细胞生物合成聚D-乳酸和聚L-乳酸的方法

本发明涉及通过直接发酵由工程化原核或真核细胞从碳源产生聚L-乳酸(PLLA)或由工程化真核细胞从糖产生聚D-乳酸(PDLA)的方法。本发明还涉及使代谢流重定向以从碳源开始合成对映异构纯聚合物(如PDLA或PLLA)的细胞，所述碳源优选地衍生自生产链的残余生物质。

现有技术

聚乳酸(PLA)是衍生自乳酸的可生物降解生物聚合物。归因于其化学-物理特性，它是不分枝脂族聚酯，属于热塑性聚合物类别。因为其特征，PLA十分类似于聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)，一种主要用于食品包装的常见塑料。PET具有石油化学起源，而PLA从聚合乳酸获得，后者转而通过发酵获得(Jamshidian等人,2010；Tsuji等人,2011)。避免基于使用油(一种因人类快速消费正在耗尽的化石资源)的方法而有利于生物基系统的需要正驱动数家公司使用生物塑料。

许多领域中存在PLA的数种应用，如：食品领域(包装、盘子、餐具、眼镜、瓶，连同其他等)、3D打印，其中它可以替代丙烯腈丁二烯苯乙烯(ABS)，和医学领域(例如生物相容缝线、药物输送用胶囊，连同其他等)(Garlotta,2001；Rasal等人,2010；Xiao等人,2012)。PLA的多用性允许在挤出中和注塑中打印成品，并且显而易见，可以使用已经为PET开发的机器和基础设施(Jamshidian等人,2010)。

PLA可以用母料染色并且与其他塑料(可生物降解或不可生物降解、石油化学起源或非石油化学起源)混合，以获得有性能的复合物。此外，可以得到共聚物形式的PLA，其中乳酸单体与其他羟酸如3-羟丁酸酯(3HB)或羟乙酸酯交替存在(Choi等人,2016；Xiao等人,2012；Tsuji等人,2010)。

PLA，不同于传统塑料如PET，在环境中可生物降解并且是可生物分解的，即有机废弃物当中的一次性废弃物。因此，PLA目标产品，一旦其生命周期已经结束，则由土壤重吸收，有利于形成可以进一步用于产生PLA的新的生物质(Tsuji等人,2011；Chen和Patel,2012)。因此，PLA具有环状供应链，原因在于其源自可再生生物质和其固有的生物可降解性。

全球PLA市场(2017年约21万吨/年)稳定增长并且与2017的记录相比，预计截止2022，生产增加50％(www.european-bioplastics.org/market/)。取决于组分单体的对映异构形式，存在三种PLA：仅由L-乳酸单体组成的PLLA、仅由D-乳酸单体组成的PDLA和由两种单体的混合物组成的PDLLA(Jamshidian等人,2010；Tsuji等人,2011)。PDLA和PLLA处于半结晶性形式，而PDLLA处于非晶态形式(Tsuji等人,2011)。构成PLA的单体的手性转移给聚合物本身(这里是PDLA或PLLA)，后者获得精确手性。这以固体形式导致毗邻的第一链之间的不同相互作用并导致两种单一对映异构体特有的可能层状或晶体结构，所述结构可以至少部分地保留手性。特别地，甚至以薄膜形式，PDLA或PLLA可以呈现特定对映异构体特有的表面形态和至少局部手性(Maillard和Prud’homme,2010)，显示圆二色性现象。

但是，考虑到化学-物理特征，这些聚合物彼此十分相似，例如它们可溶于同一有机溶剂(例如苯、氯仿、乙腈等)中。另外，在主要取决于聚合物分子量的熔融温度(Tm约180℃)、分解温度(约200℃)和伸长率(20-30％)方面不存在显著差异(Xiao等人,2012)。从商业观点看，市场为PLLA统治，其主要用于生产一次性物品。相反，PDLA在医学领域具有更合乎生境的市场和应用，因为它例如可以对伤口愈合具有两种有益作用：(i)作为水凝胶，提供保护性屏障；和(ii)通过阻隔乳酸盐充当镇痛药(Goldberg,2014)。

传统上，通过化学合成产生PLA(其对映异构纯和非纯形式)，始于通过发酵获得的乳酸。不同于其他生物塑料，如聚羟链烷酸酯(PHA)，无已知的天然生物能够直接合成PLA(Chen和Patel,2012)。PLA的工业生产主要通过开环聚合，借助能够促进反应的称作丙交酯的环状中间体进行。但是，这个化学过程具有降低这种生物塑料的环境可持续性的多方面：(i)为完成聚合，需要使用辛酸锡作为催化剂和(ii)为允许化学聚合，需要乳酸处于其质子化形式而不处于乳酸盐形式(Garlotta,2001；Jamshidian等人,2010；Rasal等人,2010；Tsuji等人,2011)。但是，由于PLA的主要供应链涉及使用乳酸细菌，故必需处理具有大量酸的最终发酵产物。实际上，为了允许这些生物生长，需要维持培养液的pH恒定于值5左右(Okano等人,2010)。由于乳酸的pK

