一种全覆盖线扫描拉曼显微成像系统及其成像方法

技术领域

本发明涉及生物显微成像技术，尤其涉及一种全覆盖线扫描拉曼显微成像系统及其成像方法。

背景技术

拉曼光谱是一种无损、无标记的生物样品分析技术，能够从分子水平获得样品的结构和组成信息。与红外、荧光等其他光谱技术相比，拉曼光谱具有不受水干扰、不易淬灭、光谱带宽窄等优点。因此，拉曼光谱十分适用于生物样品动态活动的检测。

生物样品(比如活细胞)动态活动的时间尺度为几分钟到几小时，为了能够捕获其中的动态变化细节，采用的成像系统的时间分辨率需要达到秒钟或者分钟的量级。然而，自发拉曼散射信号最多只占散射信号的千分之几，拉曼光谱信号十分微弱。

传统的点扫描拉曼成像系统采集一帧图像通常需要数小时，所以无法及时捕获到生物样品中的时空演变信息。相比于点扫描，利用线扫描可以提高拉曼成像速率，但是常规逐线扫描仍然无法对快速活动进行拉曼成像，而且单次测量时，激光照射单一位置过长将损伤生物样品。因此，提高常规逐线扫描拉曼成像速率，对生物样品准确成像，并能降低对生物样品的照射损伤，将至关重要。

发明内容

为解决上述问题，本发明采用的技术方案是：一种用于拉曼显微成像系统的成像操作方法。

本发明的具体技术方案如下：

一种全覆盖线扫描拉曼显微成像系统，包括激发通道、拉曼通道和样品台12；

所述激发通道包括激光器1、第一凸透镜2、第二凸透镜3、鲍威尔棱镜4、第一柱面镜5、第二柱面镜6、分光镜7、扫描振镜8、扫描透镜9、套筒透镜10、物镜11和样品台12，所述样品台12用于放置生物样品进行观测；

所述激光器1发出的点光束通过第一凸透镜2、第二凸透镜3组合改变光斑尺寸，光斑通过鲍威尔棱镜4和第一柱面镜5、第二柱面镜6组合后形成线光束，线光束通过扫描透镜9和套筒透镜10耦合进物镜11，并聚焦于生物样品面，转动扫描振镜8实现对生物样品面上线光束的线位置选取；

所述拉曼通道包括长通滤光片13，第三凸透镜14、狭缝15、第四凸透镜16、光栅17、第五凸透镜18和CCD相机19；

生物样品发出的拉曼光信号通过物镜11收集并返回至分光镜7，通过长通滤光片13滤除激发波长光信号，通过狭缝15去除焦平面以外的杂散光，通过光栅17在空间上分散开来，并照射于CCD相机19而被收集，得到生物样品的测量拉曼信号。

进一步，沿所述激光器1的出射光线方向放置第一凸透镜2，沿着所述第一凸透镜2的出射光线方向放置第二凸透镜3，沿着所述第二凸透镜3的出射光线方向放置鲍威尔棱镜4，沿着所述鲍威尔棱镜4的出射光线方向放置第一柱面镜5，沿着所述第一柱面镜5的出射光线方向放置第二柱面镜6，沿着所述第二柱面镜6的出射光线方向放置分光镜7，沿着所述分光镜7的反射光线方向放置扫描振镜8，沿着所述扫描振镜8的出射光线方向放置扫描透镜9，沿着所述扫描透镜9的出射光线方向放置套筒透镜10，沿着所述套筒透镜10的出射光线方向放置物镜11；样品台12位于物镜11的焦平面上；

沿着所述分光镜7的透射光线方向放置长通滤光片13，沿着所述长通滤光片13的出射光线方向放置第三凸透镜14，第三凸透镜14的出射光线经过所述狭缝15至第四凸透镜16，沿着所述第四凸透镜16的出射光线方向放置光栅17，沿着所述光栅17的出射光线方向放置第五凸透镜18，沿着所述第五凸透镜18的出射光线方向放置CCD相机19。还包括上述一种全覆盖线扫描拉曼显微成像系统的成像方法，具体包括以下步骤：步骤(1)：将生物样品的单幅图像划分由N个线位置组合而成，转动扫描振镜8实现对线位置的选取，CCD相机19的单次曝光时间内，选取其中D个线位置进行第1次拉曼光信号积分探测，对应测量矩阵为A

在剩余N-D个线位置中再随机选取D个线位置，进行第2次拉曼光信号积分探测，对应测量矩阵为A

第k次拉曼光信号积分探测，对应的测量矩阵记为A

步骤(2)：重复步骤(1)可以完成对单幅图像的第m组全覆盖压缩探测，对应的测量矩阵记为A

步骤(3)：对于压缩探测得到的拉曼信号，可以描述成一个标准的压缩感知问题：

AS(λ)＝H(λ) (1)

