一种基于靶向扩增子富集策略的高通量病原菌检测试剂盒

技术领域

本申请涉及医学检验技术领域，尤其涉及一种基于靶向扩增子富集策略的高通量病原菌检测试剂盒。

背景技术

病原菌是一种引起疾病的微生物，也可称其为病原微生物。病原菌是指能入侵宿主引起感染的微生物，有细菌、真菌、病毒等。它们能产生致病物质，造成宿主感染。目前，我国仍缺乏病原菌快速敏感的检测和鉴定技术，常规的微生物学检测和鉴定方法费时、费力，病原菌检出率低且难以快速、准确的进行检测。

发明内容

本申请提供了一种基于靶向扩增子富集策略的高通量病原菌检测试剂盒，以解决病原菌检出率低以及鉴定费时费力的问题。

本申请一种基于靶向扩增子富集策略的高通量病原菌检测试剂盒，包括DNA提取溶液、文库构建溶液、引物池、MINI柱和96孔板封膜；

所述DNA提取溶液包括6ml BufferA、1.25ml蛋白酶K、12ml Buffer B、19mlBuffer C、17ml Buffer D和20ml Buffer E；

所述文库构建溶液包括5ml 5X HiFi Mix、3ml AgencournaAMPure、68pm E.coliDH10B标准文库、2ml Switch溶液、2ml 2X TaqManMasterMix和2ml 20X TaqManAssay。

可选的，所述MINI柱的数量为50，所述96孔板封膜的数量为5。

可选的，所述试剂盒操作步骤如下：

使用DNA提取溶液对多个样本DNA进行提取；

使用5X HiFi Mix配制多个样本的DNA及引物池混合反应物；

使用文库构建溶液对多个样本的DNA及引物池混合反应物进行处理，即得到多个样本文库；

在E.coli DH10B标准文库、所述多个样本文库和对照样本中分别加入2XTaqManMasterMix和20X TaqMan Assay混合后，进行PCR扩增以及测序检测。

可选的，使用5X HiFi Mix配制多个样本的DNA及引物池混合反应物，还包括添加2Xprimer pool、gDNA、和Nuclease-free Water；所述5X HiFi Mix、2Xprimer pool、gDNA、和Nuclease-free Water总体积为20μL。

可选的，所述使用文库构建溶液对多个样本的DNA及引物池混合反应物进行处理包括对引物序列进行部分消化以及对未扩增的文库进行纯化。

由以上技术方案可知，本申请提供了一种基于靶向扩增子富集策略的高通量病原菌检测试剂盒，包括DNA提取溶液、文库构建溶液、引物、MINI柱和96孔板封膜。所述DNA提取溶液包括6ml BufferA、1.25ml蛋白酶K、12ml Buffer B、19ml Buffer C、17ml Buffer D和20ml Buffer E；所述文库构建溶液包括5ml 5X HiFi Mix、3mlAgencournaAMPure、68pmE.coli DH10B标准文库、2ml Switch溶液、2ml 2X TaqManMasterMix和2ml 20X TaqManAssay。本申请通过结合环状扩增和二代测序技术，可将病原菌检出率从传统方法15-20％的提高到30-35％。提高病原菌检测的准确度以及缩短鉴定所需时间。

附图说明

为了更清楚地说明本申请的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本申请试剂盒操作步骤流程示意图。

具体实施方式

下面将详细地对实施例进行说明，其示例表示在附图中。下面的描述涉及附图时，除非另有表示，不同附图中的相同数字表示相同或相似的要素。以下实施例中描述的实施方式并不代表与本申请相一致的所有实施方式。仅是与权利要求书中所详述的、本申请的一些方面相一致的系统和方法的示例。

本申请一种基于靶向扩增子富集策略的高通量病原菌检测试剂盒，包括DNA提取溶液、文库构建溶液、引物池、MINI柱和96孔板封膜；其中，所述DNA提取溶液包括6mlBuffer A、1.25ml蛋白酶K、12ml Buffer B、19ml Buffer C、17ml Buffer D和20ml BufferE；所述文库构建溶液包括5ml 5X HiFi Mix、3ml AgencournaAMPure、68pm E.coli DH10B标准文库、2ml Switch溶液、2ml 2X TaqManMasterMix和2ml 20X TaqMan Assay。所述MINI柱的数量为50，所述96孔板封膜的数量为5。

