一种藜芦组织培养方法

技术领域

本发明属于药用植物组织培养技术领域，尤其涉及一种藜芦组织培养方法。

背景技术

藜芦，百合科藜芦属植物，以根部或带根全草入药，具有祛痰、催吐和杀虫的功能，近年被进一步开发为生物农药制备原材料。在传统的藜芦生产中，通常以种子繁殖、育苗移栽的方式进行。相较于播种育苗栽培，无性繁殖方式具有生长速度快、开花结果早、能保持母本优良特性的优点。

但当前阶段对藜芦无性繁殖研究较少。CN 106105688 A(公开日期2016.11.16)公开了一种红森藜芦扦插繁殖方法，其操作简单，繁殖效率快。除扦插外，建立无菌体系有利于对藜芦种质资源的收集利用，但藜芦的无菌苗获得的方法公布的较少，常规的方法以种子或花序作为外植体，经过无菌消洗后可以获得藜芦的无菌外植体，再进行组织培养。如CN109452176 A(公开日期2019.03.12)公开了一种药用植物藜芦幼胚离体培养方法，可将未成熟幼胚(种子)培养成苗，提升藜芦组织培养成苗生根率。然而，无论以种子作为外植体，还是以花序作为外植体，其来源均有明显的季节性，阻碍了藜芦无菌苗建立的效率。另外，通过种子获得的无菌苗，需要较长的时间生长，不能够为后期进一步的遗传转化处理提供足够的外植体；虽然通过花序获得无菌苗的方法可以在短时间内获得大量的无菌外植体，但不利于远距离运输，并且存在运输过程中存在污染的问题，影响无菌苗获得的效率。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种藜芦组织培养方法，以藜芦鳞茎为外植体进行组织培养，无季节性限制，且运输方便，污染率低，成苗时间短。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

一种藜芦组织培养方法，包括外植体的选择、消毒及接种培养，所述外植体为藜芦鳞茎；所述消毒包括体积浓度0.3％-0.5％Tween80溶液消毒10-15min，体积浓度95％酒精溶液消毒2-5min，有效氯浓度2％-5％NaClO溶液消毒2-5min，有效氯浓度0.2％-0.5％NaClO溶液消毒10-15min。

优选的是，去除藜芦根和根茎，冲洗干净，再去除鳞茎多余叶片和叶鞘，获得干净鳞茎，作为外植体。

优选的是，所述Tween80溶液、酒精溶液、NaClO溶液消毒后，均利用无菌水冲洗鳞茎3-5次。

优选的是，所述有效氯浓度2％-5％NaClO溶液消毒后，剥去鳞茎外部鳞片，并对半切成楔形鳞茎块，但不露出茎尖分生组织。

优选的是，所述有效氯浓度0.2％-0.5％NaClO溶液消毒后，剥去鳞茎茎尖分生组织上多余的叶片，留下3-5片鳞片进行接种培养。

优选的是，所述接种培养时，培养基包括基础培养基MS、蔗糖28-32g/L、琼脂7-9g/L、6-BA 0.8-1.2mg/L、NAA 0.1-0.3mg/L，pH 5.8±0.2。

优选的是，所述接种培养时，光照时间16h/8h，光照强度1000-1500Lx，温度25±1℃，持续4-10周。

相对于现有技术，本发明具有如下有益效果：

本发明提供了一种藜芦组织培养方法，通过使用藜芦鳞茎为外植体可以实现外植体的远距离运输，并且无季节限制。同时，配合适当的外植体消毒方法，污染率低，可以有效缩短获得无菌苗的时间，并且外植体在无菌条件下无生长休眠，生物量增长速度快，可以为后期遗传转化等利用提供足够的材料。

因此，本发明组织培养方法能够有效缩短获得藜芦无菌苗的时间，同时可在藜芦种子资源有限的情况下，短时间且不受季节影响获得多种高生物量的藜芦无菌苗，减少生产藜芦无菌苗获取成本。