尽管与基于油的生产相比，乳酸发酵已经代表了走向生产生物塑料的可持续步骤，旨在进一步减少基于化学聚合的常规方法的影响，但直接微生物合成代表了理想的解决方案。如先前提到，自然界中已知没有生物能够积累聚乳酸。然而相反，不同于真核生物，许多原核生物能够产生脂族聚酯作为储备聚合物。因此，开发和使用生产聚乳酸的真核细胞需要深入和新型的工程化。

发明概述

本发明涉及一种完全一步生物合成PDLA和/或PLLA的方法，和为这个目的而工程化的真核细胞。两种生物合成均包括将碳源生物转化成PDLA和/或PLLA。本发明的代谢途径包括丙酮酸盐生物转化成乳酸盐，随后用CoA供体、优选地乙酰-CoA活化，活化成乳酰-CoA并接着聚合成PDLA和/或PLLA。

能够产生PDLA的真核细胞实例已经由Dusseaux等人(WO2017/108577)描述。但是，这种方案相当复杂。实际上，这种方案需要向用于产生PDLA的培养基添加乳酸及开发一种两相工艺。因此，必须通过不同细胞工厂和/或通过化学合成产生乳酸。在这个方面，乳酸应当视为强制性底物并且不像是中间产物(此处公开的本发明，参见下文)。作为底物，需要减弱或消除消耗乳酸作为碳源的能力。另外，这种方案还需要增加胞内辅酶A(CoA)供体生产率的方法。可以通过促进胞内CoA供体积累和/或通过破坏利用CoA的途径，获得这个目标。

令人惊讶地，尽管PLLA的工业应用更广泛并且和与产生PDLA有关的研究技能众多，但从未描述过能够产生PLLA的原核细胞或真核细胞实例。

为了验证允许使碳源、优选地葡萄糖转化成PDLA和/或PLLA的代谢途径的插入，使用工程化酵母株进行了不同实验，显示产生这些聚合物(参见实施例8-10)。图5显示始于葡萄糖的PDLA和/或PLLA合成途径的详细示意图，由本发明的发明人在酵母细胞中转化。

在文献中存在以下实例：基因修饰大肠杆菌(Escherichia coli)细菌的，以直接产生纯的或与3-HB或其他单体的共聚物形式的PDLA(Cho等人,WO2006/126796；Jung等人,2010；Yang等人,2010；Choi等人,2016)。但是，大肠杆菌的使用具有两个主要局限：(i)在发酵过程期间，不同于真核细胞，前述微生物可能受细菌噬菌体攻击(Marcó等人,2012)和(ii)大肠杆菌代谢以其中乳酸不是唯一发酵产物的混合型酸发酵为特征，后续影响目的代谢物的生产产率(