进一步地，所述试剂盒操作步骤如下：

使用DNA提取溶液对多个样本DNA进行提取；

使用5X HiFi Mix配制多个样本的DNA及引物池混合反应物；

使用文库构建溶液对多个样本的DNA及引物池混合反应物进行处理，即得到多个样本文库；

在E.coli DH10B标准文库、所述多个样本文库和对照样本中分别加入2XTaqManMasterMix和20X TaqMan Assay混合后，进行PCR扩增以及测序检测。

进一步地，使用5X HiFi Mix配制多个样本的DNA及引物池混合反应物，还包括添加2X primer pool、gDNA(10ng)和Nuclease-free Water；所述5X HiFi Mix、2X primerpool、gDNA(10ng)和Nuclease-free Water总体积为20μL。

进一步地，所述使用文库构建溶液对多个样本的DNA及引物池混合反应物进行处理包括对引物序列进行部分消化以及对未扩增的文库进行纯化。

具体地，参见图1，为一种基于靶向扩增子富集策略的高通量病原菌检测试剂盒的操作步骤流程示意图。首先进行多个样本的DNA提取；在2ml微量离心管中加入20μL蛋白酶K；将200μL液体样本加入蛋白酶K中；其中液体样本为微生物样本；对于量少的液体样本需用PBS或0.9％NaCl补至200μL；接着，加入100μLBuffer A后关上盖子并用脉冲涡流混匀。需要注意的是，对于无细胞的样品，每100μLBuffer A需加入1μg RNA载体，反应条件为20-25℃孵育15min。在轻微离心以从盖子内部除去液滴后，样本中加入350μL Buffer B，并用脉冲漩涡充分混匀。确保在使用前将异丙醇添加到Buffer B中。再次轻微离心以从盖子内部除去液滴，得到裂解液。

取用2ml收集管，将裂解液转移到Mini柱中。关闭盖子，8000rpm离心1min。将Mini柱转移到干净的2ml收集管中，丢弃含有滤液的收集管。如果裂解液在离心后还没有完全通过，再以更高的速度离心，离心条件为20000×g，14000转/分，直到Mini柱没有裂解液为止。

接着加入600μL BufferC，8000rpm离心1min。将Mini柱转移到干净的2ml收集管中，丢弃含有滤液的收集管。加入600μL BufferD，8000rpm离心1min。将Mini柱转移到干净的2ml收集管中，丢弃含有滤液的收集管。接着将Mini柱14000rmp离心2min。将Mini柱置于干净的1.5ml微量离心管中，丢弃含有滤液的收集管。将50-150μL BufferE加入膜的中心，关闭盖子并在室温下孵育1分钟后，14000rmp离心1min。即可完成DNA提取。

进一步地，需要注意的是，确保洗脱缓冲液平衡至室温。如果以小体积(<75μl)进行洗脱，则必须将洗脱缓冲液分配到膜的中心，以完全洗脱结合的RNA和DNA。洗脱体积灵活，可根据下游应用的要求进行调整。为了降低噪音，洗脱的离心速度可以设定为6000×g。如果这样做，则回收的洗脱液体积将比施加到柱上的洗脱缓冲液体积小约5μL。

进一步地，对基因组DNA区域进行PCR扩增，按照表1将各组成分加至96孔反应板内，配制DNA及引物池混合反应物；

表1

接着，利用膜密封96孔PCR反应板，充分震荡简单离心，尽可能回收上述配制DNA及引物池混合反应物样本到管底部；并放置PCR反应板于PCR仪内，运行程序进行靶基因扩增；扩增程序如表2所示：

表2

其中，PCR产物可储与10℃过夜，需要更长时间储存可放于-20℃。

进一步地，对引物序列进行部分消化，具体步骤如下：轻度离心PCR板将反应后溶液收集到管底并慢慢揭掉96孔板的封膜。分别在每个混合反应液中加入2μL FuPaReagent，总体系达到22μL；接着将96孔板用膜封紧，充介振荡混匀，轻度离心将液体收集到管底。也可以选择用移液器吸取一半以上的液体上下吹打至少5次来混匀；接着再次将96孔板放入PCR仪运行程序，程序如表3所示：

