抗人类CSF-1R抗体和其用途

技术领域

本发明大体上涉及可特异性中和人类CSF-1R的抗体以及其使用和制备方法。特定地说，本发明涉及可具有减少巨噬细胞的作用的抗体、此类抗体的制备和其在治疗与异常巨噬细胞增殖相关的疾病，如肿瘤方面的用途。

背景技术

CSF-1R(M-CSFR)是巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF或CSF-1)和IL-34的细胞表面受体。CSF-1与其受体的结合激活信号转导通路，包括PI3K/Akt和MAPK通路，引起单核细胞/巨噬细胞谱系的细胞的增殖、存活、活动性和分化。CSF-1R是由造血干细胞、骨髓细胞，包括单核细胞巨噬细胞、破骨细胞、树突状细胞和微神经胶质细胞，神经祖细胞表达。骨髓细胞是在先天性免疫和后天性免疫中起重要作用的异质且多功能的细胞。高可塑性和多样性是巨噬细胞谱系的特征。巨噬细胞可取决于微环境和代谢状态而分化成不同表型且具有不同的生物功能。在啮齿动物和人类中，巨噬细胞具有两种主要激活表型，即M1(经典或促发炎)表型和M2(替代性或抗炎)表型(曼托瓦尼A(Mantovani A)等人,2002)。M2巨噬细胞分泌抗炎性细胞因子，且其功能与组织修复和血管生成相关。

已在多种癌症中发现CSF-1R和/或其配体的表达或激活升高，且升高的M-CSF含量与某些癌症的不良预后相关(佩德森MB(Pedersen MB)等人,2017；张QW(Zhang QW)等人,2012)。M-CSF是牵涉到肿瘤相关巨噬细胞(TAM)募集的若干细胞因子中的一种，所述TAM展现与M2巨噬细胞类似的特征且促成肿瘤血管生成和肿瘤进展成转移。CSF-1R的激活还引起破骨细胞前体的增殖和分化，由此介导骨骼再吸收过程。因此，抑制CSF-1R将提供对癌症，尤其是癌症侵袭、血管生成、癌转移、免疫耐受和骨转移的治疗。另外，CSF-1R因其在破骨细胞生物学中的作用而成为骨质疏松症、炎症性关节炎和其它炎症性骨侵蚀的重要治疗目标。因此，中和抗体经由CSF-1R信号传导靶向TAM成为治疗肿瘤和炎症性/免疫性疾病的一个引人注目的策略。

发明内容

本发明的实施例涉及特异性结合到人类CSF-1R的抗体或其结合片段。所述抗体包括人类化抗体和人类抗体。在一个方面中，本发明涉及特异性结合到人类CSF-1R细胞外结构域(ECD)(SEQ ID NO:1)的抗体。本发明的抗体包含重链可变区序列，其包括HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中所述HCDR1序列是GYSFTGYNMN(SEQ ID NO:4)，所述HCDR2序列是NIDPYYGGTTYNQKFKG(SEQ ID NO:5)，所述HCDR3序列是GDYSGSSYWYFDV(SEQ ID NO:6)，其中所述HCDR序列是根据Kabat方法定义。根据本发明的一些实施例，特异性结合人类CSF-1R的抗体的重链可变区具有SEQ ID NO:2的序列。

在另一方面中，本申请案涉及特异性结合人类CSF-1R的抗体，其包含具有LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的轻链可变区，其中所述LCDR1序列是KASDHINNWLA(SEQ ID NO:7)，所述LCDR2序列是GATSLET(SEQ ID NO:8)，所述LCDR3序列是QQNNEDPLT(SEQ ID NO:9)，其中所述LCDR序列是根据Kabat方法定义。根据本发明的一些实施例，特异性结合人类CSF-1R的抗体的轻链可变区具有SEQ ID NO:3的序列。

在另一方面中，本发明涉及特异性结合人类CSF-1R的抗体，其包含具有HCDR1、HCDR2和HCDR3的重链可变区和具有LCDRl、LCDR2和LCDR3的轻链可变区，其中所述HCDR1序列是GYSFTGYNMN(SEQ ID NO:4)，所述HCDR2序列是NIDPYYGGTTYNQKFKG(SEQ ID NO:5)，所述HCDR3序列是GDYSGSSYWYFDV(SEQ ID NO:6)，所述LCDR1序列是KASDHINNWLA(SEQ ID NO:7)，所述LCDR2序列是GATSLET(SEQ ID NO:8)，所述LCDR3序列是QQYWSTPFT(SEQ ID NO:9)，且其中所述HCDR和LCDR序列是根据Kabat方法定义。

在一些实施例中，特异性结合人类CSF-1R的抗体的重链可变区具有SEQ ID NO:2的序列，且所述特异性结合人类CSF-1R的抗体的轻链可变区具有SEQ ID NO:3的序列。

在本发明的一些实施例中，特异性结合人类CSF-1R的抗体是完整抗体、Fab片段、F(ab')2片段或ScFv片段。

在一些实施例中，特异性结合人类CSF-1R的抗体是完全人类抗体。

在一些实施例中，特异性结合人类CSF-1R的抗体进一步包含选自IgG1、IgG2或IgG4同源异构体的重链恒定区和选自κ亚型或λ同源异构体的轻链恒定区。

在一些实施例中，本发明的抗体(或其结合片段)通过与针对第二目标的另一特定结合结构域缀合而形成双特异性或多特异性抗体的一部分。在一些实施例中，本发明的抗体(或其结合片段)通过与药物(有效负载)缀合而形成抗体-药物缀合物(ADC)的一部分。所述药物或有效负载可根据其调节表达CSF-1R的细胞的能力来选择。

本发明的另一方面涉及一种用于治疗由CSF-1R介导的疾病的医药组合物，其中所述医药组合物包含治疗有效量的特异性结合到人类CSF-1R的抗体或其结合片段。治疗有效量是足以产生所希望的治疗结果的量。所属领域的技术人员应理解，治疗有效量将取决于疾病状况、患者(性别、年龄、身体状况等)、投与途径等。所属领域的技术人员将能够在不进行过度实验的情况下鉴别出此类量。

本发明的另一方面涉及包含特异性结合人类CSF-1R的抗体或其结合片段的医药组合物的用途，所述医药组合物是用于治疗和/或预防由CSF-1R、CSF-1和/或IL-34介导的疾病。