本发明的主题因此是一种在特征为将碳通量指向合成PDLA和/或PLLA的细胞中产生PLLA或PDLA的方法。

PDLA合成包括以下步骤：

i)在工程化的真核细胞中使丙酮盐转化成D-乳酸盐

ii)通过用CoA供体、优选地乙酰-CoA使D-乳酸盐硫酯化，合成D-乳酰-CoA；

iii)使D-乳酰-CoA分子聚合成PDLA。

PLLA合成包括以下步骤：

i)在工程化的原核或真核细胞中使丙酮盐转化成L-乳酸盐；

ii)通过用CoA供体、优选地乙酰-CoA使L-乳酸盐硫酯化，合成L-乳酰-CoA；

iii)使L-乳酰-CoA分子聚合成PLLA。

细胞表达编码酶的基因，所述酶旨在将碳通量指向PDLA和/或PLLA合成。

在一个优选的实施方案中，前述细胞是真核细胞，优选地酵母细胞、更优选地酵母属(Saccharomyces)细胞并且甚至更优选地酿酒酵母细胞。

以举例方式，N.J.W.Kreger-van Rij,1987的"The Yeasts"中描述了酵母。特别地、酵母属可以是酵母属、接合酵母属(Zygosaccharomyces)、假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、德巴利酵母属(Debaromyces)、拿逊酵母属(Nadsonia)、油脂酵母属(Lipomyces)、球拟酵母属(Torulopsis)、克勒克氏酵母属(Kloeckera)、毕赤酵母属(Pichia)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、三角酵母属(Trigonopsis)、酒香酵母属(Brettanomyces)、隐球酵母属(Cryptococcus)、丝孢酵母属(Trichosporon)、短梗霉属(Aureobasidium)、油脂酵母属(Lipomyces)、法夫酵母属(Phaffia)、红酵母属(Rhodotorula)、耶罗维亚酵母属(Yarrowia)或许旺酵母属(Schwanniomyces)，等等。优选地，酵母选自酵母属，并且优选地是酿酒酵母。优选地，酿酒酵母株是BY4742(EuroScarf登录号.Y10000)、CEN.PK102-5B(MATa、ura3-52、his3-11、leu2-3/112、TRP1、MAL2-8c、SUC2)和113-11C(MATa、ura3-52、his3-11、TRP1、MAL2-8c、

可以通过使用强力和组成型内源启动子，或通过引入外源基因的更多拷贝或通过转换具有密码子优化核苷酸变体的核苷酸序列，实现由本发明的发明人引入的基因的协调和适当受调节表达，所述基因编码涉及新代谢途径的酶。这些方法无论如何是属于本领域专家能力的例行技术。

在本发明的一个实施方案中，真核细胞能够通过表达引入其中的编码涉及聚合物合成的酶的外源基因，产生PDLA。在一个优选的实施方案中，涉及前述PDLA产生的酶是：i)D-乳酸脱氢酶(EC 1.1.1.28)、ii)丙酰-CoA转移酶(EC 2.8.3.1)、iii)聚羟链烷酸酯合酶(EC 2.3.1.B3)。任何D-乳酸脱氢酶、丙酰-CoA转移酶和聚羟链烷酸酯合酶，无论由内源基因或异源基因编码，均可以根据本发明的方法使用。在一个优选的实施方案中，编码D-乳酸脱氢酶的异源基因是大肠杆菌ldhA(基因ID：946315NC_000913.3)的突变形式。具体而言，这个序列具有以下核苷酸突变：T387C、A537G、T636C、A663T、A726G、G777A、A798G、G825A、C828T、C885T(SEQ ID NO:1)。

在另一个的优选实施方案中，丙酰-CoA转移酶是丙酸梭菌(Clostridiumpropionicum)丙酰-CoA转移酶(Pct)的突变形式。这种称作Pct540的突变形式在位置193处具有氨基酸置换，其中缬氨酸由丙氨酸替换(V193A)(Park等人,WO2009/022797；Yang等人,2010)。优选地，按Pct540形式突变的编码丙酸梭菌Pct(基因ID：AJ276553)的异源基因的“密码子选择”为酵母中翻译而优化(SEQ ID NO:2)。

在另一个的优选实施方案中，聚羟链烷酸酯合酶是食树脂假单胞菌(Pseudomonasresinovorans)聚羟链烷酸酯合酶C1(PhaC1)的突变形式。这种称作PhaC1437Pre的突变形式具有四个氨基酸置换，其中位置130处的谷氨酸由天冬氨酸替换(E130D)、位置325处的丝氨酸由苏氨酸替换(S325T)、位置477处的丝氨酸由甘氨酸替换(S477G)、位置481处的谷氨酰胺由赖氨酸替换(Q481K)(Yang等人,2011)。优选地，按PhaC1437Pre形式突变的编码食树脂假单胞菌PhaC1(基因登录号：AF129396)的异源基因的“密码子选择”为酵母中翻译而优化(SEQ ID NO:3)。

在本发明的另一个实施方案中，细胞能够通过表达引入其中的编码涉及聚合物合成的酶的外源基因，产生PLLA。涉及前述产生的酶是：i)L-乳酸脱氢酶(EC 1.1.1.27)、ii)丙酰-CoA转移酶(EC 2.8.3.1)、iii)聚羟链烷酸酯合酶(EC 2.3.1.B3)。任何L-乳酸脱氢酶、丙酰-CoA转移酶和聚羟链烷酸酯合酶，无论由内源基因或异源基因编码，均可以根据本发明的方法使用。在一个优选的实施方案中，编码L-乳酸脱氢酶的异源基因是植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)ldh1基因(基因登录号：X70926)的突变形式。具体而言，这个序列具有以下核苷酸突变：T1A、T48C、C160G、G255T、G905C(Branduardi等人,2006)(SEQ IDNO:4)。

在另一个的优选实施方案中，丙酰-CoA转移酶是丙酸梭菌丙酰-CoA转移酶(Pct)的突变形式。这种称作Pct540的突变形式在位置193处具有氨基酸置换，其中缬氨酸由丙氨酸替换(V193A)(Park等人,WO2009/022797；Yang等人,2010)。优选地，按Pct540形式突变的编码丙酸梭菌Pct(基因ID：AJ276553)的异源基因的“密码子选择”为酵母中翻译而优化(SEQ ID NO:2)。