表3

进一步地，将接头连接至扩增产物并纯化配置并运行连接反应；如果有可见的沉淀物在Switch溶液中，通过室温下震荡或上下吹吸来溶解并重悬。小心去除PCR板上的封膜并加入表4中成分到每个反应孔内消化样本。在加入之前可先混合Switch溶液和接头。

表4

接着，在每个反应孔内加入2μL DNA连接酶。使用膜将96孔板封紧，充分振荡混匀，轻度离心将液体收集到管底。也可以选择用移液器吸取一半以上的液体上下吹打至少5次来混匀；继续将96孔板放入PCR仪，运行程序，程序如表5所示；

表5

进一步地，对未扩增的文库进行纯化，小心地揭去封板膜并向每个文库中加入45μL(1.5x样本体积)的AgencournaAMPure试剂。其中，每个样本建库后称之为每个文库。用移液器吹打5次使DNA与磁珠悬浮液充分混匀，将混合液置于室温5分钟。接着将96孔板置于磁力架上，静置2分钟或者等溶液变清澈。小心地吸走并弃掉上清液，不要扰动磁珠。向孔中加入150μL新鲜配制的70％乙醇，在磁力上来回移动96孔板来洗涤磁珠，然后小心地弃去上清液，不要扰动磁珠。重复步骤再一次向孔中加入150μL新鲜配制的70％乙醇，在磁力上来回移动96孔板来洗涤磁珠，然后小心地弃去上清液，不要扰动磁珠，进行第二次洗涤。确保乙醇液滴已全部从孔中吸走。将96孔板放置于磁力架上，室温空气干燥5分钟，注意不要过度干燥。

进一步，将96孔板从磁力架上拿开，在每孔中加入50μL LowTE充分浸润磁珠。使用膜将96孔板封紧，充分振荡混匀，轻度离心将液体收集到管底。也可以选择用移液器吸取一半以上的液体上下吹打至少5次来混匀；将96孔板置于磁力架上2分钟。由于上清液中含有文库，取出5μL上清液，结合495μL无核酸水，用于文库定量。

进一步地，进行文库定量和稀释，通过QPCR来确定文库的浓度。每个样本，标准文库和阴性对照必须在20μL反应体系内做两次技术重复。其中，阴性对照为无菌生物样本。外显子文库通常产量在100-500pM。准备3个连续10倍稀释的E.coli DH10B标准文库分别浓度为6.8pM，0.68pM，0.068pM。E.coli DH10B标准文库的原始浓度为68pM，标记上述作为标准文库以及在定量PCR仪器软件内记录上述标准文库浓度。接着准备反应混合溶液；

在每一个样本、阴性对照和标准文库中分别加入20μL 2X TaqManMasterMix和2μL20X TaqMan Assay并混合均匀得到反应混合溶液。分装11μL的所述反应混合溶液到每个PCR反应孔内，接着依次加入9μL已稀释好的标准文库到每个PCR反应孔内(每个样本两个PCR孔做重复)。总反应体系20μL。接着进行PCR仪的程序运行，定量PCR仪的反应程序如表6所示：

表6

最后，PCR仪的反应程序完成后，计算每一个样本、阴性对照和标准文库的浓度并上机进行模板建库和测序检测。

本申请提供了一种基于靶向扩增子富集策略的高通量病原菌检测试剂盒，包括DNA提取溶液、文库构建溶液、引物、MINI柱和96孔板封膜。所述DNA提取溶液包括6mlBufferA、1.25ml蛋白酶K、12ml Buffer B、19ml Buffer C、17ml Buffer D和20ml BufferE；所述文库构建溶液包括5ml 5X HiFi Mix、3mlAgencournaAMPure、68pm E.coli DH10B标准文库、2ml Switch溶液、2ml 2X TaqManMasterMix和2ml 20X TaqManAssay。本申请通过结合环状扩增和二代测序技术，可将病原菌检出率从传统方法的15-20％提高到30-35％。提高病原菌检测的准确度以及缩短鉴定所需时间。

本申请提供的实施例之间的相似部分相互参见即可，以上提供的具体实施方式只是本申请总的构思下的几个示例，并不构成本申请保护范围的限定。对于本领域的技术人员而言，在不付出创造性劳动的前提下依据本申请方案所扩展出的任何其他实施方式都属于本申请的保护范围。