其中，A为压缩测量矩阵；S(λ)为拉曼频移λ处的二维原始拉曼信号；H(λ)为拉曼频移λ处的二维测量拉曼信号；

步骤(4)：为了计算式(1)中的S(λ)，利用两步迭代阈值收缩(TwIST)或者全变分增强拉格朗日交替方向(TVAL3)算法解决下面的最小化问题：

式(2)中，上式右边第一项为保真项，右边第二项为基于全变分的正则项；τ是正则项的调节参数；

步骤(5)：计算得到的所有拉曼频移λ处的二维原始拉曼信号

利用顶点成分分析方法，得到生物样品中各种成分的拉曼光谱，以及各种成分在空间上的丰度值即拉曼图像。

本发明的有益技术效果如下：

本发明提供的一种全覆盖压缩线扫描拉曼显微成像系统，包括激发通道和拉曼通道，激发通道激发生物样品发出的拉曼光信号，拉曼通道收集产生的拉曼光信号，得到生物样品的测量拉曼信号；本发明的一种全覆盖压缩线扫描拉曼显微成像方法，单次拉曼信号探测中，在CCD相机的单次曝光时间内，样品面上的线光束随机地选择若干个位置，并分别停留相等的时间，进行拉曼光信号积分探测，全覆盖压缩线扫描测量时，单幅图像由N个线位置组合而成，单次测量选取D个线位置，线光束在单个线位置的停留时间比常规逐线扫描探测缩短了D倍，不仅对生物样品快速成像，成像时采集一帧耗时提高至分钟乃至秒钟量级，也降低了对生物样品的照射损伤，将为生物医药研究和应用提供有力的帮助；

同时在每组的全覆盖压缩探测中，能够确保平面所有位置被覆盖到，避免空间上信息的丢失，得到生物样品中各种成分的拉曼光谱，以及各种成分拉曼图像，对生物样品成像准确。

附图说明

图1为本发明一种全覆盖压缩线扫描拉曼显微成像系统的系统图；

图2是常规逐线扫描和压缩线扫描的原理示意图；

图3是常规逐线扫描的测量矩阵示意图；

图4是常规压缩线扫描的测量矩阵和线覆盖统计的示意图；

图5是全覆盖压缩线扫描的测量矩阵和线覆盖统计的示意图；

图6是三种线扫描拉曼成像方法对PS和PMMA混合化学微球采集得到的拉曼图像示意图；

图7是三种线扫描拉曼成像方法对PS和PMMA混合化学微球采集得到的拉曼光谱示意图。

其中：激光器1、第一凸透镜2、第二凸透镜3、鲍威尔棱镜4、第一柱面镜5、第二柱面镜6、分光镜7、扫描振镜8、扫描透镜9、套筒透镜10、物镜11、样品台12、长通滤光片13、第三凸透镜14、狭缝15、第四凸透镜16、光栅17、第五凸透镜18、CCD相机19。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施方式仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

见图1，一种全覆盖线扫描拉曼显微成像系统，包括激发通道、拉曼通道和样品台12；所述激发通道包括激光器1、第一凸透镜2、第二凸透镜3、鲍威尔棱镜4、第一柱面镜5、第二柱面镜6、分光镜7、扫描振镜8、扫描透镜9、套筒透镜10、物镜11和样品台12，所述样品台12用于放置生物样品进行观测；

所述激光器1发出的点光束通过第一凸透镜2、第二凸透镜3组合改变光斑尺寸，光斑通过鲍威尔棱镜4和第一柱面镜5、第二柱面镜6组合后形成线光束，线光束通过扫描透镜9和套筒透镜10耦合进物镜11，并聚焦于生物样品面，转动扫描振镜8实现对生物样品面上线光束的线位置选取；

所述拉曼通道包括长通滤光片13，第三凸透镜14、狭缝15、第四凸透镜16、光栅17、第五凸透镜18和CCD相机19；

生物样品发出的拉曼光信号通过物镜11收集并返回至分光镜7，通过长通滤光片13滤除激发波长光信号，通过狭缝15去除焦平面以外的杂散光，通过光栅17在空间上分散开来，并照射于CCD相机19而被收集，得到生物样品的测量拉曼信号。

沿所述激光器1的出射光线方向放置第一凸透镜2，沿着所述第一凸透镜2的出射光线方向放置第二凸透镜3，沿着所述第二凸透镜3的出射光线方向放置鲍威尔棱镜4，沿着所述鲍威尔棱镜4的出射光线方向放置第一柱面镜5，沿着所述第一柱面镜5的出射光线方向放置第二柱面镜6，沿着所述第二柱面镜6的出射光线方向放置分光镜7，沿着所述分光镜7的反射光线方向放置扫描振镜8，沿着所述扫描振镜8的出射光线方向放置扫描透镜9，沿着所述扫描透镜9的出射光线方向放置套筒透镜10，沿着所述套筒透镜10的出射光线方向放置物镜11；样品台12位于物镜11的焦平面上；