在另一个的优选实施方案中，聚羟链烷酸酯合酶是食树脂假单胞菌(Pseudomonasresinovorans)聚羟链烷酸酯合酶C1(PhaC1)的突变形式。这种称作PhaC1437Pre的突变形式具有四个氨基酸置换，其中位置130处的谷氨酸由天冬氨酸替换(E130D)、位置325处的丝氨酸由苏氨酸替换(S325T)、位置477处的丝氨酸由甘氨酸替换(S477G)、位置481处的谷氨酰胺由赖氨酸替换(Q481K)(Yang等人,2011)。优选地，按PhaC1437Pre形式突变的编码食树脂假单胞菌PhaC1(基因登录号：AF129396)的异源基因的“密码子选择”为酵母中翻译而优化(SEQ ID NO:3)。

令人惊讶地，涉及PLLA产生的丙酰-CoA转移酶活性和聚羟链烷酸酯合酶活性与合成PDLA所需要的那些活性相同。出乎意料地，本发明公开了丙酰-CoA转移酶(Pct)和聚羟链烷酸酯合酶C1(PhaC1)可以高效地接受其对映异构L形式的底物。文献中不存在以下证据：酶丙酰-CoA转移酶(Pct)可以“在体内”接受对映异构L形式的底物。文献中报道的唯一研究已经“在体外”由Schweiger和Buckel(1984)实施，并且它显示，虽然酶催化作用可以对两种异构体发生，但与相应的L形式相比，酶对于D-乳酸盐具有明确的底物偏好。

类似地，考虑聚羟链烷酸酯合酶，文献中没有这种酶对于对映异构L形式的单体实施聚合的实例，与考虑的聚羟链烷酸酯合酶无关(I、II、III型)。这明确地记录于已知酶的主要数据库之一BRENDA中(https://www.brenda-enzymes.org/enzyme.php？ecno＝2.3.1.B2，https://www.brenda-enzymes.org/enzyme.php？ecno＝2.3.1.B3，https://www.brenda-enzymes.org/enzyme.php？ecno＝2.3.1.B4)。一致地，公开的在细胞中产生乳酸盐均聚物和共聚物实际上指完全D形式的乳酸盐单体的聚合(Dusseaux等人,WO2017/108577；Lee等人,US9120891；和Cho等人,WO2006/126796)。

因此，令人惊讶的是，本发明的细胞能够产生由对映异构L形式的乳酸盐单体组成的聚酯生物聚合物。如果我们考虑到(天然或为此目的工程化的)细胞合成的聚酯生物聚合物并不由对映异构L形式的单体构成，这更令人惊讶：明确实例是共有生物塑料性能的其他聚合物如聚羟链烷酸酯(PHA)，它们拥有完全D形式的单聚体单位(Singh和Yakhmi,2017)。

由于乳酸是用来产生PDLA和/或PLLA的关键中间体，通过工程化已知基因的表达水平，从葡萄糖和/或其他糖胞内产生这种酸导致了乳酸产生增加和因此PDLA和/或PLLA产生增加。高效使用葡萄糖和/或戊糖糖(木糖、阿拉伯糖)的已知工程化途径可以用来从糖产生PDLA和/或PLLA，所述糖衍生自残余生物质，并且因此这些途径不与农业-食品链竞争。

因此，根据又一个实施方案，通过克隆至少一个编码负责糖内化和/或分解代谢的蛋白质的基因，能够产生PLLA/PDLA的细胞包含胞内水平高于相应野生型细胞的糖和/或源自这些糖的分解代谢中间体。根据一个优选实施方案，所述糖选自葡萄糖和源自化学水解和/或酶促水解残余生物质的糖类(酶属于漆酶、水解酶、纤维素酶和半纤维素酶的超家族，参见Kumar等人,2009)。优选地，所述糖类是己糖和戊糖，包括葡萄糖、甘露糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖及其混合物。因此，可以在一个过程中产生目的聚合物，所述过程包括通过酶促和/或化学物理手段，例如通过蒸气爆炸手段水解残余生物质，这导致富含简单糖的溶液。

此外或备选地，可以通过消除与乳酸产生相竞争的途径，升高胞内乳酸水平。作为说明性和非限制性实例，可以缺失编码丙酮酸脱羧酶(即PDC1基因ID：850733，序列NC_001144.5；PDC5基因ID ID：850825，序列NC_001144.5；PDC6基因ID：852978，序列NC_001139.9)和/或导致乙醇形成的醇脱氢酶(即ADH1基因ID：854068，序列NC_001147.6)的基因。

