图4为不同浓度AIE-N

图5为AIE-N

图6为AIE-N

图7为不同组别的BMS评分结果示意图。

图8为脊髓损伤60天后不同小组小鼠的形态图。

图9为不同组别小鼠体内的活性氧水平结果示意图。

图10为不同组别小鼠的足失误率结果示意图。

图11为不同组别小鼠的掉落潜伏期结果示意图。

图12为不同组别小鼠的步长和步宽结果示意图，

图13为不同组别小鼠的左后肢最大接触面积平均值与左后肢最大接触平均强度结果示意图。

图14为不同组别小鼠的右后肢最大接触面积平均值与右后肢最大接触平均强度结果示意图。

图15为不同组别小鼠的步序正常指数结果示意图。

图16为不同组别小鼠的运动诱发电位结果示意图。

图17为脊髓损伤60天后不同组别小鼠脊髓组织的HE染色结果示意图。

图18为不同组别小鼠的主要脏器HE染色结果示意图。

图19为AIE-N

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下参照实施例对本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

在无特别说明的情况下，本发明上下文中所使用的试剂中，均通过市售获得。对于动物实验，相关程序及方法符合医学伦理学要求。本发明所使用的实验方法均为本领域的常规方法和技术。

生物学实验重复中选择具有代表性的结果呈现在上下文附图中，数据按照图示中规定的以mean±SD和mean±SEM展示。所有实验至少重复三次。数据采用GraphPad Prism5.0或SPSS 22.0软件进行分析。采用t检验、卡方检验、方差分析等常规医学统计学方法比较两组或两组以上的平均值差异。

实施例1 AIE-N

（1）将1.0g ZnCl

（2）使用10mol/L的NaOH溶液将pH值调整为8，并在马弗炉（Sxi-8-10，新韩仪器设备有限公司）中进行140℃下加热24h，得到混合物。

（3）于20mg步骤（2）得到的混合物中加入1.075mg N-羟基琥珀酰亚胺（NHS，0.3mmol）和57.5mg 1-（3-二甲基氨基丙基）-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐（EDC，0.3mmol），室温进行充分搅拌6h。

（4）加入27.6mg二苯并环辛炔胺（DBCO-NH

（5）反应完全后于4℃、12000rpm条件下离心15min，取沉淀用去离子水洗涤2遍后干燥即得。

取上述制备得到的AIE-N

实施例2 AIE-N

取实施例1制备得到的AIE-N

（1）取20mL PBS溶液置于50mL离心管中，然后称取54.87mg的ABTS并将其加入至含有PBS溶液的离心管中，充分混合均匀制得ABTS储备液。

（2）准备一张滤纸并在滤纸上放置足够量的MnO

（3）将100μL不同浓度的AIE-N

（3）使用细胞成像多模式阅读器（Cytation 5，BioTek Instruments Inc.）分别于10min、20min、40min、60min、90min和120min时检测734nm下的吸光度。

检测结果如图2所示。结果显示，AIE-N

进一步地，选择HT22细胞进行AIE-N

（1） 使用细胞计数器将HT22细胞以5000cells/100μL/孔的细胞数接种于96孔板中。

（2）细胞粘附后，分别在每孔中加入不同浓度（1.57，3.13，6.25，12.5，25，50，100，单位：μg/mL）的AIE-N

（3）12h之后，加入110μL配好的CCK-8溶液（10μL的MEM溶液+10μL的CCK-8原液，混匀后加入），用锡纸包裹住96孔板以起到避光的作用，然后继续孵育1h。

（4）孵育完成后，用酶标仪检测每组细胞在450nm波长处的OD值（吸光度），然后根据公式计算其细胞活力：细胞活力（%）=（加药组-空白组）/（Control组-空白组）×100%。

结果如图3所示。结果显示，在所研究的1.57-100μg/mL的各浓度下，AIE-N

随后，选择大鼠海马组织细胞进一步对AIE-N

（1）取1日龄Sprague-Dawley（SD）大鼠的脑海马组织，用眼科剪剪碎后加入至15mL离心管（Corning）中，加入木瓜蛋白酶（Sigma，Cat#P4762）于37℃下消化25分钟。

（2）用牛血清蛋白终止蛋白酶作用后清洗组织。

（3）将分离的海马神经元以20000细胞/mL的浓度接种在96孔板（Corning）中，每孔200μL，用含10%胎牛血清、10%营养混合物F-12的DMEM培养基（含谷氨酰胺，Gibco，Carlsbad，CA，Cat#12430054），置于37℃、95% O

