一种快速筛选抗癌靶点药物的方法

技术领域

本发明涉及靶点药物技术领域，具体为一种快速筛选抗癌靶点药物的方法。

背景技术

迄今已发现作为治疗药物靶点的总数约500个，其中受体尤其是G-蛋白偶联的受体(GPCR)靶点占绝大多数，另还有酶、抗菌、抗病毒、抗寄生虫药的作用靶点。合理化药物设计(rational drug design)可以依据生命科学研究中所揭示的包括酶、受体、离子通道、核酸等潜在的药物作用靶位，或其内源性配体以及天然底物的化学结构特征来设计药物分子，以发现选择性作用于靶点的新药；

为了实现抗癌靶点药物的快速筛选，我们提出一种快速筛选抗癌靶点药物的方法。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种快速筛选抗癌靶点药物的方法，解决了现有技术抗癌靶点药物筛选慢的问题。

一种快速筛选抗癌靶点药物的方法，该方法包括以下步骤：

步骤一、获得目标细菌、病毒、真菌以及一些小型的原生生物的全基因序列，并将目的菌株的基因组序列剪切成含重叠区的核酸小片段，并且将获得的非命中核酸序列与含重叠区的核酸小片段进行比对，获得非命中核酸序列；

步骤二、该非命中核酸列即为可能的目标细菌、病毒、真菌以及一些小型的原生生物的菌株特异性核酸片段，最后分别以目标细菌、病毒、真菌以及一些小型的原生生物菌株的基因组DNA和获得的核酸池为模板，设计的引物进行PCR扩增，扩增产物进行琼脂糖电泳检测；

步骤三、将步骤二中两种扩增产物分别稳定转染入适合高通量筛选的胚胎干细胞中，并且经过多次有限稀释，获取高纯度和高表达效率的FRT细胞模型；

步骤四、将含有蛋白和胶体金的缓冲液进行第一次反应，得到反应液1；在反应液1中添加巯基己醇己酸酯进行第二次反应，得到反应液2；将反应液2进行分离，得到蛋白酶筛选底物；

步骤五、进行目的片段的复制，构建含有目的片段的甘露聚糖酶基因，根据基因的序列进行启动子的生物信息学分析，找到该基因的转录起始位点，并预测其启动子区，加质量百分比为76％的乙醇2ml，用这些乙醇冲洗管壁直至混匀，去除上清液，利用细胞核提取物和回收纯化后浓缩的目的片段进行牛MYOD1基因启动子区的转录因子结合位点的筛选实验；

步骤六、实验结束后，对实验结果进行分析处理，即完成了基因启动子区转录因子结合位点的多通量筛选。

优选的，在转速为11000-13000rpm/min的条件下，离心4-6min的条件下进行上清液的去除。

优选的，琼脂糖电泳检测时采用聚丙烯酰胺凝胶为载体，该聚丙烯酰胺凝胶可以分离小片段5-500bpDNA，采用Tris·醋酸(TAE)、Tris·硼酸(TBE)和Tris·磷酸(TPE)3种缓冲体系，且电泳的最适离子强度一般在0.02-0.2之间。

优选的，所述蛋白酶选用丝氨酸蛋白酶、巯基蛋白酶、金属蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶中任意一种。

优选的，所述蛋白酶按胰蛋白酶液浓度为0.25％，用电子天平准确称取粉剂溶入小烧杯中的双蒸水(若用双蒸水需要调PH到7.2左右)或PBS(D-hanks)液中，搅拌混匀，置于4℃内过夜。

优选的，将蛋白酶中配好的胰酶溶液要在超净台内用注射滤器(0.22微米微孔滤膜)抽滤除菌，然后分装成小瓶于-20℃保存以备使用。

优选的，胶体金在弱碱环境下带负电荷，与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合，且此种结合为静电结合。

优选的，胶体金在制备时用容量瓶量取300ml超纯水加入到600ml锥形瓶中，将锥形瓶置于磁力加热搅拌器加热板上，放入磁力搅拌子，打开搅拌旋钮至适当速度。

与现有技术对比，本发明具备以下有益效果：该一种快速筛选抗癌靶点药物的方法，只需要双门同时动作，进料时间缩短5-10秒，产量提高了。原来如果采用双行程气缸的，现在只要单行程的，降低了成本和减少了故障点。小配比时配料精度也较高。当等车后继续生产，或换配方后通过大数据比对，实时调整提前量，也能达到较高的精度。

