环孢素衍生物的合成方法

技术领域

本发明涉及化学合成技术领域，特别是涉及环孢素衍生物的合成方法。

背景技术

环孢素A(cyclosporine，CsA)是含有7个N-甲基的十一环肽天然产物，分离于土壤真菌的代谢物，并具有免疫抑制活性。在1983年，CsA首次作为免疫抑制药物被用于肾脏移植后的免疫排斥治疗，显著提高了器官移植后的病人生存率。CsA的出现是器官移植领域的一次革命。由于其免疫抑制及抗炎活性，CsA还被用于治疗免疫相关疾病、炎症或代谢类疾病等疾病。然而CsA的免疫抑制活性在其治疗炎症、感染及代谢类疾病时，会产生毒副作用。因此，改造CsA的结构，去除其免疫抑制活性的同时，保留或提高其抗炎及抗感染等活性，是目前CsA的研究热点。

在CsA的结构修饰中，[methylene-sar]

[methylene-sar]

将1(CsA)溶于干燥的THF溶剂中，在-78℃条件下，逐滴加入二异丙基氨基锂(Lithium diisopropylamide，LDA)(10equiv.)，防止水气，反应2h。随后温度降至-50℃，向反应液中缓慢通入干燥的CO

该合成路线可以一步完成，产率基本在40％左右。然而在实际应用时，该方法操作复杂、危险性高、重现性不好，限制了[methylene-sar]

发明内容

基于此，本发明提供一种环孢素衍生物的合成方法。该合成方法产率高，且工业安全性高、重现性好、操作简单，易于规模制备。

具体技术方案如下：

本发明的一方面，提供一种环孢素衍生物的合成方法，所述环孢素衍生物具有如下式(I)所示结构通式：

其中，A选自：-CH＝CHR、-CH＝CH-CH＝CHR和-CH

B选自：-CH

C’选自：-H、-CH

D选自：-CH

所述合成方法包括如下步骤：

提供前体流体、碱性流体和ClCH

将所述前体流体、所述碱性流体进行预混合，得到预混液；

将所述预混液输入第一反应室进行反应，制备第一反应液；

将所述第一反应液输入第二反应室，与CO

收集所述第二反应液；

将所述第二反应液与所述ClCH

在其中一个实施例中，输入所述前体流体的流速为0.03mM/min～0.06mM/min；输入所述碱性流体的流速为0.1mM/min～0.5mM/min,CsA与碱液的摩尔流速比例为8～20。

在其中一个实施例中，将所述前体流体、所述碱性流体输入第一反应室进行反应的温度为-5℃～30℃，时间为50s～90s。

在其中一个实施例中，所述CO

在其中一个实施例中，将所述第一反应液输入第二反应室与CO

在其中一个实施例中，所述ClCH

在其中一个实施例中，将所述第二反应液与所述ClCH

在其中一个实施例中，所述前体流体、所述碱性流体和所述ClCH

在其中一个实施例中，将所述第二反应液与所述ClCH

在其中一个实施例中，所述柱层析采用的流动相为体积比为(15～25):1的二氯甲烷和甲醇。

在其中一个实施例中，所述前体为环孢素A；A选自：-CH＝CH-CH

在其中一个实施例中，所述碱性流体中的碱选自二异丙基氨基锂(LDA)、双三甲基硅基胺基锂(LiHMDS)和二(三甲基硅基)氨基钠(NaHMDS)中的至少一种。

本发明的又一方面，提供一种环孢菌素1，3位衍生物的合成方法，包括如下步骤：

按照如上所述的合成方法合成环孢素衍生物H；

所述环孢素衍生物H与化合物CH

所述中间体H-1经不对称氢化反应制备中间体H-2；

所述中间体H-2经氢化反应制备所述环孢菌素1，3位衍生物；

所述环孢素衍生物H具有如下式(III)所示结构通式：

所述中间体H-1具有如下式(III-1)所示结构通式：

所述中间体H-2具有如下式(III-2)所示结构通式：

所述环孢菌素1，3位衍生物具有如下式(IV)所示结构通式：

其中，B选自：-CH

C’选自：-H、-CH

D选自：-CH

R选自：-CH

与传统技术相比较，本发明提供的技术方案具有如下有益效果：

本发明的环孢素衍生物的合成方法首次将流动化学技术应用于环孢素衍生物的合成，首次构建了环孢素衍生物的连续合成方法，相比于传统合成工艺，极大地优化了环孢素衍生物的合成工艺，建立的合成工艺简洁、高效，易于后处理，且合成产率由传统的40％提高至65％，大大缩短了反应时间，提高了安全性，操作简单，易规模制备，重现性好。