（4）用含5% B-27（Gibco）的Neurobasal培养基替代原培养基，置于37℃、95% O

（5）细胞粘附后，分别在每孔中加入不同浓度（0.40，0.79，1.57，3.13，6.25，12.5，25，50，100，单位：μg/mL）的AIE-N

（6）12h之后，加入110μL配好的CCK-8溶液（10μL的MEM溶液+10μL的CCK-8原液，混匀后加入），用锡纸包裹住96孔板以起到避光的作用，然后继续孵育1h。

（7）孵育完成后，用酶标仪检测每组细胞在450nm波长处的OD值（吸光度），然后根据公式计算其细胞活力：细胞活力（%）=（加药组-空白组）/（Control组-空白组）×100%。

结果如图4所示。结果显示，在所研究的0.40-100μg/mL的各浓度下，AIE-N

实施例3 AIE-N

为了研究AIE-N3-Zn-MOF是否能够进入原代海马神经元而发挥作用，通过培养原代海马神经元细胞进行神经元共定位实验加以验证，具体步骤如下：

（1）将原代海马神经元细胞置于24孔板中培养，待细胞生长至对数期后分为两组，分别为Control组和AIE-N

（2）12h后，去除原培养基，采用免疫细胞化学技术（一抗溶液使用微管蛋白抗体βIII-tublin）进行封片，随后置于激光共聚焦显微镜下进行拍照。

结果如图5所示，在Control组和AIE-N

随后，选择大鼠海马组织进行AIE-N

（1）取1日龄Sprague-Dawley（SD）大鼠脑海马组织，用眼科剪剪碎后加入至15mL离心管（Corning）中，加入木瓜蛋白酶（Sigma，Cat#P4762）于37℃下消化25分钟；用牛血清蛋白终止蛋白酶作用后清洗组织。

（2）将分离的海马神经元以20000细胞/mL的浓度接种在24孔板（Corning）中，每孔500μL，用含10%胎牛血清、10%营养混合物F-12的DMEM培养基（含谷氨酰胺，Gibco，Carlsbad，CA，Cat#12430054），置于37℃、95% O

（3）用含120μM L-谷氨酸钠的培养基替代原培养基，置于37℃、95% O

（4）细胞粘附后，分别在每孔中加入不同浓度（12.5，25，50，100，单位：μg/mL）的AIE-N

通过量化神经元突起的长度和总数来评估AIE-N

实施例4 AIE-N

（1）选取24只6周龄雌性小鼠，分为四组，每组6只，包括空白对照组（Control组，6只，不作任何处理）、假处理对照组（sham组，6只，只切除椎板，不损伤脊髓）、模型组（Injury组，6只）、AIE-N

a.剔除小鼠背部的毛发，显露小鼠背部的皮肤。

b.麻醉：用1.25%三溴乙醇以200μg/20g的剂量腹腔注射麻醉，呼吸平稳、四肢肌力明显减弱、疼痛反射与角膜反射消失表示麻醉成功。

c.显露脊髓：用碘伏棉球擦拭2遍消毒皮肤；确定胸椎第9-11段（T9-T11）水平，并在T9-T11水平在背部正中作一个2.5cm长的纵向切口。钝性剥离椎旁肌，用咬骨钳去除棘突和椎板，彻底暴露T9-T11节段脊髓，使用固定器固定T10平面，切除T10椎板，操作过程中要小心避免额外的组织损伤。随后用固定器撑开固定，以充分暴露脊髓。

d.将小鼠固定到路易斯维尔损伤系统装置上（Louisville Injury SystemApparatus，LISA），将脊髓调调整至冲击器下，并同时由其监测激光束确认冲击位置，以冲击深度来确定脊髓损伤程度，本实施例中设置碰撞尖端为18psi，冲击深度为0.8mm，损伤时间为0.5s；碰撞完成后将小鼠从损伤装置中取出，并从固定器中取下。给予充分止血后使用缝线缝合小鼠肌肉及皮肤。假手术组的小鼠行T10椎板切除，不行脊髓碰撞。

e.关闭切口，术后皮下注射庆大霉素2000U，每日1次，连续3d，每8h进行1次人工膀胱排空直至自主排尿为止。

（2）监测：从造模后开始，每天监测各组小鼠的运动状态，且每3天进行一次BMS评分，结果如图7所示。结果显示，开始时，除空白对照组外，所有SCI小鼠的后肢运动完全丧失。随后，随着时间的推移，各组SCI小鼠的后肢运动功能开始逐渐恢复，其中在损伤第6天时，AIE-N

