高稳定性超氧化物歧化酶突变体及其应用

技术领域

本发明涉及生物基因工程领域，特别涉及高稳定性超氧化物歧化酶突变体及其应用。

背景技术

超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，简称SOD)是一种能够催化超氧化物通过歧化反应转化为氧气和过氧化氢过程的酶。它广泛存在于各类动物、植物、微生物中，是一种重要的抗氧化剂，对细胞生命活动具有重大意义。由于SOD的特殊功效，其在医药、日用化工、食品、农业以及环保等领域具有广泛的应用价值。目前，SOD临床应用主要集中在抗炎症方面(以类风湿以及放射治疗后引起的炎症病人为主)，此外对某些自身免疫性疾病(如红斑狼疮、皮肌炎)、肺气肿、抗癌和氧中毒等都有一定疗效；在食品工业主要用作食品添加剂和重要的功能性基料；在化妆品行业里主要用作抗炎、抗衰老的重要功能。

根据结合的金属离子类型不同，该酶可分为Cu/Zn-SOD、Mn-SOD、Fe-SOD、Ni-SOD四种类型。由于提取方法简单，操作成本低，目前国内外市场上商品化的SOD主要为动物来源(猪、牛、羊等)。但是免疫原性的存在使得动物来源的SOD进入人体后极易受到免疫系统的攻击，无法正常发挥其抗氧化功能。此外，动物来源的SOD存在交叉感染和过敏反应等潜在风险：由于疯牛病等致病因子的传播导致动物来源的SOD安全性受到了严重质疑，因此从1990年开始，欧盟已经全面禁止将动物来源的SOD应用于临床治疗，改为使用人源SOD。人源SOD分为Mn-SOD和Cu/Zn-SOD，1991年Gorecki等比较了人源Mn-SOD和人源Cu/Zn-SOD在抗炎及抗辐射等方面的临床应用，发现人源Cu/Zn-SOD的半衰期只有6-10min，而人源Mn-SOD的半衰期可达到2-3h，因此Mn-SOD在慢性疾病的治疗中更为有效。近年来，美、日、英、等国已相继开发了一系列人源Mn-SOD基因工程产品并进行了临床实验，日本三井东亚化学公司最早生产重组人源Mn-SOD并将其用于治疗心肌梗塞后缺血再灌注的心肌保护剂。

在SOD的生产和应用中，稳定性成为了影响其进一步推广的最主要因素，过于复杂的运输以及应用环境会导致其失活，不利于生产、储藏、运输和使用，人源Mn-SOD同样面对稳定性低的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了高稳定性超氧化物歧化酶突变体及其应用。本发明提供了具备高稳定性和的重组突变型人源SOD及其编码基因和应用，具有突变酶活显著提高，耐热性显著提高，可耐胃蛋白酶消化，具有较高蛋白稳定性，高稳定等技术特点。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了高稳定性超氧化物歧化酶的突变体，其包括E70和/或L113位点突变。

在本发明的一些具体实施方案中，所述突变包括第70位E突变为H，第113位L突变为V。

在本发明的一些具体实施方案中，所述突变体的具有：

(I)、如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；或

(II)、在如(I)所示的氨基酸序列的基础上经取代、缺失、添加和/或替换1个或多个氨基酸的序列；或

(III)、与如(I)或(II)所示的氨基酸序列同源性90％以上的序列。

本发明还提供了编码所述突变体的核酸分子。

在本发明的一些具体实施方案中，所述突变体的核酸分子具有：

(I)、如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；或

(II)、与(I)所示的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(I)所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或

(III)、与(I)或(II)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(I)或(II)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或