进一步地，本发明通过采用合适的反应参数设置，还可以实现如下优点：

(1)更加绿色及原子经济，合成安全及产率均有明显提高。

(2)避免了大量LDA的操作，尽在低容量的微反应器中进行，提高了工艺操作的安全性；

(3)在仅需一次较低温度(-如50℃)调节的情况下即可避免副反应的发生，并提高合成产率，同时在第一反应液与CO

附图说明

图1为实施例1的环孢素衍生物[methylene-sar]3CsA 3的连续合成方法的流程示意图；

图2为实施例2的环孢素衍生物[methylene-sar]

图3为实施例4制备的化合物4的HPLC谱图；

图4为实施例4制备的产物5的HPLC谱图；

图5为实施例4制备的产物6的HPLC谱图。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明的环孢素衍生物的合成方法作进一步详细的说明。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式。相反地，提供这些实施方式的目的是使对本发明公开内容理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。

术语“烷基”是指包含伯(正)碳原子、或仲碳原子、或叔碳原子、或季碳原子、或其组合的饱和烃基。包含该术语的短语，例如，“C1～C6烷基”是指包含1～6个碳原子的烷基，每次出现时，可以互相独立地为C1烷基、C2烷基、C3烷基、C4烷基、C5烷基、C6烷基。合适的实例包括但不限于：甲基(Me、-CH

术语“烷氧基”是指具有-O-烷基的基团，即如上所定义的烷基经由氧原子连接至母核结构。包含该术语的短语，例如，“C1～C6烷氧基”是指烷基部分包含1～6个碳原子，每次出现时，可以互相独立地为C1烷氧基、C2烷氧基、C3烷氧基、C4烷氧基、C5烷氧基、C6烷氧基。

本发明提供一种环孢素衍生物的合成方法，所述环孢素衍生物具有如下式(I)所示结构通式：

其中，A选自：-CH＝CHR、-CH＝CH-CH＝CHR和-CH

B选自：-CH

C’选自：-H、-CH

D选自：-CH

合成方法包括如下步骤：

提供前体流体、碱性流体和ClCH

将所述前体流体、所述碱性流体进行预混合，得到预混液；

将所述预混液输入第一反应室进行反应，制备第一反应液；

将所述第一反应液输入第二反应室，与CO

收集所述第二反应液；

将所述第二反应液与所述ClCH

我们首次将流动化学技术与传统反应方法(即指在反应瓶或反应釜中进行反应)进行结合，用于制备环孢素衍生物，工艺简单、合成周期短、操作安全，有利于提高合成产率，有利于实现规模化生产。

在其中一个具体的示例中，前体为环孢素A(CsA)，A选自：-CH＝CH-CH

在其中一个具体的示例中，碱性流体中的碱选自二异丙基氨基锂(LDA)、双三甲基硅基胺基锂(LiHMDS)和二(三甲基硅基)氨基钠(NaHMDS)中的至少一种。

其中，步骤S1为反应预备步骤，将前体、碱和ClCH

在其中一个具体的示例中，前体流体中前体的摩尔浓度为0.01M～0.055M。

在其中一个具体的示例中，碱性流体中碱的摩尔浓度为0.1M～0.3M。

在其中一个具体的示例中，ClCH

在其中一个具体的示例中，前体流体、碱性流体和ClCH

步骤S2为前体与碱的反应过程，为流动化学反应过程。通过合理调整前体流体和碱性流体的流速，可以使原料反应充分，副产物少、产率高，且反应时间短。

在其中一个具体的示例中，输入前体流体的流速为0.03mM/min～0.06mM/min；输入碱性流体的流速为0.1mM/min～0.5mM/min。本发明的一合成方法中，采用流动化学技术，可降低碱，如二异丙基氨基锂的用量，大大提高了操作安全性，比如一些实施例中，二异丙基氨基锂用量仅为0.5mM/min。

