一种非洲猪瘟病毒PCR试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种非洲猪瘟病毒PCR试剂盒。

背景技术

非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fevervirus，ASFV)感染引起的一种急性、热性、接触性传染病，家猪病死率几乎100％，最早于1921年在肯尼亚爆发，经过近100年的传播，该病毒从欧洲大陆蔓延到俄罗斯远东，2018年8月3日，我国辽宁省沈阳市确诊首例非洲猪瘟疫情，随后在河南、江苏、浙江、安徽、黑龙江、内蒙古、吉林、天津、山西、云南、贵州、湖南、重庆、福建、四川、上海、江西、北京、青海、广东等地发现疫情，造成巨大经济损失。

非洲猪瘟病毒拥有庞大而复杂的基因组(170-194kb)，编码超过150-167个基因，病毒结构蛋白有50多个，其中p72衣壳蛋白占整个病毒粒子总蛋白的32％，根据p72序列分类，至少分为24种基因型，其中北非为基因Ⅰ型，俄罗斯、东欧、高加索地区主要为基因Ⅱ型，中国目前爆发的ASFV也主要为基因Ⅱ型。

PCR检测具有检测特异性高、灵敏度强、操作简单、可大批量检测等特点，p72蛋白是非常保守的病毒抗原，本发明针对我国目前流行株p72序列设计PCR反应引物，可以更加准确的对中国目前流行的非洲猪瘟病毒株进行检测和诊断。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，提供一种非洲猪瘟病毒PCR试剂盒，该试剂盒包括：引物、Ex Taq Buffer、Ex Taq Hot-start DNA聚合酶、MgCl

为了解决上述技术问题，本发明通过以下步骤实现：

1.从NCBI上获得中国流行非洲猪瘟VP72序列(MH722357.1，Seq ID No.1)；

2.使用Primer Premier 6.0针对保守序列设计引物，设计的引物序列为：PrimerF:5’-GACGCATGTTCATCTATATCTG-3’(Seq ID No.2)，R:5’-ATTCTCTTGCTCTGGATACG-3’(SeqID No.3)，长度268bp；

3.本发明所述试剂盒包括：引物、Ex Taq Buffer、Ex Taq Hot-start DNA聚合酶、MgCl

4.本发明所述试剂盒的使用步骤如下：

1)提取待测样品DNA；

2)以待测样品的DNA为模板，进行PCR扩增，PCR体系为：10×Ex Taq Buffer 2.0μl、1U/μl Ex Taq Hot-start DNA聚合酶0.3μl、10μM引物1μl、2.5mM dNTPs 2.0μl、20mMMgCl

3)对扩增产物进行分析，如果扩增产物出现268bp的特异条带，说明待测样品中含有非洲猪瘟病毒。

本发明的有益效果是：

本发明基于我国目前流行株p72序列设计PCR反应引物，可以更加准确的对中国目前流行的非洲猪瘟病毒株进行检测和诊断。

附图说明

图1特异性检验结果图

图2敏感性检验结果图

图3不同来源非洲猪瘟病毒检测

具体实施方式

下面通过实施例对本发明做进一步详细说明，实施例仅用来说明本发明，并不限制本发明的范围。

实施例1

1.主要试剂

Ex Taq Hot-start DNA酶、PCR Marker、dNTP、10×buffer、琼脂糖购自大连宝生生物工程有限公司，TwistAmp

2.DNA样品

猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪瘟病毒(CSFV，疫苗株)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪乙型脑炎病毒(JEV)、猪细小病毒(PPV)DNA样品由广东省动物疫病预防控制中心提取；连接有ASFV p72目的基因的质粒由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，其中目的片段长度417bp，连接于pGEM-T载体，转化大肠杆菌DH5α，扩大培养，抽提质粒DNA；

3.从NCBI上获得中国流行非洲猪瘟VP72序列(MH722357.1)；

4.使用Primer Premier 6.0针对保守序列设计引物，设计的引物序列为：PrimerF：5’-GACGCATGTTCATCTATATCTG-3’(Seq ID No.2)，R：5’-ATTCTCTTGCTCTGGATACG-3’(SeqID No.3)，长度268bp；

5.PCR扩增

PCR体系为：10×Ex Taq Buffer 2.0μl、1U/μl Ex Taq Hot-start DNA聚合酶0.3μl、10μM引物1μl、2.5mM dNTPs 2.0μl、20mM MgCl

6.对扩增产物进行分析，如果扩增产物出现268bp的特异条带，说明待测样品中含有非洲猪瘟病毒。

实验一试剂盒特异性检验

以猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪瘟病毒(CSFV，疫苗株)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪乙型脑炎病毒(JEV)、猪细小病毒(PPV)DNA样品以及ASFVp72为模板，用设计的引物PCR扩增，观察结果，结果见图1。

4泳道是非洲猪瘟病毒(ASFV)、1泳道是猪伪狂犬病病毒(PRV)、2泳道是猪瘟病毒(CSFV，疫苗株)、3泳道是猪圆环病毒2型(PCV2)、5泳道是猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、6泳道是猪乙型脑炎病毒(JEV)、7泳道是猪细小病毒(PPV)，从实验结果可以看出，本引物具有很好的特异性。

实验二：试剂盒敏感性检验

将初始浓度为500ng/μl的ASFV-p72-pUC57 DNA分别按1：10、1：20、1：30、1：40、1：50、1：60、1：70、1：80、1：90、1：100稀释，从每个稀释度各取2μl模板用PCR试剂盒进行检验，观察结果，实验结果见图2。

结果显示1％稀释的ASFV DNA模板也能用本试剂盒检测出来。

实验三：不同来源非洲猪瘟病毒检测能力

从NCBI上查询South Korea/19s804/2019/wild boar、VN/pig/Hue/1271、Georgia2007/1、97/Ot/2012、72407/Ss/2005、142/Nu/1995、26544/OG10、OURT 88/3、Benin 97/1菌株p72序列，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，连接于pUC57载体，转化大肠杆菌DH5α，扩大培养，抽提质粒DNA，用本发明PCR试剂盒扩增，实验结果见图3。

1泳道是South Korea/19s804/2019/wild boar、2泳道是VN/pig/Hue/1271、3泳道是Georgia 2007/1、4泳道是97/Ot/2012、5泳道是72407/Ss/2005、6泳道是142/Nu/1995、7泳道是26544/OG10、8泳道是OURT 88/3、9泳道是Benin 97/1，以上模板均扩增出了目的条带，说明本发明PCR试剂盒的引物序列高度保守，不仅可以检测目前中国流行的ASFV毒株，还可以检测其他毒株，具有很好的适用性。

序列表

<110> 广州博识生物科技有限公司

<120> 一种非洲猪瘟病毒PCR试剂盒

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 417

<212> DNA

<213> African swine fever virus

<400> 1

atgcagccca ctcaccacgc agagataagc tttcaggata gagatacagc tcttccagac 60

gcatgttcat ctatatctga tattagcccc gttacgtatc cgatcacatt acctattatt 120

aaaaacattt ccgtaactgc tcatggtatc aatcttatcg ataaatttcc atcaaagttc 180

tgcagctctt acataccctt ccactacgga ggcaatgcga ttaaaacccc cgatgatccg 240

ggtgcgatga tgattacctt tgctttgaag ccacgggagg aataccaacc cagtggtcat 300

attaacgtat ccagagcaag agaattttat attagttggg acacggatta cgtggggtct 360

atcactacgg ctgatcttgt ggtatcggca tctgctatta actttcttct tcttcag 417

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gacgcatgtt catctatatc tg 22

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

attctcttgc tctggatacg 20