(IV)、与(I)、(II)或(III)所述核苷酸序列具有至少90％序列同源性的核苷酸序列。

本发明还提供了重组表达载体，包括所述核酸分子及骨架载体。

在本发明的一些具体实施方案中，所述骨架载体包括pET28a。

本发明还提供了重组菌，包括所述重组表达载体。

在本发明的一些具体实施方案中，所述重组菌的宿主包括BL21(DE3)。

本发明还提供了所述重组菌在制备高稳定性超氧化物歧化酶中的应用。

在本发明的一些具体实施方案中，所述超氧化物歧化酶包括人源超氧化物歧化酶突变体。

本发明还提供了所述突变体的制备方法，包括基于所述的重组菌制备所述突变体。

在本发明的一些具体实施方案中，所述突变体的制备方法，包括如下步骤：

步骤1、诱导所述重组菌表达，离心收集菌体，超声破碎，收集破碎后上清；

步骤2、镍柱纯化，获得所述突变体粗品；

步骤3、G25脱盐柱脱盐，冻干，获得所述突变体。

在本发明的一些具体实施方案中，所述离心收集菌体包括在4℃条件下6000rpm，5min收集菌体。

在本发明的一些具体实施方案中，所述镍柱包括Chelatingsepharose镍鳌合柱。

在本发明的一些具体实施方案中，所述镍柱纯化的洗脱液包括20mMPB，500mMNaCl和100mM咪唑，pH7.4。

本发明还提供了所述突变体；或所述制备方法制得的突变体在以下任意项中的应用：

(I)、热稳定的产品；和/或

(II)、耐酸碱的产品；和/或

(III)、耐胃蛋白酶的消化的产品；和/或

(IV)、耐蛋白抑制剂，清洁剂或变性剂的产品。

在本发明的一些具体实施方案中，所述酸碱的pH值包括1～10。

在本发明的一些具体实施方案中，所述酸碱的pH值包括3～10。

在本发明的一些具体实施方案中，所述热稳定的温度包括20℃～100℃。

在本发明的一些具体实施方案中，所述热稳定的温度包括20℃～80℃。

在本发明的一些具体实施方案中，所述抑制剂，清洁剂或变性剂包括EDTA、β-Me、SDS、尿素或盐酸胍中的任意一种或多种。

本发明包括但不限于取得了如下有益效果：

1、突变型人源SOD和未突变人源SOD酶活分别为30000U/mg、10000U/mg，因此，经过突变酶活显著提高。

2、本发明提供的高稳定突变型人源SOD，在20℃-100℃的条件下具有较高的稳定性(图3)。

3、本发明提供的高稳定突变型人源SOD，在pH1-10的条件下具有较高的活性，具有较强的耐酸碱性。

4、本发明提供的高稳定突变型人源SOD，最高可耐受100℃高温。

5、本发明提供的高稳定突变型SOD，能够耐胃蛋白酶的消化(图4)，具有较高蛋白稳定性，可应用于口服、注射，市场前景广阔。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示高稳定突变型重组SOD蛋白纯化图；

图2示高稳定突变型重组SOD抗逆性实验图，其中，A示高稳定突变型重组SOD于不同pH条件下的稳定性、B示高稳定突变型重组SOD于EDTA、β-Me、SDS条件下的稳定性、C示高稳定突变型重组SOD于2.5M盐酸胍条件下的稳定性、D示高稳定突变型重组SOD不同乙醇条件下的稳定性；

图3示高稳定重组突变型SOD蛋白热稳定性实验结果；

图4示高稳定重组突变型SOD在模拟胃液中的稳定性结果。

具体实施方式

本发明公开了高稳定性超氧化物歧化酶突变体及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

高稳定性的SOD通常更能耐受物理和化学变性剂，对有机溶剂、变性剂、去污剂等有较强抗性，环境适应性强，应用更广泛，是更为理想的工业应用对象，已经成为新型工业酶开发的重要趋势。

为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的。

本发明提供了高稳定重组突变型SOD，高稳定突重组变型SOD包含如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。

本发明提供了编码高稳定重组突变型人源SOD的核苷酸序列，包含编码SEQ IDNO.1所示的氨基酸序列核苷酸序列。

优选的，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明提供了重组表达载体，包含编码SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的核苷酸序列或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