在其中一个具体的示例中，输入前体流体的流速为1mL/min～1.5mL/min；输入碱性流体的流速为1mL/min～3mL/min。进一步地，前体流体中前体的摩尔浓度为0.01M～0.055M，碱性流体中碱的摩尔浓度为0.1M～0.3M。

进一步地，输入前体流体的流速为1mL/min～1.5mL/min；输入碱性流体的流速为1.5mL/min～2mL/min。

在其中一个具体的示例中，前体与碱的摩尔比例为1:8～20。

在其中一个具体的示例中，将前体流体、碱性流体输入第一反应室进行反应的温度为-5℃～30℃，时间为50s～90s。进一步地，将前体流体、碱性流体输入第一反应室进行反应的温度为-5℃～0℃，时间为50s～60s。本发明的一合成方法中，前体和碱的反应过程在一般低温如-5℃条件下就可以实现，避免了传统技术中极低温条件如-78℃的操作，操作简单易行，无需耐极低温设备。

步骤S3为前体与碱反应制备的化合物2与CO

在其中一个具体的示例中，输入CO

在其中一个具体的示例中，前体与CO

在其中一个具体的示例中，将第一反应液输入第二反应室并通入CO

步骤S4为化合物2(第二反应液)与ClCH

在其中一个具体的示例中，将第二反应液与ClCH

在其中一个具体的示例中，整个反应过程中，前体、碱和CO

进一步地，环孢素衍生物的合成方法还包括后处理步骤：

在其中一个具体的示例中，将第二反应液收集至ClCH

在其中一个具体的示例中，柱层析采用的流动相为体积比为(15～25):1的二氯甲烷和甲醇。

在其中一个具体的示例中，于反应物中加入水之前，先将反应物降温至-5℃～5℃。

在其中一个具体的示例中，调节所述反应物的pH为7～8采用盐酸水溶液进行。

在其中一个具体的示例中，减压浓缩是指减压浓缩除去溶剂。

另外，CRV431是由Hepion公司开发的一种用于治疗非酒精性脂肪肝炎(NASH)和病毒性肝炎的环孢霉素A免疫抑制活性抑制剂，目前处于临床II期(NCT04480710)。CRV431可以有效抑制多种亲环素蛋白(CyP)，包括亲环素A蛋白、亲环素B蛋白、亲环素D蛋白和亲环素G蛋白，其抑制常数或IC

其传统的合成方法需要7步或者8步，总产率～1％。基于CRV431重要的生物学活性，以及化学合成手段的落后，迫切需要开发出更简洁有效的CRV431及其衍生物的制备方法。

因此，在进一步的研究过程中，本发明还提供一种环孢菌素1，3位衍生物的合成方法，包括如下步骤：

按照如上所述的合成方法合成环孢素衍生物H；

所述环孢素衍生物H与化合物CH

所述中间体H-1经不对称氢化反应制备中间体H-2；

所述中间体H-2经氢化反应制备所述环孢菌素1，3位衍生物；

所述环孢素衍生物H具有如下式(III)所示结构通式：

所述中间体H-1具有如下式(III-1)所示结构通式：

所述中间体H-2具有如下式(III-2)所示结构通式：

所述环孢菌素1，3位衍生物具有如下式(IV)所示结构通式：

其中，B选自：-CH

C’选自：-H、-CH

D选自：-CH

R选自：-CH

上述合成方法，结合流动化学的亚甲基化、分子间的烯烃复分解反应以及非对映选择性氢化，完成了CRV431的非对映选择性合成，反应过程仅需4步，产率可以高达34％，产物易于纯化，实现了环孢菌素1，3位衍生物的规模制备，且能够快速构建CRV431衍生物分子库，推动以环孢霉素A为骨架的药物发展。

在其中一个具体的示例中，B选自：-CH

在其中一个具体的示例中，烯烃复分解反应在催化剂Hoveyda-Grubbs的催化下进行。

在其中一个具体的示例中，烯烃复分解反应是指以二氯甲烷为溶剂进行回流反应。在另外一个具体的示例中，烯烃复分解反应是指在温度为55℃～65℃条件下微波反应1h～2h。