在一些实施例中，所述CSF-1R、CSF-1和/或IL-34介导的疾病是癌症。

在一些实施例中，癌症包括(但不限于)多发性骨髓瘤、白血病(例如急性骨髓性白血病(AML)和慢性骨髓性白血病(CML))、前列腺癌、多形性胶质母细胞瘤、骨巨细胞瘤、腱鞘巨细胞瘤、向其它组织的肿瘤转移和胃肠基质瘤、黑色素瘤、非小细胞肺癌、肾癌、乳癌、白血病、卵巢癌、骨髓纤维化、胃肠基质瘤和其它晚期实体肿瘤。

在一些实施例中，所述CSF-1R、CSF-1和/或IL-34介导的疾病是炎症性或免疫性疾病。

在一些实施例中，所述炎症性或免疫性疾病是色素沉着绒毛结节性滑膜炎(PVNS)、骨质疏松症、炎症性关节炎或其它炎症性骨侵蚀。

附图说明

图1示出通过ELISA测定的mAb AB21抗体与CSF-1R的结合。

图2示出通过Biacore分析测定的mAb AB21与人类CSF-1R的结合。

图3示出mAb AB21阻断CSF-1与CSF-1R之间的结合的能力。

图4示出通过流式细胞术测定的mAb AB21与细胞表面上的CSF-1R结合的能力。

图5示出mAb AB21抑制Ba/F3-CSF-1R细胞系的CSF-1依赖性细胞生长的能力。

图6示出mAb AB21阻断CSF-1R下游信号传导的能力。

图7示出mAb AB21与其它CSF-1R抗体的竞争ELISA。

图8示出mAb AB21的结合表位。

图9A显示本发明的抗CSF-1R抗体变异体的重链可变区。示出CDR1、CDR2、CDR3、FR1、FR2、FR3和FR4的位置。

图9B显示本发明的抗CSF-1R抗体变异体的轻链可变区。示出CDR1、CDR2、CDR3、FR1、FR2、FR3和FR4的位置。

图10显示的表示出本发明抗体的回复突变残基。

图11显示本发明的各种抗CSF-1R抗体变异体的表达和表征结果。

图12显示本发明的抗CSF-1R变异体的ELISA结合分析。

图13显示本发明的抗CSF-1R抗体以及其与抗PD-1抗体派姆单抗(Pembrolizumab)的组合疗法抑制人类RKO结肠直肠癌的结果。所述组合疗法产生协同作用。

具体实施方式

本发明的实施例涉及新颖抗体，其可以高亲和力特异性结合到人类CSF-1R且可为个体提供治疗益处。所述抗体可为人类化抗体或人类抗体。在一些实施例中，抗CSF-1R抗体可强效地中和由CSF-1诱导和/或由IL-34诱导的CSF-1R信号传导。本发明的抗体可为人类或人类化抗体，其可用作治疗如本文更完整地描述的由CSF-1R介导的多种病症的治疗剂。

本发明的一些实施例涉及抗CSF-1R抗体或其抗原结合片段的用途，其是用于诊断、评估和治疗与CSF-1R、CSF-1和/或IL-34或其异常表达相关的疾病或病症。主题抗体是用于治疗或预防肿瘤和/或治疗或预防自身免疫性和/或炎症性疾病等疾病。

具体地说，根据本发明的实施例的抗体或其抗原结合片段可特异性结合到人类CSF-1R细胞外结构域(ECD)或其片段中的表位，其中所述人类CSF-1R细胞外结构域(ECD)具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列，且所述表位位于跨越残基228-233的区域中：丝氨酸-228、缬氨酸-229、天冬氨酸-230、缬氨酸-231、天冬酰胺-232和苯丙氨酸-233。即，表位位于

根据本发明的实施例的抗体可以为全长的(例如IgG1或IgG4抗体)，或可仅包含其抗原结合片段/部分(例如Fab、F(ab')2或scFv片段)，且可视需要经修饰以改善功能。

根据本发明的实施例的抗体或其抗原结合片段特异性结合到人类CSF-1R。人类CSF-1受体(CSF-1R；集落刺激因子1受体；同义词：M-CSF受体；巨噬细胞集落刺激因子1受体、Fms原癌基因、c-fms，SEQ ID NO:1)，又称为CD115，是由原癌基因c-fms编码的单程I型膜蛋白，具有972个氨基酸且预测分子量为107千道尔顿(kilo Dalton)。其充当集落刺激因子1(CSF-1或M-CSF)的受体，是一种控制巨噬细胞的增殖、分化和功能的细胞因子。在2008年已鉴别出CSF-1R的另一种配体，即白介素-34(IL-34)。

CSF-1R的作用可能涉及免疫反应、骨再成型和生殖系统，因为经显示，针对CSF-1(波拉德J.W.(Pollard,J.W.),分子生殖与发育(Mol.Reprod.Dev.)46(1997)54-61)或CSF-1R(戴X.M(Dai,X.M)等人,血液(Blood)99(2002)111-120)的基因敲除小鼠可具有骨硬化、造血、组织巨噬细胞和/或生殖表型。

CSF-1R信号传导的主要生物作用包括造血前体细胞向巨噬细胞谱系细胞，如巨噬细胞、破骨细胞和微神经胶质细胞的分化，以及其增殖、迁移和存活。CSF-1(M-CSF)与CSF-1R结合将诱导形成同二聚体并通过酪氨酸磷酸化诱导激酶激活，由此进一步引起下游PI3K、AKT和MAPK信号传导。

如本文所使用，术语“抗体”意指包含至少一个特异性结合到特定抗原(例如CSF-1R)或与特定抗原相互作用的互补决定区(CDR)的任何抗原结合分子或分子复合物。术语“抗体”包括免疫球蛋白分子以及其多聚体，所述免疫球蛋白分子包含四条多肽链，即通过二硫键互相连接的两条重(H)链和两条轻(L)链。每条重链包含重链可变区(VH)和重链恒定区，所述重链恒定区包含三个结构域，即CH1、CH2和CH3。每条轻链包含轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL1)。VH和VL区可进一步细分成多个互补决定区(CDR)，间杂有框架区(FR)。每个VH和VL由三个CDR和四个FR构成，从氨基末端到羧基末端按以下顺序布置：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。在本发明的不同实施例中，FR可与人类生殖系序列一致或可经天然或人工修饰。

如本文所使用，术语抗体的“抗原结合部分”或“抗原结合片段”等包括特异性结合抗原以形成复合物的任何天然存在的、可以酶法获得的、合成的或经基因工程改造的多肽或糖蛋白。抗体的抗原结合片段可使用任何适合的标准技术，如蛋白水解消化或重组基因工程改造技术，由完整抗体分子得到。