本发明提供了重组菌，包含上述重组表达载体。

本发明提供了所述的高稳定重组突变型人源SOD的制备方法，包含以下步骤：培养上述所述的重组菌，从重组菌中得到超氧化物歧化酶。

本发明提供了所述高稳定重组突变型人源SOD的纯化方法，包含以下步骤：

A：诱导表达所述的重组菌，菌液离心集菌后，超声破碎，收集破碎后上清；

B：上清利用镍柱亲和层析；

C：G25脱盐柱脱盐，冻干保存。

优选的，所述高稳定重组突变型人源SOD的纯化方法，镍柱洗脱液咪唑浓度为100mmol/L。

所述SEQ ID NO.1序列，或编码SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列核苷酸序列或SEQID NO.2所示的核苷酸序列，或所述的重组表达载体，或所述的重组菌，或所述的高稳定重组突变型人源SOD的制备方法，在制备超氧化物歧化酶产品中的应用。

本发明提供的高稳定突变型SOD及其编码基因，利用生物信息学方法，以人源Mn-SOD序列为基础，将70E突变为H，113L突变为V，从而提高SOD的活性、热稳定性、耐酸碱性以及耐胃蛋白酶消化性，其活性提高2倍以上，且活性显著高于现有技术生产的SOD的活性，如专利文献CN201810105875.6记载的纯化高稳定SOD的比活为1315U/mg；

CN200510061502.6记载的大肠杆菌表达SOD的比活为1100U/mg，本申请突变型SOD酶活为30000U/mg。本申请突变体蛋白生产成本低，产量大，具有较大的应用价值，在医药、食品、化妆品等行业有广泛的应用前景。

如无特殊说明，本发明提供的高稳定性超氧化物歧化酶突变体及其应用中所用原料及试剂均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1突变型高稳定SOD基因的获得

1.通过NCBI序列检索分析，得到人源Mn-SOD(GenBank登录号：NM_001322819.2)，将其编码蛋白的氨基酸序列SEQ ID NO.5：MQLHHSKHHAAYVNNLNVTEEKYQEALAKGDVTAQIALQPALKFNGGGHINHSIFWTNLSPNGGGEPKGELLEAIKRDFGSFDKFKEKLTAASVGVQGSGWGWLGFNKERGHLQIAACPNQDPLQGTTGLIPLLGIDVWEHAYYLQYKNVRPDYLKAIWNVINWENVTERYMACKK中70E突变为H，113L突变为V。突变后的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：

MQLHHSKHHAAYVNNLNVTEEKYQEALAKGDVTAQIALQPALKFNGGG

HINHSIFWTNLSPNGGGEPKGHLLEAIKRDFGSFDKFKEKLTAASVGVQGS

GWGWLGFNKERGHVQIAACPNQDPLQGTTGLIPLLGIDVWEHAYYLQYKNVRPDYLKAIWNVINWENVTERYMACKK。根据氨基酸序列SEQ ID NO.1设计可以翻译得到SEQ ID NO.1序列的DNA序列。实际可根据表达菌的密码子偏爱性进行设计，本实施例采用如SEQ ID NO.2所示的DNA序列：

ATGCAGCTGCATCATAGCAAACACCACGCTGCGTACGTGAACAACCTGAACGTAACCGAAGAAAAATACCAGGAAGCGCTGGCGAAAGGCGATGTCACCGCTCAAATCGCGCTGCAGCCAGCCCTGAAATTTAACGGCGGTGGTCACATCAACCACTCTATCTTTTGGACCAATCTGTCTCCGAACGGTGGCGGTGAGCCGAAGGGCCATCTGCTGGAGGCAATTAAACGTGATTTTGGCAGCTTTGACAAATTCAAAGAAAAACTGACCGCTGCAAGCGTTGGTGTTCAAGGTTCCGGCTGGGGTTGGCTGGGTTTCAACAAAGAGCGCGGTCACGTGCAGATCGCGGCATGCCCGAACCAGGATCCGCTGCAAGGTACCACCGGTCTGATCCCGCTGCTGGGTATCGATGTATGGGAACACGCATACTACCTGCAGTATAAAAACGTGCGTCCGGATTACCTGAAAGCGATTTGGAACGTTATTAACTGGGAAAACGTTACCGAACGTTACATGGCATGTAAAAAA