具体实施方式

下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

一种快速筛选抗癌靶点药物的方法，该方法包括以下步骤：

步骤一、获得目标细菌、病毒、真菌以及一些小型的原生生物的全基因序列，并将目的菌株的基因组序列剪切成含重叠区的核酸小片段，并且将获得的非命中核酸序列与含重叠区的核酸小片段进行比对，获得非命中核酸序列；

步骤二、该非命中核酸列即为可能的目标细菌、病毒、真菌以及一些小型的原生生物的菌株特异性核酸片段，最后分别以目标细菌、病毒、真菌以及一些小型的原生生物菌株的基因组DNA和获得的核酸池为模板，设计的引物进行PCR扩增，扩增产物进行琼脂糖电泳检测；

步骤三、将步骤二中两种扩增产物分别稳定转染入适合高通量筛选的胚胎干细胞中，并且经过多次有限稀释，获取高纯度和高表达效率的FRT细胞模型；

步骤四、将含有蛋白和胶体金的缓冲液进行第一次反应，得到反应液1；在反应液1中添加巯基己醇己酸酯进行第二次反应，得到反应液2；将反应液2进行分离，得到蛋白酶筛选底物；

步骤五、进行目的片段的复制，构建含有目的片段的甘露聚糖酶基因，根据基因的序列进行启动子的生物信息学分析，找到该基因的转录起始位点，并预测其启动子区，加质量百分比为76％的乙醇2ml，用这些乙醇冲洗管壁直至混匀，去除上清液，利用细胞核提取物和回收纯化后浓缩的目的片段进行牛MYOD1基因启动子区的转录因子结合位点的筛选实验；

步骤六、实验结束后，对实验结果进行分析处理，即完成了基因启动子区转录因子结合位点的多通量筛选。

在转速为11000-13000rpm/min的条件下，离心4-6min的条件下进行上清液的去除。

琼脂糖电泳检测时采用聚丙烯酰胺凝胶为载体，该聚丙烯酰胺凝胶可以分离小片段5-500bpDNA，采用Tris·醋酸(TAE)、Tris·硼酸(TBE)和Tris·磷酸(TPE)3种缓冲体系，且电泳的最适离子强度一般在0.02-0.2之间。

蛋白酶选用丝氨酸蛋白酶、巯基蛋白酶、金属蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶中任意一种。

蛋白酶按胰蛋白酶液浓度为0.25％，用电子天平准确称取粉剂溶入小烧杯中的双蒸水(若用双蒸水需要调PH到7.2左右)或PBS(D-hanks)液中，搅拌混匀，置于4℃内过夜。

将蛋白酶中配好的胰酶溶液要在超净台内用注射滤器(0.22微米微孔滤膜)抽滤除菌，然后分装成小瓶于-20℃保存以备使用。

胶体金在弱碱环境下带负电荷，与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合，且此种结合为静电结合。

胶体金在制备时用容量瓶量取300ml超纯水加入到600ml锥形瓶中，将锥形瓶置于磁力加热搅拌器加热板上，放入磁力搅拌子，打开搅拌旋钮至适当速度。

实施例1

筛选抗癌靶点药物时，首先获得目标细菌、病毒、真菌以及一些小型的原生生物的全基因序列，并将目的菌株的基因组序列剪切成含重叠区的核酸小片段，并且将获得的非命中核酸序列与含重叠区的核酸小片段进行比对，获得非命中核酸序列；该非命中核酸列即为可能的目标细菌、病毒、真菌以及一些小型的原生生物的菌株特异性核酸片段，最后分别以目标细菌、病毒、真菌以及一些小型的原生生物菌株的基因组DNA和获得的核酸池为模板，设计的引物进行PCR扩增，扩增产物进行琼脂糖电泳检测；将两种扩增产物分别稳定转染入适合高通量筛选的胚胎干细胞中，并且经过多次有限稀释，获取高纯度和高表达效率的FRT细胞模型；将含有蛋白和胶体金的缓冲液进行第一次反应，得到反应液1；在反应液1中添加巯基己醇己酸酯进行第二次反应，得到反应液2；将反应液2进行分离，得到蛋白酶筛选底物；进行目的片段的复制，构建含有目的片段的甘露聚糖酶基因，根据基因的序列进行启动子的生物信息学分析，找到该基因的转录起始位点，并预测其启动子区，加质量百分比为76％的乙醇2ml，用这些乙醇冲洗管壁直至混匀，去除上清液，利用细胞核提取物和回收纯化后浓缩的目的片段进行牛MYOD1基因启动子区的转录因子结合位点的筛选实验；