抗原结合片段的非限制性实例包括：(i)Fab片段；(ii)F(ab')2片段；(iii)Fd片段；(iv)Fv片段；(v)单链Fv(scFv)分子；(vi)dAb片段；以及(vii)由氨基酸残基组成的模拟抗体高变区的最小识别单元(例如经分离的互补决定区(CDR)，如CDR3肽)，或受限制的FR3-CDR3-FR4肽。其它经工程改造的分子，如结构域特异性抗体、单结构域抗体、结构域缺失抗体、嵌合抗体、CDR移植抗体、双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体、微型抗体、纳米抗体(例如单价纳米抗体、二价纳米抗体等)、小模块免疫药物(SMIP)和鲨鱼可变IgNAR结构域也涵盖在如本文所使用的表述“抗原结合片段”内。

抗体的抗原结合片段典型地包含至少一个可变结构域。所述可变结构域可具有任何尺寸或氨基酸组成且一般将包含至少一个CDR，所述至少一个CDR与一或多个框架序列相邻或同框。在具有与VL结构域缔合的VH结构域的抗原结合片段中，VH和VL结构域可相对于彼此以任何适合布置定位。举例来说，可变区可为二聚的且含有VH-VH、VH-VL或VL-VL二聚体。或者，抗体的抗原结合片段可含有单体VH或VL结构域。

在某些实施例中，抗体的抗原结合片段可含有共价连接到至少一个恒定结构域的至少一个可变结构域。可在本发明抗体的抗原结合片段内发现的可变结构域和恒定结构域的非限制性示例性配置包括：(i)VH-CH1；(ii)VH-CH2；(iii)VH-CH3；(iv)VH-CH1-CH2；(v)VH-CH1-CH2-CH3,(vi)VH-CH2-CH3；(vii)VH-CL；(viii)VL-CH1；(ix)VL-CH2；(x)VL-CH3；(xi)VL-CH1-CH2；(xii)VL-CH1-CH2-CH3；(xiii)VL-CH2-CH3；和(xiv)VL-CL。在包括以上所列示例性配置中的任一种在内的可变结构域和恒定结构域的任何配置中，可变结构域和恒定结构域可彼此直接连接或可通过完整或部分铰链或连接子区连接。铰链区可由至少2个(例如5、10、15、20、40、60个或更多个)氨基酸组成，所述氨基酸在单一多肽分子中的相邻可变结构域和/或恒定结构域之间产生柔性或半柔性键联。此外，本发明抗体的抗原结合片段可包含以上所列可变结构域和恒定结构域配置中的任一种彼此和/或与一或多个单体VH或VL结构域(例如通过二硫键)非共价缔合产生的同二聚体或异二聚体(或其它多聚体)。

与完整抗体分子相同，抗原结合片段可为单特异性或多特异性(例如双特异性)的。抗体的多特异性抗原结合片段典型地将包含至少两个不同的可变结构域，其中每个可变结构域能够与独立抗原或与同一抗原上的不同表位特异性结合。可以使用所属领域中可用的常规技术使任何多特异性抗体形式，包括本文所公开的示例性双特异性抗体形式适合用于本发明抗体的抗原结合片段情形。

本发明的抗体可以能特异性靶向CSF-1R的抗体-药物缀合物(ADC)形式使用。ADC上的缀合物可调节表达CSF-1R的免疫细胞或与表达CSF-1R的细胞(例如CSF-1R表达细胞)相互作用的细胞。这些ADC可使用本发明的任何抗体或其抗原结合片段。与抗体(或结合片段)缀合的药物(有效负载)可为ADC中常用的任何药物。缀合方法可为所属领域中已知的方法。

优选地，根据本发明的实施例的抗体或其抗原结合片段是哺乳动物抗体。如本文所使用，术语“哺乳动物抗体”打算包括具有来源于哺乳动物生殖系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。本发明的哺乳动物抗体可在例如CDR中，特别是在CDR3中，或在其它区域中包括并非由哺乳动物生殖系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如通过体外随机或位点特异性突变诱发或通过体内体细胞突变引入的突变)。

如本文所使用，术语“重组哺乳动物抗体”打算包括通过重组方式制备、表达、产生或分离的所有哺乳动物抗体，如使用转染到宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体(于以下进一步描述)；从重组、组合哺乳动物抗体文库分离的抗体(于以下进一步描述)；从针对哺乳动物免疫球蛋白基因的转基因动物(例如小鼠)分离的抗体；或通过涉及将哺乳动物免疫球蛋白基因序列剪接到其它DNA序列的任何其它方式制备、表达、产生或分离的抗体。此类重组哺乳动物抗体具有来源于哺乳动物生殖系免疫球蛋白序列的可变和恒定区。然而，在某些实施例中，此类重组哺乳动物抗体经历体外突变诱发(或当使用针对人类Ig序列的转基因动物时为体内体细胞突变诱发)且因此，重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是来源于人类生殖系VH和VL序列且与人类生殖系VH和VL序列相关，但可能并非在体内天然地存在于哺乳动物抗体生殖系谱系内的序列。

哺乳动物抗体，如人类抗体可以与铰链异质性相关的两种形式存在。在一种形式中，免疫球蛋白分子包含约150-160kDa的稳定四链构建体，其中二聚体通过链间重链双硫键保持在一起。在第二种形式中，二聚体不经由链间双硫键连接且形成由共价偶合的轻链和重链构成的约75-80kDa的分子(半抗体)。这些形式极难分离，即使是在亲和纯化之后也是如此。

相较于从其衍生抗体的相应生殖系序列，本文所公开的抗CSF-1R抗体或抗原结合片段可在重链和/或轻链可变结构域的框架区和/或CDR区中包含一或多个氨基酸取代、插入和/或缺失。本发明包括来源于本文所公开的氨基酸序列中的任一个的抗体和其抗原结合片段，其中在一或多个框架区和/或CDR区内的一或多个氨基酸可突变成从其衍生抗体的生殖系序列的相应残基，或突变成另一哺乳动物生殖系序列的相应残基，或突变成相应生殖系残基的保守氨基酸取代(此类序列变化在本文中统称为“生殖系突变”)。所属领域的普通技术人员从本文所公开的重链和轻链可变区序列开始，可容易地产生包含一或多个个别生殖系突变或其组合的多种抗体和抗原结合片段。