附图说明

图1：藜芦鳞茎外植体接种培养1d、10d、50d生长情况；

图2：藜芦种子外植体接种培养1d、60d、105d生长情况。

具体实施方式

本发明提供了一种藜芦组织培养方法，包括外植体的选择、消毒及接种培养。

本发明外植体为藜芦鳞茎；优选去除藜芦根和根茎，冲洗干净，再去除鳞茎多余叶片和叶鞘，获得干净鳞茎，作为外植体。

本发明消毒包括体积浓度0.3％-0.5％Tween80溶液消毒10-15min，优选体积浓度0.4％Tween80溶液消毒12.5min；体积浓度95％酒精溶液消毒2-5min，优选体积浓度95％酒精溶液消毒3.5min；有效氯浓度2％-5％NaClO溶液消毒2-5min，优选有效氯浓度3.5％NaClO溶液消毒3.5min；有效氯浓度0.2％-0.5％NaClO溶液消毒10-15min，优选有效氯浓度0.35％NaClO溶液消毒12.5min。

本发明优选每种消毒液消毒后，均利用无菌水冲洗鳞茎3-5次，进一步优选冲洗鳞茎4次。

本发明优选有效氯浓度2％-5％NaClO溶液消毒后，剥去鳞茎外部鳞片，并对半切成楔形鳞茎块，但不露出茎尖分生组织，以防后续消毒造成分生组织死亡，影响植株生长。优选有效氯浓度0.2％-0.5％NaClO溶液消毒后，剥去鳞茎茎尖分生组织上多余的叶片，留下3-5片鳞片进行接种培养。

本发明优选接种培养时，培养基包括基础培养基MS、蔗糖28-32g/L、琼脂7-9g/L、6-BA 0.8-1.2mg/L、NAA 0.1-0.3mg/L，pH 5.8±0.2，进一步优选基础培养基MS、蔗糖30g/L、琼脂8g/L、6-BA 1mg/L、NAA 0.2mg/L，pH 5.8。作为一种可实施方式，培养基制备步骤如下：称取MS培养基4.74g，蔗糖30g，琼脂8g/L，加水定容至1L，加入1mg 6-BA、0.2mg NAA，调节pH至5.8，121℃灭菌30min。

本发明优选接种培养时，光照时间16h/8h，光照强度1000-1500Lx，进一步优选光照强度1250Lx，温度25±1℃，进一步优选25℃，培养持续4-10周，获得藜芦无菌苗。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

一种藜芦组织培养方法，包括以下步骤：

(1)外植体的选择：

采集获得藜芦植株，原鳞茎去除根和根茎后放置于流水中冲洗，再去除多余的外部叶片和叶鞘，获得干净的鳞茎块；

(2)消毒处理：

(2.1)将鳞茎块浸没在体积浓度0.4％Tween80溶液中搅拌浸泡12.5min，用无菌水冲洗4次；

(2.2)将鳞茎块浸没在体积浓度95％酒精溶液中3.5min，用无菌水冲洗4次，转移材料到无菌操作台上；

(2.3)将鳞茎块进一步在有效氯浓度3.5％NaClO溶液中浸泡3.5min，用无菌水冲洗4次，并将鳞茎块外部鳞片进一步剥除，将鳞茎块对半切开成楔形鳞茎块，注意此时不能够将茎尖分生组织暴露出来；

(2.4)切好的楔形鳞茎块放到有效氯浓度0.35％NaClO溶液中消洗12.5min后无菌水冲洗4次，剥离掉茎尖分生组织上多余的叶片，留下3-5片鳞片即可得到茎尖组织；

(3)接种培养：

将步骤(2.4)的茎尖组织接种至培养基(称取MS培养基4.74g，蔗糖30g，琼脂8g/L，加水定容至1L，加入1mg 6-BA、0.2mg NAA，调节pH至5.8，121℃灭菌30min)中，在光照培养箱下培养4-10周，培养条件16/8h，25±1℃，1250Lx培养。