以下为具体的实施例。

以下具体实施例中未写明的实验参数，优先参考本申请文件中给出的指引，还可以参考本领域的实验手册或本领域已知的其它实验方法，或者参考厂商推荐的实验条件。

以下具体实施例中涉及的原料和试剂，本领域技术人员能够容易获得，或者可以直接通过市售得到。

实施例中涉及的试剂简写与对应的中文名称：

CsA：环孢素A；

LDA：二异丙基氨基锂；

THF：四氢呋喃；

Hex：正己烷；

DCM：二氯甲烷；

MeOH：甲醇。

实施例1(对应enrty 9)

本实施例为环孢素衍生物[methylene-sar]

1、准备阶段：底物CsA(0.055M in THF)和LDA(0.25M in THF/Hex)，泵(HNP mzr-7208-hs-f S+SW)，内联过滤器(Swagelok filter 40μm)，泄压阀(Swagelok proportionalrelief valves)。

2、开启程序：

2.1用干燥的四氢呋喃溶液润洗合成所需的泵，包括泵A(Pump A)、泵B(Pump B)、泵C(Pump C)；

2.2打开二氧化碳气体管线，将气体出口压力设置为2Mpa～5Mpa；

2.3打开温度设置通道，使其达到-5℃；

2.4打开泵A(Pump A)、泵B(Pump B)、泵C(Pump C)；

2.5一旦所有温度达到平衡，即-5℃，就按以下顺序切换溶液输入阀：泵A(Pump A)的输入阀切换到CsA溶液中，泵B(Pump B)的输入阀切换到LDA溶液中；然后，设置泵A的流速为1.0mL/min，泵B的流速为2.0mL/min，泵C(CO

3、开始反应阶段，首先，在-5℃下，CsA与LDA分别通过泵A和泵B进行吸入，于微通道反应器1中混合，并在该反应器中进行反应54s，随后进入微通道反应器2中，与CO

4、关闭程序：

4.1将出口管切换到废液瓶；

4.2用干燥的四氢呋喃润洗泵A和泵B，直至不再有产物生成，大约需要冲洗3-5个反应容积；

4.3将泵A和泵B分别切换到乙醇和水；

4.4关闭恒温器；

4.5关闭泵；

4.6关闭二氧化碳气体管路。

整个反应过程中，CsA、LDA和CO

5、后处理：在0℃下，加入水，并用1M稀盐酸调节反应体系的pH值为中性，经减压浓缩除去四氢呋喃，再加入乙酸乙酯(200mL)，水相和有机相进行分离，水相用乙酸乙酯萃取(3×200mL)，合并的有机相用饱和食盐水(2×200mL)洗涤之后，再用无水硫酸钠干燥。经过滤后，减压浓缩除去有机溶剂，剩余的粗产物经过硅胶柱层析色谱分离纯化(DCM/MeOH：20:1)，以65％的产率得到2.14g的淡黄色固体[methylene-sar]

反应监测是通过0.25mm薄层色谱硅胶板(60F-254)。核磁表征由Brüker Advance500(

化合物3：

R

HRMS(ESI)m/z calcd for C

实施例2

本实施例对环孢素衍生物[methylene-sar]3CsA 3的连续合成方法进行反应条件考察，其条件筛选流程图如图2所示。

反应条件：底物CsA(0.025M in THF for entry 1-8，0.055M in THF for entry9)；LDA溶液浓度(2.0M in THF/Hex)。二氧化碳气体的流速为常压条件下的值，除了改变的参数外，其余反应步骤同实施例1。底物CsA与产物2的比例由LCMS分析结果确定。结果如下表1所示。

表1连续流反应中碱及二氧化碳流速优化

其中，entry 9对应实施例1的制备方法。

实施例3

本实施例考察不同的碱和溶剂对环孢素衍生物[methylene-sar]

表2连续流反应中碱及溶剂的筛选

实施例4

本实施例为环孢菌素1，3位衍生物(CRV431)的合成方法，以实施例1制备得到的环孢素衍生物[methylene-sar]