因此，在又一个方面，本发明提供一种产生PLLA或PDLA的方法，所述方法包括以下步骤：

(i)在包含碳源的培养基中培养如本文所述的细胞；

(ii)回收含有聚合物的细胞物质；

并且任选地

(iii)从细胞提取PLLA或PDLA。

用于产生PLLA的细胞可以是原核或真核的。用于产生PDLA的细胞是真核的。在一个优选的实施方案中，真核细胞是酵母细胞、更优选地酵母属细胞和甚至更优选地酿酒酵母细胞。在本发明产生PDLA和/或PLLA的方法的又一个优选的实施方案中，可以在葡萄糖和源自残余生物质水解的其他糖(即己糖、戊糖)当中选择前述碳源。优选地，所述糖是己糖、优选地葡萄糖、或戊糖、优选地木糖和/或阿拉伯糖，及其混合物。

在本发明产生PDLA和/或PLLA的方法的又一个优选的实施方案中，所述碳源可以按10g/L至1000g/L、优选地20g/L和100g/L的量存在。

在另一个的优选实施方案中，培养基未补充乳酸。

可以使用溶剂从细胞中进行PDLA和/或PLLA提取。备选地，可以直接使用含有聚合物的细胞生物质。

附图

图1显示携带源自大肠杆菌的ldhA基因的重组载体pTEFLEU2-ldhA的图；

图2显示携带源自植物乳杆菌的ldh1基因的重组载体pTEFLEU2-ldh1的图；

图3显示携带源自丙酸梭菌(C.propiomicum)的Pct540基因的重组载体pYX212-Pct540的图；

图4显示携带源自食树脂假单胞菌(P.resinovorans)PhaC1的PhaC1437Pre基因的重组载体pYX022-PhaC1437Pre的图；

图5显示始自葡萄糖经丙酮酸根、D-乳酸根和D-乳酰CoA产生PDLA的代谢途径(小图A)和从葡萄糖经丙酮酸根、L-乳酸根和L-乳酰CoA产生PLLA的代谢途径(小图B)；

图6显示提供葡萄糖20g/L作为碳源，用于产生PDLA的工程化菌株、用于产生PLLA的工程化菌株和仅表达ldhA和Pct540基因的对照菌株随时间推移的细胞生长趋势的代表性曲线(上半小图)；直方图涉及葡萄糖至乙醇和葡萄糖至甘油的转化产率(下半小图)；

图7显示表达ldhA和Pct540的对照菌株(小图A)、用于产生PDLA的工程化菌株(小图B)和用于产生PLLA的工程化菌株(小图C)的点图，所述产生涉及经尼罗红染料染色的细胞发射的荧光。这些测量在自接种起的不同时间(24小时，48小时，72小时)用流式细胞术(FACS)进行；在曲线中，将620nm发射的荧光的强度在横坐标轴上按对数标度报告，而前向散射(FS)信号相对于细胞尺寸显示在纵坐标轴上。对全部分析固定的门表示尼罗红染色阳性细胞的百分数；

图8显示涉及纯(商业)乳酸的GC-MS分析的数据，所述乳酸经历酸性条件下甲醇分解。报告的色谱图涉及前5分钟分析。对于在保留时间2.26分钟获得的单峰，用乳酸甲酯鉴定百分数报告相对质谱。

图9显示涉及细胞的GC-MS分析的数据，将所述细胞经工程化以产生PDLA、冻干并且经历酸性条件下甲醇分解。报告的色谱图涉及前5分钟分析。对于在保留时间2.20分钟的峰，用乳酸甲酯鉴定百分数报告相对质谱；

图10显示涉及细胞的GC-MS分析的数据，将所述细胞经工程化以产生PLLA、冻干并且经历酸性条件下甲醇分解。报告的色谱图涉及前5分钟分析。对于在保留时间2.22分钟的峰，用乳酸甲酯鉴定百分数报告相对质谱；

图11显示涉及冻干细胞的前5分钟GC分析的色谱图，所述细胞表达ldhA和Pct并且经历甲醇分解；

图12显示涉及样品的GC-MS分析的数据，所述样品衍生自经工程化以产生PDLA并经历酸性条件下甲醇分解的冻干细胞的溶剂提取。报告的色谱图涉及前5分钟分析。对于在保留时间2.24分钟的峰，用乳酸甲酯鉴定百分数报告相对质谱。

定义

术语“生物质”定义可以在与其消耗相容的时间中再生的旨在用来产生生物能源和/或生物燃料和/或生物材料的任何有机源物质。这与化石生物质相反，后者的再生时间超过其消耗达几个数量级。

“残余生物质”意指来自农业(包括植物和/或动物复合物)和/或来自林业和/或相关产业(包括捕捞和/或水产养殖)的生物源废弃物和/或残余物的可生物降解部分、来自公共和私人绿地的刈草和修剪物以及工业和/或城市废弃物的可生物降解部分。