沿着所述分光镜7的透射光线方向放置长通滤光片13，沿着所述长通滤光片13的出射光线方向放置第三凸透镜14，第三凸透镜14的出射光线经过所述狭缝15至第四凸透镜16，沿着所述第四凸透镜16的出射光线方向放置光栅17，沿着所述光栅17的出射光线方向放置第五凸透镜18，沿着所述第五凸透镜18的出射光线方向放置CCD相机19。见图2，为常规逐线扫描和压缩线扫描的原理示意图；对比了常规逐线扫描和压缩线扫描两种方式。单次拉曼信号探测中，在CCD相机19的单次曝光时间内，常规线扫描的方式为样品面上的线光束始终停留在某一个位置，CCD相机19收集了此线位置上产生的拉曼光信号；压缩线扫描的方式为样品面上的线光束，通过转动扫描振镜8随机地选择若干个位置，并分别停留相等的时间，CCD相机19积分收集了多个线位置上产生的测量拉曼光信号。

实施例2

一种全覆盖线扫描拉曼显微成像系统的成像方法，具体包括以下步骤：

步骤(1)：将生物样品的单幅图像划分由N个线位置组合而成，转动扫描振镜8实现对线位置的选取，CCD相机19的单次曝光时间内，选取其中D个线位置进行第1次拉曼光信号积分探测，对应测量矩阵为A

在剩余N-D个线位置中再随机选取D个线位置，进行第2次拉曼光信号积分探测，对应测量矩阵为A

第k次拉曼光信号积分探测，对应的测量矩阵记为A

步骤(2)：重复步骤(1)可以完成对单幅图像的第m组全覆盖压缩探测，对应的测量矩阵记为A

步骤(3)：对于压缩探测得到的拉曼信号，可以描述成一个标准的压缩感知问题：

AS(λ)＝H(λ) (1)

其中，A为压缩测量矩阵；S(λ)为拉曼频移λ处的二维原始拉曼信号；H(λ)为拉曼频移λ处的二维测量拉曼信号；

步骤(4)：为了计算式(1)中的S(λ)，利用两步迭代阈值收缩(TwIST)或者全变分增强拉格朗日交替方向(TVAL3)算法解决下面的最小化问题：

式(2)中，上式右边第一项为保真项，右边第二项为基于全变分的正则项；τ是正则项的调节参数；

步骤(5)：计算得到的所有拉曼频移λ处的二维原始拉曼信号

利用顶点成分分析方法，得到生物样品中各种成分的拉曼光谱，以及各种成分在空间上的丰度值即拉曼图像。

见图3，常规逐线扫描测量时，线光束按照单一方向逐次扫描N＝100个线位置，并逐次探测拉曼信号；探测100次，覆盖所有线位置，实现对图像的全采样。

见图4，常规压缩线扫描测量时，单幅图像由N＝100个线位置组合而成，单次测量随机选取D＝5个线位置，线光束在单个线位置的停留时间比常规逐线扫描探测缩短了5倍，降低了对生物样品的照射损伤；根据线覆盖统计，探测100次，各个线位置的覆盖次数从0至10次不等。

见图5，全覆盖压缩线扫描测量时，单幅图像由N＝100个线位置组合而成，单次测量选取D＝5个线位置，线光束在单个线位置的停留时间比常规逐线扫描探测缩短了5倍，降低了对生物样品的照射损伤；

见图6，利用常规逐线扫描、常规压缩线扫描和全覆盖压缩线扫描三种拉曼成像方法对混合的1μm的PS和1μm的PMMA微球所成的拉曼图像，单幅图像由100个线位置组合而成，单次测量时CCD相机19的曝光时间为1秒。

以常规逐线扫描所成的拉曼图像(采样时间100秒)为基准，常规压缩线扫描和全覆盖压缩线扫描所成的图像在压缩率在0(采样时间100秒)至0.6(采样时间40秒)范围内，能够保持高保真度；压缩率达到0.8(采样时间20秒)时，常规压缩线扫描所成的图像出现失真情况，而全覆盖压缩线扫描所成的图像仍能保持高保真度，比如虚线方框内的一个PMMA微球，在常规压缩线扫描所成的图像中出现了丢失，而在全覆盖压缩线扫描所成的图像仍然保留着。

见图7，利用常规逐线扫描、常规压缩线扫描和全覆盖压缩线扫描三种拉曼成像方法对PS和PMMA混合化学微球采集得到的拉曼光谱，采用顶点成分分析方法，提取于图6中常规线扫描拉曼图像、压缩率为0.8和0.4的常规压缩线扫描图像和全覆盖压缩线扫描图像；以常规逐线扫描得到的拉曼光谱为基准，常规压缩线扫描和全覆盖压缩线扫描得到的拉曼光谱均能保持高保真度。

本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。