实施例2

一种藜芦组织培养方法，包括以下步骤：

(1)外植体的选择：

采集获得藜芦植株，原鳞茎去除根和根茎后放置于流水中冲洗，再去除多余的外部叶片和叶鞘，获得干净的鳞茎块；

(2)消毒处理：

(2.1)将鳞茎块浸没在体积浓度0.3％Tween80溶液中搅拌浸泡15min，用无菌水冲洗3次；

(2.2)将鳞茎块浸没在体积浓度95％酒精溶液中2min，用无菌水冲洗3次，转移材料到无菌操作台上；

(2.3)将鳞茎块进一步在有效氯浓度2％NaClO溶液中浸泡5min，用无菌水冲洗3次，并将鳞茎块外部鳞片进一步剥除，将鳞茎块对半切开成楔形鳞茎块，注意此时不能够将茎尖分生组织暴露出来；

(2.4)切好的楔形鳞茎块放到有效氯浓度0.2％NaClO溶液中消洗15min后无菌水冲洗3次，剥离掉茎尖分生组织上多余的叶片，留下3-5片鳞片即可得到茎尖组织；

(3)接种培养：

将步骤(2.4)的茎尖组织接种至培养基(称取MS培养基4.74g，蔗糖28g，琼脂7g/L，加水定容至1L，加入0.8mg 6-BA、0.1mg NAA，调节pH至5.6，121℃灭菌30min)中，在光照培养箱下培养4-10周，培养条件16/8h，25±1℃，1000Lx培养。

实施例3

一种藜芦组织培养方法，包括以下步骤：

(1)外植体的选择：

采集获得藜芦植株，原鳞茎去除根和根茎后放置于流水中冲洗，再去除多余的外部叶片和叶鞘，获得干净的鳞茎块；

(2)消毒处理：

(2.1)将鳞茎块浸没在体积浓度0.5％Tween80溶液中搅拌浸泡10min，用无菌水冲洗5次；

(2.2)将鳞茎块浸没在体积浓度95％酒精溶液中5min，用无菌水冲洗5次，转移材料到无菌操作台上；

(2.3)将鳞茎块进一步在有效氯浓度5％NaClO溶液中浸泡2min，用无菌水冲洗5次，并将鳞茎块外部鳞片进一步剥除，将鳞茎块对半切开成楔形鳞茎块，注意此时不能够将茎尖分生组织暴露出来；

(2.4)切好的楔形鳞茎块放到有效氯浓度0.5％NaClO溶液中消洗10min后无菌水冲洗5次，剥离掉茎尖分生组织上多余的叶片，留下3-5片鳞片即可得到茎尖组织；

(3)接种培养：

将步骤(2.4)的茎尖组织接种至培养基(称取MS培养基4.74g，蔗糖32g，琼脂9g/L，加水定容至1L，加入1.2mg 6-BA、0.3mg/LNAA，调节pH至6.0，121℃灭菌30min)中，在光照培养箱下培养4-10周，培养条件16/8h，25±1℃，1500Lx培养。

实施例4

藜芦不同外植体及消毒方法培养效果差异

方式一：以鳞茎为外植体，按实施例1藜芦组织培养方法进行无菌苗培养。

方式二：以藜芦种子为外植体，进行无菌苗培养，包括以下步骤：

藜芦种子无菌水浸泡2次，去掉浮在水面的不饱满种子；体积浓度75％酒精消毒30-60s，无菌水冲洗3-5次，有效氯浓度5％NaClO涡旋3-5min，无菌水冲洗3-5次，体积浓度5％H

培养结果如图1和图2所示，采集的藜芦鳞茎外植体经无菌消毒后，培养10d已获得无菌体系，50d后藜芦外植体生根，以及明显的叶片生长；而藜芦种子萌发周期较长，无菌消毒接种60d后至萌发期，生长三个月后藜芦幼芽还未生根。以鳞茎作为外植体，相较于藜芦种子，外植体材料易获得、无菌体系时间缩短且生物量显著高于对照组。

方式三：以藜芦花序为外植体，进行无菌苗培养，包括以下步骤：

采集获得的花序首先去除主茎后放置于流水中冲洗1-3h，去除多余的外部茎段，获得干净的花序，之后按照实施例1的消毒方式和培养方式进行后续组织培养，获得无菌苗。

花序消毒接种7d统计试验结果，本次试验共45个花序外植体，39个污染，污染率达87％；10d后统计藜芦花序污染率达100％。以鳞茎作为外植体，相较于藜芦花序，外植体材料易消毒、无菌体系时间缩短。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。