“生产产率”定义为所获产物的量和所消耗底物的量之间的比率。

术语“载体”表示一种DNA构建体，其包含与能够导致前述DNA在合适宿主中表达的控制序列连接的DNA序列。在本发明中，所用的常见质粒载体具有：a)或允许质粒有效复制，从而在所选宿主的每个细胞中存在质粒载体的数十个拷贝的复制起点，或允许质粒载体在所选宿主的每个细胞的染色体中整合的DNA序列；b)选择标记，从而可以选择经质粒载体正确转化的细胞；c)DNA序列，其包含限制性酶的识别位点以便通过一个称作连接的过程向质粒载体引入外源DNA。

如现有技术中通常报道，为了表达宿主细胞中插入的基因，编码性序列必须与所选表达宿主中发挥作用的转录、翻译和表达调节元件正确且有功能地联系。

此处使用的术语“转化”意指一旦引入细胞，DNA就可以在染色体外部或作为完整染色体的部分复制。

实施例

实施例1：构建携带ldhA基因的重组载体pTEFLEU2-ldhA。

使用大肠杆菌基因组DNA作为模板和特异性寡核苷酸(SEQ ID NO:5；SEQ ID NO:6)，通过PCR扩增ldhA基因的编码性序列。所述扩增过程如下：在98℃变性30秒后，25个循环(98℃变性10秒、72℃复性30秒和72℃延伸60秒)，接着72℃终末延延伸2分钟。将PCR产物和pTEFLEU2目标载体用EcoRI和Xho I限制性酶消化并且在连接它们后，获得重组pTEFLEU2-ldhA载体(图1)。

实施例2：构建携带ldh1基因的重组pTEFLEU2-ldh1载体。

从EcoRI限制性酶消化的载体p022TLP(Branduardi等人,2006)切下植物乳杆菌ldh1基因(SEQ ID NO:4)。将具有EcoRI末端的与ldh1基因相对应的DNA片段与EcoRI消化后的目标载体pTEFLEU2连接，导致获得重组表达载体pTEFLEU2-ldh1(图2)。

实施例3：构建携带Pct540基因的重组载体pYX212-Pct540。

已经从头合成丙酸梭菌Pct基因的突变形式Pct540的编码性序列(SEQ ID NO:3)，其前置有酿酒酵母pTDH3启动子的序列(SEQ ID NO:7)，并且由生产公司克隆入pEX-A2载体(Eurofins Genomics)，获得pEX-A2-Pct540载体。特别地，Pct540基因的序列具有针对酵母细胞优化的密码子选择。将pEX-A2-Pct540载体用限制性酶BglI线性化，并且从前述的线性化载体通过限制性酶KpnI和NheI消化切下pTDH3-Pct540 DNA片段。在限制性酶KpnI和NheI消化并且因此缺少酿酒酵母pTPI启动子的目标载体pYX212(R&D Systems,Inc.,Wiesbaden,D)中克隆具有KpnI/NheI末端的pTDH3-Pct540片段。连接两个DNA片段导致获得重组表达载体pYX212-Pct540(图3)。

实施例4：构建携带PhaC1437Pre基因的重组载体pYX022-PhaC1437Pre。

已经从头合成食树脂假单胞菌PhaC1基因的突变形式或PhaC1437Pre的编码性序列(SEQ ID NO:3)，其前置有酿酒酵母pADH1启动子的序列(SEQ ID NO:8)，并且由生产公司克隆入pEX-K4载体(Eurofins Genomics)。特别地，PhaC1437Pre基因序列具有针对酵母细胞优化的密码子选择。借助pEX-K4载体通过限制性酶AatII和NheI消化切下pADH1-PhaC1437Pre DNA片段。在限制性酶AatII和NheI消化并且因此缺少酿酒酵母pTPI启动子的目标载体pYX022(R&D Systems,Inc.,Wiesbaden,D)中克隆具有AatII/NheI末端的pADH1-PhaC1437Pre片段。连接两个DNA片段导致获得重组表达载体pYX022-PhaC1437Pre(图4)。

实施例5：构建用来产生PDLA的酿酒酵母重组株。

将酿酒酵母的CEN.PK实验室株用实施例1、3、4中分别描述的载体pTEFLEU2-ldhA、pYX212-Pct540和pYX022-PhaC1437Pre转化。图5A中显示重组株中始自葡萄糖经丙酮酸根、D-乳酸根和D-乳酰-CoA的PDLA合成代谢途径的图示。