在某些实施例中，VH和/或VL结构域内的一或多个框架和/或CDR残基可回复突变成作为抗体来源的原始生殖系序列中所发现的残基。在其它实施例中，仅某些残基可回复突变成原始生殖系序列，例如仅FR1之前8个氨基酸内或FR4之后8个氨基酸内所发现的突变残基，或仅CDR1、CDR2或CDR3内所发现的突变残基。在其它实施例中，一或多个框架和/或CDR残基可突变成不同生殖系序列(即，不同于最初得到抗体的生殖系序列的生殖系序列)的相应残基。

此外，本发明抗体可在框架区和/或CDR区内含有两个或超过两个生殖系突变的任何组合，例如其中某些个别残基突变成特定生殖系序列的相应残基，而不同于原始生殖系序列的某些其它残基则维持不变或突变成不同生殖系序列的相应残基。一旦得到含有一或多个生殖系突变的抗体和抗原结合片段，即可容易地测试其一或多种所希望的特性，如改善的结合特异性、增加的结合亲和力、改善或增强的拮抗或激动生物特性(视具体情况而定)、降低的免疫原性等。本发明的范围内涵盖以此一般方式获得的抗体和抗原结合片段。

当提及核酸或其片段时，术语“相当大一致性”或“基本上一致”指示当在适当核苷酸插入或缺失存在下与另一核酸(或其互补链)最佳地比对时，如通过以下论述的任何熟知的序列一致性算法，如FASTA、BLAST或Gap所测量，在至少约95％，且更优选地至少约96％、97％、98％或99％的核苷酸碱基中存在核苷酸序列一致性。与参考核酸分子具有相当大一致性的核酸分子在某些情况下可编码具有与由所述参考核酸分子所编码的多肽相同或基本上相似的氨基酸序列的多肽。

当应用于多肽时，术语“相当大的相似性”或“基本上类似”意指两个肽序列在如通过程序GAP或BESTFIT，使用缺省空位权重最佳地比对时，共有至少95％序列一致性，甚至更优选地至少98％或99％序列一致性。优选地，不一致的残基位置的差异在于保守氨基酸取代。“保守氨基酸取代”是氨基酸残基经侧链(R基团)具有类似化学/物理特性(例如电荷或疏水性)的另一氨基酸残基取代的氨基酸取代。一般来说，保守氨基酸取代不会基本上改变蛋白质的功能特性。在两个或超过两个氨基酸序列因保守取代而彼此不同的情况下，可上调序列一致性百分比或相似度以对保守取代性质进行校正。进行此调整的方式是所属领域的技术人员熟知的。侧链具有类似化学特性的氨基酸组的实例包含(1)脂肪族侧链：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；(2)脂肪族羟基侧链：丝氨酸和苏氨酸；(3)含有酰胺的侧链：天冬酰胺和谷氨酰胺；(4)芳香族侧链：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；(5)碱性侧链：赖氨酸、精氨酸和组氨酸；(6)酸性侧链：天冬氨酸和谷氨酸；和(7)含硫侧链是半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守氨基酸取代组是：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸-天冬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。或者，保守置换是在以引用的方式并入本文中的戈内特(Gonnet)等人(1992)科学(Science)256:1443-1445中所公开的PAM250对数似然矩阵中具有正值的任何变化。“适度保守性”置换是在PAM250对数似然矩阵中具有非负值的任何变化。

典型地使用序列分析软件来测量多肽的序列相似性，又称为序列一致性。蛋白质分析软件使用分配给包括保守氨基酸取代在内的各种取代、缺失和其它修饰的相似性量度来匹配相似序列。举例来说，GCG软件含有如Gap和Best fit之类程序，其可使用缺省参数测定密切相关的多肽，如来自不同生物体物种的同源多肽之间或野生型蛋白质与其突变体之间的序列同源性或序列一致性。多肽序列还可使用FASTA，即6.1版GCG中的程序，使用缺省或推荐参数进行比较。FASTA(例如FASTA2和FASTA3)提供查询序列与搜索序列之间最佳重叠区域的比对和序列一致性百分比(皮尔逊(Pearson)(2000)，同前文献)。当将本发明的序列与含有来自不同生物体的大量序列的数据库相比较时，另一优选的算法是电脑程序BLAST，尤其是BLASTP或TBLASTN，使用缺省参数。参见例如阿尔舒尔(Altschul)等人(1990)分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)215:403-410；和阿尔舒尔等人(1997)核酸研究(NucleicAcids Res.)25:3389-402，各自以引用的方式并入本文中。

在本发明的优选实施例中，抗体或其抗原结合片段包含重链可变区的互补决定区和轻链可变区的互补决定区，其中所述重链可变区的互补决定区包含CDRH1(或HCDR1)、CDRH2(或HCDR2)和CDRH3(或HCDR3)区，且所述轻链可变区的互补决定区包含CDRL1(或LCDR1)、CDRL2(或LCDR2)和CDRL3(或LCDR3)区。

根据本发明的一些实施例，CDRH1区包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性的基本上类似的序列；CDRH2区包含SEQID NO:5的氨基酸序列或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性的基本上类似的序列；CDRH3区包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性的基本上类似的序列；CDRL1区包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性的基本上类似的序列；CDRL2区包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性的基本上类似的序列；且CDRL3区包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性的基本上类似的序列。

根据本发明的优选实施例，抗CSF-1R抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性的基本上类似的序列。优选地，重链可变区是由SEQ ID NO:2的核酸序列编码。抗CSF-1R抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区，其包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性的基本上类似的序列或其基本上类似的序列。优选地，轻链可变区是由SEQ ID NO:3的核酸序列编码。

经由ELISA或BIAcore分析确定本发明的抗体与CSF-1R具有特异性结合。简单来说，对于ELISA，将CSF-1R涂布于96孔ELISA板(1μg/ml)上。在抗CSF-1R抗体结合之后，使用与辣根过氧化酶(HRP)缀合的山羊抗小鼠IgG作为第二抗体，且使用3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)作为底物以评估抗体-CSF-1R结合。读取OD450以计算活性。

如图1(ELISA)和图2(BIAcore)中所示，小鼠融合瘤抗人类CSF-1R抗体(mAb AB21)与CSF-1R显示特异性结合。图1显示由ELISA分析得到的结果，其中将M-CSF R/CD115Fc嵌合体(来自明尼苏达州明尼阿波利斯的安迪系统公司(R&D Systems,Inc.,Minneapolis,MN))涂布于96孔中并添加各种浓度的mAb AB21。在结合和洗涤之后，使用辣根过氧化酶缀合的二级抗体评估结合的mAb AB21。结果显示，mAb以高亲和力(Kd为约0.745nM)结合到此抗原。图2显示由Biacore分析得到的类似结果。