2.人工合成SEQ ID NO.2，获得突变型高稳定SOD基因。

实施例2含有突变型高稳定SOD基因的重组载体构建

根据SEQ ID NO.2设计引物，分别引入酶切位点(优选BamHI和EcoRI)，引物序列如下：

F1：SEQ ID NO.3：CGggatccATGCAGCTGCATCATAGCA(小写为BamH I位点)；

R1：SEQ ID NO.4：CGgaattcTTTTTTACATGCG(小写为EcoRI位点)；

以含有SEQ ID NO.2所示基因序列的pET28a载体为模板，F1和R1为引物，进行PCR反应。

具体反应体系和步骤如下：

1、按如下体积加样进行PCR反应：

模板DNA：200ng；F1 1μL，R1 1μL；FAST DNA聚合酶1μL；10×buffer 5μL；ddH

2、用漩涡震荡器混匀反应液。

3、用离心机短暂快速离心使EP管壁上的液体流下来。

4、在PCR仪上设置好程序，按下列条件在PCR仪上进行PCR反应：

95℃，3min；95℃，30s；55℃，45s；72℃，2min；72℃，10min；4℃，2hr。

5、取出样品4℃保存，以备后续凝胶电泳鉴定分析PCR结果。

6、将PCR产物用BamH I和EcoR I双酶切，与同样经过BamH I和EcoR I双酶切的表达载体(优选pET28a)连接：在EP管中分别加入10μL的Solution I(购买厂家：上海生工)，7μLPCR扩增纯化产物和3μL纯化的酶切载体(购买厂家：上海生工)，使总体积保持在20μL。在16℃水浴中反应30min，获得连接产物重组表达载体pET28a-SOD。

实施例3重组表达菌的构建

一)感受态细胞制备

通过划线法将菌种保存管中的BL21接种于LB平板，37℃培养过夜后挑取单菌落置于20mLLB液体培养基中37℃培养8h，随后转接至100mL液体培养基中继续培养至OD

二)连接与转化

1、将上述10μL实施例2制得的重组表达载体pET28a-SOD加入到100μL感受态细胞的EP管中，用枪头轻轻搅拌，不可吹打。

2、将步骤1中的EP管冰浴30min，30min之后将EP管放置42℃恒温水浴锅里水浴90秒，90秒过后，再将其冰浴3min。

3、在步骤2的EP管中加入1mL的预热LB培养基，放37℃摇床振荡培养1小时。

4、将步骤3中的EP管放置4℃、3000转速的离心机中离心10min，去部分上清液，留400μL菌液。

5、将步骤4中的菌液用枪头吹打，取200μL菌液涂板，涂板后放置37℃培养箱里培养，半小时后翻板(倒置一次)，培养过夜。

6、挑取单克隆进行菌落PCR并送至测序机构进行测序鉴定(金唯智生物)，筛选出测序正确的单克隆后，即获得可表达高稳定突变重组人源SOD的重组表达菌BL21-pET28a-SOD。