实施例6：构建用来产生PLLA的酿酒酵母重组株。

将酿酒酵母CEN.PK实验室株用实施例2、3、4中分别描述的载体pTEFLEU2-ldh1、pYX212-Pct540和pYX022-PhaC1437Pre转化。图5B中显示重组株中始自葡萄糖经丙酮酸根、L-乳酸根和L-乳酰-CoA的PLLA合成代谢途径的图示。

实施例7：构建作为PLA合成的阴性对照的酿酒酵母重组株。

将酿酒酵母CEN.PK实验室株用pTEFLEU2-ldhA和pYX212-Pct540载体转化。前述重组株缺少聚羟链烷酸酯合酶活性，并且因此将在以下实施例中使用它作为PDLA和PLLA产生过程的阴性对照。实际上，独立于乳酸盐的立体化学，缺少聚羟链烷酸酯合酶活性不允许乳酰-CoA单体聚合。

实施例8：用于PDLA产生的工程化菌株中、用于产生PLLA的工程化菌株中和对照菌株中随时间推移的细胞生长趋势和主要胞外代谢物产生。

在20g/L葡萄糖和6.7g/L酵母氮基(YNB)存在下培育经工程化以产生PDLA的CEN.PK pTEFLEU2-ldhA，pYX212-Pct540，pYX022-PhaC1437Pre菌株的细胞、经工程化以产生PLLA的CEN.PK pTEFLEU2-ldh1，pYX212-Pct540，pYX022-PhaC1437Pre菌株的细胞和CEN.PK pTEFLEU2-ldhA，pYX212-Pct540菌株的细胞(作为对照使用)。将细胞按光密度0.05(OD 660nm)接种在100mL烧瓶内的20mL培养基中并且在30℃在回转摇床上按160转/分钟孵育。按固定时间间隔通过测量660nm处的OD，监测细胞生长。使用H

如图6(上半小图)中所示，经工程化以产生PDLA的CEN.PK菌株和用于产生PLLA的工程化菌株明显异于对照菌株的生长动力学。令人惊讶地，这些菌株特征在于，与用作对照的CEN.PK pTEFLEU2-ldhA，pYX212-Pct540菌株相比，细胞生长较慢且发酵结束时细胞生物质较少。另外，产生PDLA或PLLA的菌株的生长动力学的对比分析还显示一些差异，即便与先前比较更不明显。获得的结果与主要胞外代谢物的分析一致；用来产生两种聚合物的工程化菌株的葡萄糖转化成细胞生物质的转化产率较低实际上对应于与对照菌株CEN.PKpTEFLEU2-ldhA，pYX212-Pct540相比，葡萄糖转化成乙醇和甘油的转化产率较高。

通过这些实验展示了用基因转化的细胞中的碳通量重定向，所述基因编码产生PDLA和PLLA必需的酶活性。

实施例9：通过尼罗红染色评价PDLA产生或备选地PLLA产生。

如实施例8中所述培育经工程化以产生PDLA的CEN.PK菌株的细胞、用于产生PLLA的工程化菌株的细胞和仅表达ldha和Pct540基因的对照菌株的细胞。通过尼罗红染料染色评价PDLA的产生或备选地PLLA的产生。尼罗红通常用来评价活细胞中脂族生物聚合物如PHA或D-乳酸和其他羟酸的共聚物的积累，如文献中报道，例如Spiekermann等人,1999；Glorenflo等人,1999；Yang等人,2010。具体而言，自接种起24、48和72小时后，收集0.3OD的菌株细胞并且在离心后用1mL磷酸盐缓冲液(PBS；NaH

点图显示，经工程化以产生PDLA(小图B)和产生PLLA(小图C)的几乎全部细胞均为阳性尼罗红染色。特别地，在用于产生PDLA的工程化菌株和PLLA工程化菌株中，染色阳性细胞的最大百分数分别是84％和97％。相反，如可以在小图A中观察到，在仅表达ldhA和Pct540基因的对照细胞中，染色阳性细胞百分数可忽略并且可归因于尼罗红与细胞的结构性组分(如细胞膜)相互作用(Mukherjee等人,2007)。

鉴于尼罗红的荧光发射和脂族聚合物存在之间的直接相关性，报道的数据显示，意在产生PDLA和/或PLLA的代谢工程(图5)(本发明的目的)决定了这些聚合物在真核细胞中的积累。

因此，此处首次描述了真核细胞中不添加乳酸盐作为底物、无任何强制需要减弱或消除消耗乳酸作为碳源的能力和无任何强制需要增加胞内辅酶A(CoA)供体生产率的情况下，借助一步骤产生法合成PDLA。另外，此处首次描述了通过细胞直接合成PLLA。在文献中，无实例报道能够使羟酸(其中具有L构型手性中心的乳酸在它们当中)聚合的野生型细胞或工程化细胞。特别地，此处已经描述首次，聚羟链烷酸酯合酶能够使具有L构型手性中心的羟基酸单体聚合。