针对CSF-1R的有用抗体应阻断CSF-1与CSF-1R之间的结合。用基于ELISA的分析评估mAb AB21是否能阻断CSF-1与CSF-1R之间的结合。简单来说，将1.2μg/ml浓度的CSF-1RECD涂布于96孔板中过夜。接着，洗涤所述孔并用1％阻断缓冲液阻断。洗涤之后，添加经连续稀释的抗体，且接着将CSF-1配体(100ng/mL)添加到孔中。在抗体阻断之后，使用人类M-CSF生物素化抗体和链霉抗生物素蛋白过氧化酶(POD)缀合物作为二级抗体并使用3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)作为底物以评估抗CSF-1R抗体的阻断活性。读取OD450以计算活性。

如图3中所示，本发明的mAb AB21显示阻断CSF-1/CSF-1R相互作用的特异性且强效的活性。这些结果证实，本发明抗体将有效抑制由CSF-1和CSF-1R信号传导介导的肿瘤相关巨噬细胞的增殖和分化。

除ELISA分析外，也可通过流式细胞术，使用内源性表达CSF-1R的THP-1细胞系(一种人类单核细胞系)分析抗CSF-1R抗体与表达CSF-1R的细胞的结合。简单来说，将THP-1细胞与抗CSF-1R抗体一起培育1小时，接着使用流式细胞术进行分析。如图4中所示，本发明的mAb AB21可以一种特异性方式结合THP-1细胞，指示此抗体可识别细胞表面上的CSF-1R。

以上结果清楚地指示，本发明的抗CSF-1R抗体可以高亲和力结合体外和细胞表面上的CSF-1R。因此，这些抗体应能够改变由CSF-1R介导的细胞活性。以下实例证明，实际上，这些抗体可干扰CSF-1与CSF-1R之间的相互作用，由此中断CSF-1R介导的信号传导和随之引起的细胞功能/活性。

在用抗CSF-1R单克隆抗体治疗下Ba/F3-CSF-1R细胞的生长抑制。

在Ba/F3细胞系(德国国家菌种保藏中心(DSMZ，Germany))中稳定表达全长人类CSF-1R基因，并在补充有10％胎牛血清(生物工业公司(Biological Industries),04-121-1A)和重组人类M-CSF(安迪系统公司)的RPMI 1640中培养。此细胞系的生长依赖于重组人类IL-3、CSF-1和IL-34(均来自安迪系统公司)。为评估本发明抗体的体内活性，将8×10

如图5中所示，本发明的抗CSF-1R抗体mAb AB21可阻断CSF-1与CSF-1R之间的相互作用，由此抑制CSF-1依赖性Ba/F3-CSF-1R细胞生长。这些结果指示，本发明的抗体可用于在体内治疗CSF-1R介导的疾病。

抗CSF-1R单克隆抗体治疗使CSF-1R下游信号传导下调。

通过蛋白印迹法(western blot)分析抗CSF-1R结合到CSF-1R对CSF-1R的下游信号传导的影响。用较高和较低剂量的mAb AB21处理在重组人类M-CSF(rhM-CSF)存在或不存在下培养的THP-1或Ba/F3-CSF-1R细胞。如图6中所示，mAb AB21可以剂量依赖性方式抑制CSF-1R和AKT的磷酸化，AKT是在CSF-1R信号传导下游的激酶。这些结果指示，本发明的抗体实际上可抑制CSF-1R介导的信号传导。因此，本发明的抗体应可用于治疗由CSF-1R介导的疾病。

抗CSF-1R单克隆抗体AB21结合到与临床试验中的其它抗CSF-1R单克隆抗体所结合不同的表位。

在市场上有若干种抗CSF-1R抗体。可用竞争分析研究本发明抗体是否结合到相同表位。简单来说，在临床试验中的其它抗CSF-1R单克隆抗体，如RG7155(罗氏公司(Roche))、FPA008(五主要公司(Five Prime))和IMC-CS4(礼来公司(Eli Lilly))存在下，通过ELISA结合分析对mAb AB21进行分析。如图7中所示，这些抗体均无法阻止或影响mAb AB21与CSF-1R的结合。这些结果指示，mAb AB21的结合表位不同于RG7155、FPA008和IMC-CS4的结合表位。

抗CSF-1R单克隆抗体AB21的结合表位分析。

为了阐明mAb AB21的结合表位，对mAb AB21与通过单点突变或片段突变产生的不同CSF-1R ECD突变体的结合执行ELISA分析。产生十(10)种不同的CSF-1R细胞外结构域(ECD)突变体：E29A、W50G、W159G、90-100A、100-106A、120-130A、151-163A、171-185A、228-233A和281-286A，所述突变体在指定位置处携带单一Ala突变或在指定区域中携带一连串Ala突变。如图8中所示，仅具有228-233突变的ECD片段丧失mAb AB21的结合，表明在228-233处的残基对于mAb 21结合到CSF-1R ECD至关重要。测试的所有其它ECD突变体均保持mAb 21结合，表明在这些残基处的突变将不会影响mAb 21与CSF-1R ECD的结合。这些结果指示，抗CSF-1R单克隆抗体mAb AB21的表位是位于跨越残基228-233的区域中。

以上实例清楚地显示，本发明的抗CSF-1R抗体AB21可特异性且紧密地结合人类CSF-1R。这些抗体也可干扰CSF-1与CSF-1R之间的相互作用并阻断CSF-1/CSF-1R结合，由此抑制CSF-1/CSF-1R介导的信号传导。因此，本发明的抗体可用作治疗由CSF-1/CSF-1R相互作用介导的疾病的治疗剂。此类疾病包括例如癌症和炎症性/免疫性疾病。癌症的实例包括(但不限于)肺癌、乳癌、前列腺癌、结肠直肠癌等。

本发明的一些实施例涉及用于治疗由CSF-1R介导的疾病的方法，此类疾病可包括癌症。为展示本发明抗体在治疗癌症方面的效用，使用鼠类模型。简单来说，将RKO细胞皮下注射到IL-6NOG小鼠(塔康尼克公司(Taconic))中，所述小鼠已移入人类PBMC以重建人类免疫系统。在第8天、第15天和第22天，每次用30mpk(mg/Kg)、或10mpk、或30mpk本发明抗体(例如mAB21)与5mpk派姆单抗(Keytruda)的组合治疗小鼠。使用IgG(非抗CSF-1R)作为对照。监测各个治疗组中的肿瘤生长情况，直到第33天。