实施例4重组高稳定突变型人源SOD蛋白的诱导表达和纯化

1.将带有鉴定正确的带有pET28a-SOD载体的BL21(DE3)转接至20mL摇瓶并加入50μg/mL的Kana抗生素，37℃摇床180rpm培养过夜。

2.过夜培养的菌液以1:100比例转接如200mLLB液体培养基中，37℃摇床180rpm培养至OD

3.诱导完成后，6000rpm，4℃，5min收集菌体，加入PBS反复冲洗残余培养基。

4.12000rpm，4℃，5min，弃掉上清后加入5mLBindingbuffer将菌体重悬，并加入1mmol/LPMSF(蛋白酶抑制剂)。

5.将样品置于冰水混合物中，超声破碎，直至菌液澄清透亮。

6.12000rpm，4℃，30min离心，将上清转移至预冷的新离心管中。

7.将上清液和Chelatingsepharose镍鳌合柱(17-5247-05)一并加入蛋白纯化管中，充分混匀，4℃孵育2h。

8.用50mLWashingbuffer(终浓度为50mMTris-HClpH8.0,300mM NaCl,80mM咪唑的MQ溶液)冲洗柱床。

9.蛋白纯化柱加入5mL洗脱液洗脱蛋白，每500μL收集1管，共收集10管。

10.每管吸取10μL加入提前配置好的100μL考马斯亮蓝溶液中，根据颜色深浅初步判断蛋白浓度。

11.将蛋白含量高的收集管中的蛋白液合并，于G25脱盐柱脱盐后-20℃保存。

12.将透析完成的蛋白取出20μL作为SDS-PAGE样品，剩余蛋白分装后，-80℃保存备用。

蛋白纯化结果如图1(图中，M：蛋白Marker；1：超声破碎沉淀；2：镍柱流穿1；3：镍柱流穿2；4：洗脱液1(20mMPB，500mMNaCl，50mM咪唑，pH7.4)；5：洗脱液2(20mMPB，500mMNaCl，100mM咪唑，pH7.4)；6：洗脱液3(20mMPB，500mMNaCl，150mM咪唑，pH7.4)；7：洗脱液4(20mMPB，500mMNaCl，300mM咪唑，pH7.4)；结果显示洗脱液2洗脱效果最佳，所得SOD量最高，而其他浓度梯度的洗脱液不适合用于本专利中SOD的镍柱洗脱。

实施例5重组高稳定突变型人源SOD蛋白的浓度及活性检测

按照GBT5009.171第一法检测实施例4得到的SOD酶活。重组高稳定突变型SOD蛋白酶活结果测得为突变的高稳定菌SOD酶活为30000U/mg，未突变的重组野生型SOD酶活为10000U/mg。其中，未突变的重组野生型SOD是采用实施例1-4提到的方法，表达纯化得到的如SEQ ID NO.5所示的未突变的重组野生型SOD蛋白。

实施例6高稳定重组突变型SOD蛋白抗逆性实验

测定SOD对酸碱的耐受性，将纯化的SOD分别置于25℃下pH1～10的缓冲液中温育90min后，用上述标准(GBT5009.171)反应(pH7.8，25℃)测定SOD的剩余活性。

尽管对照SOD(重组野生型SOD)和高稳定突变人源SOD的最适pH相同，但高稳定突变人源SOD在pH值1～10的广泛范围内表现出了极强的稳定性。相对而言对照SOD在这个pH范围内相当不稳定，在pH6-8的范围之外剩余活性就已经不到最大活性的60％。

为了评估超稳定SOD在工业上的应用价值，我们研究了抑制剂、清洁剂、变性剂对酶活性的影响，通过将酶置于不同浓度的EDTA、β-Me、SDS、盐酸胍中来检测酶的抗逆性。超稳定SOD比起它对照SOD来说有更强的抗逆性和耐受性。当在2.5M盐酸胍中温育30min后，对照SOD的剩余活性为83％，而超稳定SOD几乎没有活性损失(如图2中C所示)。此外，在40％乙醇中温育30min后超稳定SOD的剩余活性为92％，而对照的剩余活性几乎为0。

实施例7高稳定重组突变型SOD蛋白热稳定性实验

将实施例5所述的重组高稳定突变型SOD蛋白rSOD

实施例8高稳定重组突变型SOD在模拟胃液中的稳定性

分别将1mL浓度为2mg/mL的rSOD

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，本发明不限于以上实施例，还可以有很多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容中直接导出或联想到的所有变形，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。