实验结束后，对实验结果进行分析处理，即完成了基因启动子区转录因子结合位点的多通量筛选。

在转速为11000rpm/min的条件下，离心4min的条件下进行上清液的去除。

琼脂糖电泳检测时采用聚丙烯酰胺凝胶为载体，该聚丙烯酰胺凝胶可以分离小片段50bpDNA，采用Tris·醋酸(TAE)缓冲体系，且电泳的最适离子强度在0.08。

蛋白酶选用丝氨酸蛋白酶。

蛋白酶按胰蛋白酶液浓度为0.25％，用电子天平准确称取粉剂溶入小烧杯中的双蒸水(若用双蒸水需要调PH到7.2左右)或PBS(D-hanks)液中，搅拌混匀，置于4℃内过夜。

将蛋白酶中配好的胰酶溶液要在超净台内用注射滤器(0.22微米微孔滤膜)抽滤除菌，然后分装成小瓶于-20℃保存以备使用。

胶体金在弱碱环境下带负电荷，与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合，且此种结合为静电结合。

胶体金在制备时用容量瓶量取300ml超纯水加入到600ml锥形瓶中，将锥形瓶置于磁力加热搅拌器加热板上，放入磁力搅拌子，打开搅拌旋钮至适当速度。

经检测，筛选抗癌靶点药物研制周期为14d，同比传统筛选时长缩短6d。

实施例2

筛选抗癌靶点药物时，首先获得目标细菌、病毒、真菌以及一些小型的原生生物的全基因序列，并将目的菌株的基因组序列剪切成含重叠区的核酸小片段，并且将获得的非命中核酸序列与含重叠区的核酸小片段进行比对，获得非命中核酸序列；

该非命中核酸列即为可能的目标细菌、病毒、真菌以及一些小型的原生生物的菌株特异性核酸片段，最后分别以目标细菌、病毒、真菌以及一些小型的原生生物菌株的基因组DNA和获得的核酸池为模板，设计的引物进行PCR扩增，扩增产物进行琼脂糖电泳检测；

将两种扩增产物分别稳定转染入适合高通量筛选的胚胎干细胞中，并且经过多次有限稀释，获取高纯度和高表达效率的FRT细胞模型；

将含有蛋白和胶体金的缓冲液进行第一次反应，得到反应液1；在反应液1中添加巯基己醇己酸酯进行第二次反应，得到反应液2；将反应液2进行分离，得到蛋白酶筛选底物；

进行目的片段的复制，构建含有目的片段的甘露聚糖酶基因，根据基因的序列进行启动子的生物信息学分析，找到该基因的转录起始位点，并预测其启动子区，加质量百分比为76％的乙醇2ml，用这些乙醇冲洗管壁直至混匀，去除上清液，利用细胞核提取物和回收纯化后浓缩的目的片段进行牛MYOD1基因启动子区的转录因子结合位点的筛选实验；

实验结束后，对实验结果进行分析处理，即完成了基因启动子区转录因子结合位点的多通量筛选。

在转速为13000rpm/min的条件下，离心6min的条件下进行上清液的去除。

琼脂糖电泳检测时采用聚丙烯酰胺凝胶为载体，该聚丙烯酰胺凝胶可以分离小片段60bpDNA，采用Tris·磷酸(TPE)缓冲体系，且电泳的最适离子强度一般在0.1之间。

蛋白酶选用丝氨酸蛋白酶、巯基蛋白酶、金属蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶中任意一种。

蛋白酶按胰蛋白酶液浓度为0.25％，用电子天平准确称取粉剂溶入小烧杯中的双蒸水(若用双蒸水需要调PH到7.2左右)或PBS(D-hanks)液中，搅拌混匀，置于4℃内过夜。

将蛋白酶中配好的胰酶溶液要在超净台内用注射滤器(0.22微米微孔滤膜)抽滤除菌，然后分装成小瓶于-20℃保存以备使用。

胶体金在弱碱环境下带负电荷，与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合，且此种结合为静电结合。

胶体金在制备时用容量瓶量取300ml超纯水加入到600ml锥形瓶中，将锥形瓶置于磁力加热搅拌器加热板上，放入磁力搅拌子，打开搅拌旋钮至适当速度。

经检测，筛选抗癌靶点药物研制周期为14d，同比传统筛选时长缩短5.5d。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。