如图13中所示，本发明的抗CSF-1R mAb在此体内结肠直肠癌模型中有效治疗癌症且有与检查点抑制剂组合的潜力。这些结果清楚地展示，本发明抗体将可用于在临床上使用以治疗癌症。

本发明的一些实施例涉及用于治疗由CSF-1R介导的疾病的方法，此类疾病可包括癌症。本发明的一些实施例涉及用于治疗炎症性/免疫性疾病的方法。

以下实例将进一步说明本发明的实施例。所属领域的技术人员应理解，这些实例仅用于说明目的且不意图限制本发明的范围，且在不脱离本发明的范围的情况下，其它修改和变化均是可能的。

实例

实例1.AB21单克隆抗体的CSF-1R结合ELISA

为评价抗人类CSF-1R抗体AB21 mAb的结合亲和力，使融合瘤在含有15％胎牛血清(FCS)的IMDM中生长。培养一周之后，收集1×10

将一百(100)纳克人类CSF-1R-Fc蛋白质涂布于96孔ELISA板上，且再用PBS洗涤所述板。将从1×10

本实验的结果示于图1中。AB21 mAb抗体的Kd值是7.45×10

实例2.使用BIAcore测定针对CSF-1R的抗CSF-1R抗体的亲和力仪器：

为了解个别抗体间的结合动力学差异，如先前所描述(卡尔森(Karlsson)和法伊特(Fait),(1997)免疫方法杂志(J.Immunol Methods)200:121-133)，使用BIAcore T200(新泽西州皮斯卡特维的拜尔科公司(BIAcore,Inc.,Piscataway,N.J.))进行表面等离激元共振(SPR)测量。根据供应商的说明书，用N-乙基-N'-(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)激活羧甲基化葡聚糖生物传感器芯片(CMS,拜尔科公司)。用pH 4.8的10mM乙酸钠将AB21 mAb稀释到5μg/ml，随后以20μL/min的流动速率注射以得到约100个反应单位(RU)的经偶合蛋白质，随后注射1M乙醇胺以阻断未反应的基团。对于动力学测量，在25℃下，将两倍连续稀释的CSF-1R-ECD(0.3125nM到40nM)以30μL/min的流动速率注射于由制造商提供的HBS-P BIAcore运行缓冲液(新泽西州皮斯卡特维的拜尔科公司)中，并通过减去在空白流动池上的反应来校正AB21mAb上的结合反应。使用简单的一比一朗格缪尔结合模型(one-to-one Langmuir binding model)，计算缔合速率(kon或ka)和解离速率(koff或kd)，且对kon和koff使用分别拟合。(BIAcore

结果示于图2中。AB21 mAb与CSF-1R的结合的kon和koff分别为3.99×10

实例3.CSF-1与CSF-IR的结合的抑制(ELISA)

用涂布缓冲液将CSF-1R-ECD-人类Fc(内部的)稀释到1.2μg/ml并在4℃下涂布过夜。在培育步骤之后，用洗涤缓冲液洗涤各板1次并在室温下，用1％酪蛋白阻断缓冲液阻断2小时。在37℃下，将不同稀释度的经纯化AB21抗体与存于稀释缓冲液中的250ng/ml M-CSF(安迪系统公司,216-GMP-025)一起培育1小时。在培育1小时之后，洗涤5次，之后可通过50ng/ml生物素化抗CSF-1克隆系BAF216(安迪系统公司，英国)和1:5000稀释的链霉抗生物素蛋白HRP(德国罗氏诊断公司(Roche Diagnostics GmbH，DE)，目录号11089153001)检测结合到受体的配体。使用抑制配体-受体相互作用的抗CSF-IR SC 2-4A5(美国圣克鲁兹生物技术公司(Santa Cruz Biotechnology,US))作为阳性对照。用TMB微孔过氧化酶底物(KPL,95059-154)使各板显色。在450nm下测量吸光度。如果抗CSF-lR抗体引起CSF-1从二聚体复合物释放，则发现吸光度减小。如图3中所示，抗CSF-lR抗体AB21显示对CSF-1与CSF-1R的相互作用的显著抑制，指示AB21 mAb可有效地阻断CSF-1配体与CSF-1R的结合。这些结果表明，本发明的抗体可用于阻断CSF-1R介导的生物作用。因此，本发明的抗体可用于预防或治疗由CSF-1R或CSF-1介导的疾病。

实例4.流式细胞术亲和力测定

除在体外结合CSF-1R ECD外，本发明的抗体还可结合细胞上的CSF-1R。在本实例中，用从6到0.625μg/ml的不同浓度的抗体(AB21)对THP-1细胞(人类单核细胞系，

实例5.在用抗CSF-lR单克隆抗体处理下Ba/F3-hCSF-1R重组细胞的生长抑制

为评估AB21 mAb抑制CSF-1生长依赖性细胞的CSF-1R活性，用人类CSF-1R稳定转染鼠类原B细胞系Ba/F3(德国国家菌种保藏中心目录号ACC 300)以实现Ba/F3-hCSF-1R人类CSF-1依赖性生长。在含10％FCS和30ng/ml重组人类M-CSF(rhM-CSF，安迪系统公司,216-MC)的RPMI中维持Ba/F3-hCSF-1R细胞。将8×10

实例6.抗CSF-1R抗体抑制CSF-1诱导的CSF-1R磷酸化

在含有10％FCS的RPMI 1640(吉布科(Gibco),11875-093)中维持THP-1细胞。在不含rhM-CSF-1的培养基中培养细胞一天，随后进行信号传导研究。使3×10

实例7.抗CSF-1R Ab AB21与临床试验中的抗CSF-1R Ab的竞争分析

在市场上和临床试验中有若干种抗CSF-1R抗体。为了测试AB21 mAb是否能与这些已知抗体竞争，在4℃下将1μg/ml CSF-1R-ECD-hFc涂布于96孔板中过夜。将板中内含物轻敲到凹槽中并添加每孔100μl阻断缓冲液以阻断非特异性结合。在室温下培育至少1小时。将板中内含物轻敲到凹槽中并用300μl洗涤缓冲液洗涤孔三次。添加每孔100μl含一级抗体的阻断缓冲液(1μg/mL RG7155、0.25μg/mL IMC-CS4)并在37℃下培育1小时。使用2A6作为阴性对照抗体，所述抗体不识别人类CSF-1R。将板中内含物轻敲到凹槽中并用300μl洗涤缓冲液洗涤孔三次。添加每孔100μl含4倍连续稀释的竞争抗体的阻断缓冲液(最高浓度是2μg/ml)并在37℃下培育1小时。用300μl洗涤缓冲液洗涤孔三次。添加每孔100μl底物溶液(TMB)并在室温下反应20分钟，且用100μl的1N HCl停止反应。测量板的450nm吸光度并经由GraphPad Prism 5计算EC