（3）小动物活体成像：损伤后第3天进行小鼠活体成像。先腹腔注射0.1mL/20g L-012（化学发光（CHL）探针），L-012的浓度为4mg/ml。5分钟后，用1.25%三溴乙醇以200µg/20g的剂量腹腔注射麻醉，待麻醉成功后，进行小动物活体成像。

结果如图9所示。结果显示，在正常小鼠脊髓中很少见ROS的生物发光，而脊髓损伤小鼠脊髓中ROS的生物发光强度明显提高，并随时间增加而增加。在经过AIE-N

在小鼠脊髓损伤后的第60天，对小鼠进行了踏空实验和转棒实验。其中踏空实验具体步骤如下：将小鼠放置于平行杆上，用一正方形架子框住小鼠，让小鼠在限定的范围内自由活动，然后进行视频摄像3-5min。在小鼠爬行的过程中，如下肢未踏至平行杆上，则感应装置会自行记录为足失误一次，记录小鼠在平行杆上爬行60步的足失误总次数，然后计算每只小鼠的足失误率。足失误率=双下肢掉落平行杠的次数/总步数（60步）。

实验结果如图10所示。结果显示，与Control组和Sham组相比，Injury组小鼠的足失误率显著增高，表明Injury组小鼠的后肢运动功能很差。然而，与Injury组相比，AIE-N

转棒实验具体步骤如下：打开转动棒开关，使其不断地转动；抓取1只小鼠放在转动棒上，使小鼠运动的方向与转动棒旋转的方向相反，从小鼠刚放到转动棒上即开始计时，到小鼠从转动棒上掉落结束计时，记录每只小鼠在转动棒上运动的时间；收集数据并进行分析。

实验结果如图11所示。结果显示， Injury组小鼠的掉落潜伏期比Control组和Sham组明显缩短。而AIE-N

在损伤早期（7天）半切损伤小鼠右后肢瘫痪，呈现拖行，关节活动少，无法进行评测。随后7天到14天，下肢功能逐渐恢复，拖行减少，膝关节、髋关节活动明显增加。因此在损伤后14天进行了足迹分析，足迹分析实验中评测参数包括了步长和步宽。具体步骤如下：

取实验小鼠，随机分为4组，记为组1-组4，按照前述方法进行脊髓损伤模型制备。其中组1为空白对照组（Control），组2为假手术组（Sham），组3为模型组（Injury），组4为AIE-N

实验结果如图12所示，结果显示，脊髓半切模型会导致小鼠后肢运动功能的部分丧失，与Sham组（组2）相比，Injury组（组3）小鼠后肢运动存在拖行（图12A），而经AIE-N

随后，对不同组别小鼠进行了CatWalk步态分析，具体步骤如下：将小鼠置于黑暗房间中适应片刻；随后抓取小鼠置于CatWalk不太分析系统的有机玻璃地板上的末端出，盖上盖子，让其自由地从地板一端穿越到另一端，同时在电脑上观察小鼠自由穿过有机玻璃地板的过程，注意小鼠在穿过有机玻璃地板的过程中不能有停留，否则必须重复一次，当小鼠十分顺畅地穿过有机玻璃地板后，电脑会自动保存小鼠的运动录像；重复以上步骤，直至采集完所有实验小鼠的步态相关数据。

实验结果如图13-15所示。结果显示，与Control组和Sham组相比，Injury组小鼠的双后肢最大接触面积平均值与双后肢最大接触平均强度都非常小，表明Injury组小鼠的双后肢运动功能很差。然而，与Injury组相比，AIE-N

以上小鼠行为学测试证明了AIE-N

实验结果如图16所示。结果显示，Injury组小鼠运动诱发电位的幅度比Control组和Sham组的显著减小，而AIE-N

为了更加直观地评估AIE-N

前述实验中验证了AIE-N

对此，通过采用局部注射的方式在小鼠脊髓损伤的部位注射AIE-N

本发明通过ABTS+·自由基清除实验证明了AIE-N

本发明通过统计神经元突起数目和长度以验证AIE-N

除此以外，本发明还对AIE-N

以上具体实施方式部分对本发明所涉及的分析方法进行了具体的介绍。应当注意的是，上述介绍仅是为了帮助本领域技术人员更好地理解本发明的方法及思路，而不是对相关内容的限制。在不脱离本发明原理的情况下，本领域技术人员还可以对本发明进行适当的调整或修改，上述调整和修改也应当属于本发明的保护范围。