此外，在含20g/L糖蜜作为碳源、补充0.5μg/mL尼罗红染料的琼脂平板上培育经工程化以产生PDLA的CEN.PK菌株的细胞、用于产生PLLA的工程化菌株的细胞和仅表达ldha和Pct540基因的对照菌株的细胞。在30℃孵育4天后，在全部菌株中均观察到细胞生长，但是仅经工程化以产生PDLA的菌株和经工程化以产生PLLA的菌株分别能够胞内积累PDLA或PLLA，当暴露于紫外线时，它们的确导致尼罗红染色。

实施例10：通过GC-MS分析法分析PDLA或备选地PLLA。

为了评价细胞中积累的聚合物的组成(实施例9)，进行气相色谱质谱(GC-MS)分析。

在葡萄糖50g/L和YNB 6.7g/L存在下预接种用于产生PDLA的工程化菌株、用于产生PLLA的工程化菌株和仅表达ldha和Pct540基因的对照菌株的细胞。在30℃在回转摇床上按160转/分钟孵育的500mL烧瓶的100mL培养基中进行预接种。在生长24小时后，将细胞按0.2的初始OD660接种入2L生物反应器。生物反应器中使用的培养基的运行体积是1.5L并且其组成是：葡萄糖50g/L和YNB 13.4g/L。

生长参数是：恒定温度30℃；溶解氧量大于25％伴随通气量1vvm(每体积培养基的空气体积)；酌情添加4M NaOH和25％H

自接种起48小时后，通过离心收集细胞并且进行冻干并且随后进行酸甲醇分解，以破坏细胞并使乳酸聚合物解聚成乳酸甲酯单体单元。根据Braunegg等人(1978)改进的以下方案，进行甲醇分解：将细胞按1:1比率溶解于硫酸(3％v/v)酸化的甲醇溶液和氯仿中；将混合物在微波中按功率300W在120℃加热200分钟。通过GC-MS分析因甲醇分解细胞产生的溶液。

该仪器由Clarus 500气相色谱仪(PerkinElmer)和Clarus 560质谱仪(PerkinElmer)组成。GC配备Elite-5MS毛细管柱(PerkinElmer)。实施气相色谱分析的温度条件如下：70℃持续5分钟，升高10℃/分钟直至150℃，升高20℃/分钟以达到300℃，维持14.5分钟。将样品在初始温度250℃上样，维持10分钟。

图8显示与纯(商业化)乳酸盐样品有关的色谱图和质谱，其中将所述样品(根据甲醇分解方案)酯化成乳酸甲酯，作为后续分析的参比使用，所述后续分析对工程化以产生PDLA或备选地PLLA的细胞进行。在色谱图中仅存在一个峰，保留时间为2.26分钟，并且通过与NIST质谱文库比较，它显示与乳酸甲酯的97％识别率。

图9显示涉及用于产生PDLA的工程化菌株的GC-MS数据。保留时间2.20分钟的峰对应于乳酸甲酯，这种分子的识别率为90.5％。这个结果显示，乳酸是由细胞积累的生物聚合物的组分单体。色谱图中存在的附加峰可追溯至因溶胞细胞组分所释放的分子。

图10显示涉及用于产生PLLA的工程化菌株的GC-MS数据。保留时间2.22分钟的峰对应于乳酸甲酯，这种分子的识别率为85.6％。这个结果显示，乳酸是由细胞积累的生物聚合物的组分单体。这种情况下，色谱图中存在的附加峰也可追溯至因溶胞细胞组分所释放的分子。

图11显示涉及仅表达ldhA和Pct540基因的对照菌株的数据。色谱图显示可追溯至因细胞溶解所释放分子的峰，但是不显示与特征在于保留时间为约2.2分钟的乳酸甲酯有关的峰。该数据因此表明，图9和图10中识别的相对于乳酸甲酯的峰实际上源自专门工程化的细胞中积累的PDLA或备选地PLLA解聚，并且不源自细胞中的游离乳酸。

图12显示涉及经历酸性条件下甲醇分解的样品的GC-MS分析的数据，所述样品衍生自经工程化以产生PDLA的冻干细胞溶剂提取。例如但并非完全按照Yang等人(2010)所述，同时加以少许修改时，上述的酸性条件下甲醇分解程序之前，使用氯仿和Soxhlet装置(或提取器)实施提取。保留时间2.24分钟的峰对应于乳酸甲酯，这种分子的识别为95.4％。这个结果表明，甚至经Soxhlet装置提取后，可以将乳酸识别为细胞积累的生物聚合物的组分单体。

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