图7中的结果显示，AB21 mAb的结合不受临床试验中正使用的所述抗CSF-1R抗体(RG7155、FPA008、IMC-CS4)干扰。这些结果表明，AB21 mAb结合的CSF-1R ECD的表位不同于这些其它抗体所结合的表位。因此，当其它抗体因消除其结合的CSF-1R突变而变得无效时，本发明的抗体可用作替代性治疗剂。

实例8.抗CSF-1R抗体AB21对比临床试验抗体的表位定位

为确定抗CSF-1R抗体AB21的结合表位，构建某些残基经丙氨酸置换的不同CSF-1R细胞外结构域变异体。CSF-1R ECD变异体包括E29A、W50G、W159G、90-100A、100-106A、120-130A、151-163A、171-185A、228-233A和281-286A。在变异蛋白质纯化之后，通过ELISA，利用实例1中所述的方法分析AB21 mAb与这些CSF-1R-ECD变异体的结合亲和力。图8中所示的结果展示，AB21 mAb的结合表位是位于人类CSF-1R中的残基228-233处，因为仅CSF-1R ECD的228-233A变异体无法与AB21 mAb结合。

实例9.根据以下所描述的方法执行编码抗体AB21 mAb的基因的克隆

(1)抗体基因的cDNA克隆和制备

在含有15％FCS的IMDM培养基(由吉布科制造)中培养融合瘤。在细胞数量达到约10×10

(a)根据

(b)通过PCR扩增重链基因和轻链基因

添加聚G反应物(TdT反应)：cDNA和10×TdT缓冲液TdT酶(末端脱氧核苷酸转移酶；NEB M0315L)、CoCl

RACE PCR：通过聚C和3'反向引物(AS1和AS2)(示于表1中)扩增重链和轻链。

表I–3'反向引物清单

根据公开的黑泽尔(Kurosawa)等人,BMC生物学(BMC Biology)2012,10:80，设计出小鼠AS引物。制备具有5μL的cDNA、5μL的10×反应缓冲液、1μL的10mM dNTP混合物、1μL的2.5单位Taq聚合酶以及由引物集提供的1μL正向引物1和1μL反向引物2的组合物的PCR反应溶液，用双蒸水达到50μL最终体积，并进行PCR。为了扩增抗体的轻链和重链，使用在94℃下保持10分钟的循环，接着将在94℃下保持一分钟，在52℃下保持1分钟和在72℃下保持1分钟的循环重复35次，并在72℃下再培育反应物10分钟。使反应溶液经历2％琼脂糖凝胶电泳以分析反应产物。将具有正确分子量，即重链为约600bp(含非翻译区)和轻链为约500bp(含非翻译区)的产物连接到TA克隆载体(pJET)，且接着使用T7P引物测序以确定核苷酸序列。基于序列信息，通过ExPASY翻译工具将抗体序列翻译成蛋白质序列。由此得到的AB21 mAb序列包含具有互补决定区(CDR)的重链氨基酸序列和轻链序列，其是通过卡巴特(Kabat)等人,具有免疫学意义的蛋白质的序列(Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest),第五版,NIH出版社(NIH Publication)91-3242,马里兰州贝塞斯达(BethesdaMd).(1991),第1-3卷所公开的方法测定。

图9A描绘AB21 mAb的可变重链区/结构域氨基酸序列(SEQ ID NO:2)。指出框架区(FR1、FR2、FR3和FR4)和CDR(HCDR1(SEQ ID NO:4)、HCDR2(SEQ ID NO:5)和HCDR3(SEQ IDNO:6))。图9B描绘AB21 mAb的可变轻链区/结构域氨基酸序列(SEQ ID NO:3)。指出框架区(FR1、FR2、FR3和FR4)和CDR(LCDR1(SEQ ID NO:7)、LCDR2(SEQ ID NO:8)和LCDR3(SEQ IDNO:9))。

实例10.AB21 mAb的人类化

人类V区框架序列的选择

使用小鼠单克隆抗体AB21 mAb作为亲本抗体，根据Kabat定义的AB21 mAb CDR序列描述于图9A和9B(SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3)中。

对于人类化AB21 mAb IMGT，从IMGT数据库(International immunogeneticsInformation

如图9A中所示，改编自IMGT种类IGHV1-69-2*01人类重链框架区的Hu AB21 VH的框架序列(SEQ ID NO:10)与AB21 mAb中的所述序列有25个氨基酸差异(加下划线的残基)，此对应于30.48％(82个框架区中的总残基中的25个)变化。从IMGT鉴别出人类轻链框架(κI亚型：IGKV1-NL1*01)序列。如图9B中所示，Hu AB21 VL的序列(SEQ ID NO:14)与AB21 mAb中的序列有17个氨基酸差异(加下划线的残基)，此对应于22.36％(76个框架区中的总残基中的17个)变化。

回复突变

将CDR移植到框架上使得来自IMGT源的可变结构域(VH和VL)可能不具有最佳序列。因此，抗体的亲和力可能并非最佳的。实际上，初始人类化抗体(图11中的Hu-Hu)的K

人类化AB21 VHB1(SEQ ID NO:11)和AB21 VLB1(SEQ ID NO:15)分别含有7个和2个回复突变氨基酸。(参见图10以及图9A和9B)。

人类化重链Hu AB21 VHB2(SEQ ID NO:12)和Hu AB21 VHB3(SEQ ID NO:13)以及轻链Hu AB21 VLB2(SEQ ID NO:16))含有较多回复突变位点。这些变异体具有较少人类框架残基。(参见图10)。

实例11.人类化抗体的结合亲和力分析

为了确定在小鼠抗体人类化之后的亲和力变化，分别通过核苷酸合成方法直接产生人类化轻链和人类化重链的可变区。将小鼠可变区、人类化区和人类Fc嵌合体抗体表达载体pTCAE8-AB21引入宿主细胞中以制备表达重组抗体的细胞。使用Free Style