将化合物4-烯基戊胺(608mg,5mmol,1equiv.)加入到干燥的反应瓶(50mL)中，在0℃条件下，加入乙酸酐(5mL)和吡啶(10mL)。在室温下搅拌反应5小时，待TLC监测底物消耗完毕后，在0℃条件下，向反应体系中加入水(10mL)淬灭反应，然后再加入乙酸乙酯(15mL)，水相和有机相分离，水相用乙酸乙酯进行萃取(3×15)，合并的有机相用饱和食盐水(2×20mL)洗涤之后，再用无水硫酸钠干燥。经过滤后，减压浓缩除去有机溶剂，剩余的粗产物经过硅胶柱层析色谱分离纯化(正己烷:乙酸乙酯＝10:1至2:1)，以90％的收率得到570mg无色油状液体N-乙酰基-4-烯基戊胺。

HRMS(ESI)m/z calcd for C

将化合物3(834.9mg,0.68mmol,1.0equiv.)和N-乙酰基-4-烯基戊胺(87.4mg,0.68mmol,1.0equiv.)溶解在干燥的二氯甲烷(5mL)中，加入Hoveyda-Grubbs catalyst 2

化合物4以HPLC进行分析，谱图见图3：流动相(A:0.1％solution of CF

在充满氩气的手套箱里，将化合物4(104mg,0.08mmol,1equiv)溶解在干燥的DCM(5mL)中，加入[Rh(cod)

反应中会产生化合物5的三位L构型的异构体5a。反应完毕后分析产物粗产物可确定产物5与副产物反应物5a的比例约为97：3，谱图见图4。

向上述含有产物5的MeOH溶液中，加入10％Pd/C(10mg)，用氢气球将反应体系置换气3次，于室温下搅拌过夜。用LCMS检测反应，待反应完毕后，真空减压浓缩反应体系，粗产物用硅藻土过滤，以90％的产率得到94mg淡黄色固体CRV431(6)。

反应完毕三位L构型的副产物6a与CRV431(6)以HPLC进行分析，比例约为3：97，谱图见图5：流动相(A:0.1％solution of CF

HRMS(ESI)m/z calcd for C

实施例5

本实施例为CRV431衍生物的合成方法，以实施例1制备得到的环孢素衍生物[methylene-sar]

将化合物3(40mg,0.033mmol,1equiv.)加入到

化合物7：R

在充满氩气的手套箱里，以1:1.1的摩尔比称取[Rh(cod)

将上述反应体系进行氩气保护，在0℃下，加入10％Pd/C(20mg)，用氢气球将反应体系置换气3次，于室温下搅拌过夜。用LCMS检测反应，待反应完毕后，反应液用硅藻土过滤，真空减压浓缩反应液，无需进行纯化，以82％的产率得到16.3mg淡黄色固体8。

化合物8：R

HRMS(ESI)m/z calcd for C

实施例6

本实施例为CRV431衍生物的合成方法，以实施例1制备得到的环孢素衍生物[methylene-sar]

将化合物3(40mg,0.033mmol,1equiv.)加入到

化合物9：R

HRMS(ESI)m/z calcd for C

在充满氩气的手套箱里，以1:1.1的摩尔比称取[Rh(cod)

将上述反应体系进行氩气保护，在0℃下，加入10％Pd/C(20mg)，用氢气球将反应体系置换气3次，于室温下搅拌过夜。用LCMS检测反应，待反应完毕后，真空减压浓缩反应体系，粗产物用硅藻土过滤，以83％的产率得到24.9mg淡黄色固体10。

合物10：R

HRMS(ESI)m/z calcd for C

实施例7

化合物11的合成参照化合物4的合成方法。白色固体化合物11(26.6mg,60.6％yield,E/Z:94.2:5.8)。

R

The

The

HRMS(ESI)m/z calcd for C

化合物12的合成按照化合物6的合成方法。淡黄色固体化合物11(33mg,87％yield)。R

HRMS(ESI):m/z:calcd for C

实施例8

化合物13的合成按照化合物4的合成方法。白色固体化合物13(22.7mg,51.6％yield,E/Z:16.2:1)R

在充满氩气的手套箱里，以1:1.1的摩尔比称取[Rh(cod)

化合物14：R

HRMS(ESI)m/z calcd for C

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意合适方式的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅描述了本发明的几种实施方式，便于具体和详细理解本发明的技术方案，但并不能因此而理解为对发明保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。应当理解，本领域技术人员在本发明提供的技术方案的基础上，通过合乎逻辑的分析、推理或者有限的试验得到的技术方案，均在本发明所述附权利要求的保护范围内。