通过以下描述的方法制备含有人类IgG抗体的培养物上清液。使产抗体细胞适应Free Style

为了解个别抗体间的结合亲和力差异，使用ELISA方法。用1μg/ml CSF1R-ECD-hFc涂布ELISA板，接着添加从50nM到1×10

实例12.AB21 mAb对肿瘤生长的抑制作用

体内功效分析：在IL-6NOG小鼠(纽约州奥尔巴尼的塔康尼克生物科学公司(Taconic Biosciences,Albany,New York))的结肠直肠癌RKO异种移植模型中研究抗CSF-lR抗体的肿瘤生长抑制作用。由于抗人类CSF-1R抗体AB21无法识别小鼠CSF-1R，故使用移入人类PBMC的免疫缺陷小鼠IL-6NOG小鼠进行功效研究。

在皮下植入l×10

肿瘤生长分析显示于图13中。抗CSF-lR AB21 mAb(30mpk，每周一次)对RKO肿瘤生长的抑制作用类似于派姆单抗(5mpk，两周一次)的作用。抗CSF-lR AB21 mAb与抗PD-1抗体(派姆单抗)的组合的RKO肿瘤生长抑制作用在统计学上更有效，表明协同作用。这些结果清楚地显示，本发明的抗CSF-1R抗体将有效治疗CSF-1R介导的疾病，如癌症、或炎症性或免疫性疾病。CSF-1R介导的癌症包括多发性骨髓瘤、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、前列腺癌、乳癌、卵巢癌、黑色素瘤、多形性胶质母细胞瘤、骨巨细胞瘤、非小细胞肺癌、腱鞘巨细胞瘤、肾癌、向其它组织的肿瘤转移、骨髓纤维化和胃肠基质瘤。CSF-1R介导的炎症性或免疫性疾病是色素沉着绒毛结节性滑膜炎(PVNS)、骨质疏松症、炎症性关节炎或其它炎症性骨侵蚀。

已参照有限的实例描述本发明的实施例。所属领域的技术人员应理解，这些实例仅用于说明目的且不意图限制本发明的范围，且在不脱离本发明的范围的情况下，其它修改和变化均是可能的。因此，本发明的范围应仅受随附权利要求书限制。

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序列表

<110> 财团法人生物技术开发中心(Development Center for Biotechnology)

DCB-美国有限责任公司(DCB-USA LLC)

<120> 抗人类CSF-1R抗体和其用途

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<210> 1

<211> 512

<212> PRT

<213> 智人

<400> 1

Met Gly Pro Gly Val Leu Leu Leu Leu Leu Val Ala Thr Ala Trp His

1 5 10 15

Gly Gln Gly Ile Pro Val Ile Glu Pro Ser Val Pro Glu Leu Val Val

20 25 30

Lys Pro Gly Ala Thr Val Thr Leu Arg Cys Val Gly Asn Gly Ser Val

35 40 45

Glu Trp Asp Gly Pro Pro Ser Pro His Trp Thr Leu Tyr Ser Asp Gly

50 55 60

Ser Ser Ser Ile Leu Ser Thr Asn Asn Ala Thr Phe Gln Asn Thr Gly

65 70 75 80

Thr Tyr Arg Cys Thr Glu Pro Gly Asp Pro Leu Gly Gly Ser Ala Ala

85 90 95

Ile His Leu Tyr Val Lys Asp Pro Ala Arg Pro Trp Asn Val Leu Ala

100 105 110

Gln Glu Val Val Val Phe Glu Asp Gln Asp Ala Leu Leu Pro Cys Leu

115 120 125

Leu Thr Asp Pro Val Leu Glu Ala Gly Val Ser Leu Val Arg Val Arg

130 135 140

Gly Arg Pro Leu Met Arg His Thr Asn Tyr Ser Phe Ser Pro Trp His

145 150 155 160

Gly Phe Thr Ile His Arg Ala Lys Phe Ile Gln Ser Gln Asp Tyr Gln

165 170 175

Cys Ser Ala Leu Met Gly Gly Arg Lys Val Met Ser Ile Ser Ile Arg

180 185 190

Leu Lys Val Gln Lys Val Ile Pro Gly Pro Pro Ala Leu Thr Leu Val

195 200 205

Pro Ala Glu Leu Val Arg Ile Arg Gly Glu Ala Ala Gln Ile Val Cys

210 215 220

Ser Ala Ser Ser Val Asp Val Asn Phe Asp Val Phe Leu Gln His Asn

225 230 235 240

Asn Thr Lys Leu Ala Ile Pro Gln Gln Ser Asp Phe His Asn Asn Arg

245 250 255

Tyr Gln Lys Val Leu Thr Leu Asn Leu Asp Gln Val Asp Phe Gln His

260 265 270

Ala Gly Asn Tyr Ser Cys Val Ala Ser Asn Val Gln Gly Lys His Ser

275 280 285

Thr Ser Met Phe Phe Arg Val Val Glu Ser Ala Tyr Leu Asn Leu Ser

290 295 300

Ser Glu Gln Asn Leu Ile Gln Glu Val Thr Val Gly Glu Gly Leu Asn

305 310 315 320

Leu Lys Val Met Val Glu Ala Tyr Pro Gly Leu Gln Gly Phe Asn Trp

325 330 335

Thr Tyr Leu Gly Pro Phe Ser Asp His Gln Pro Glu Pro Lys Leu Ala

340 345 350

Asn Ala Thr Thr Lys Asp Thr Tyr Arg His Thr Phe Thr Leu Ser Leu

355 360 365

Pro Arg Leu Lys Pro Ser Glu Ala Gly Arg Tyr Ser Phe Leu Ala Arg

370 375 380

Asn Pro Gly Gly Trp Arg Ala Leu Thr Phe Glu Leu Thr Leu Arg Tyr

385 390 395 400

Pro Pro Glu Val Ser Val Ile Trp Thr Phe Ile Asn Gly Ser Gly Thr

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Leu Leu Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Pro Gln Pro Asn Val Thr Trp Leu

420 425 430

Gln Cys Ser Gly His Thr Asp Arg Cys Asp Glu Ala Gln Val Leu Gln

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Val Trp Asp Asp Pro Tyr Pro Glu Val Leu Ser Gln Glu Pro Phe His

450 455 460

Lys Val Thr Val Gln Ser Leu Leu Thr Val Glu Thr Leu Glu His Asn

465 470 475 480

Gln Thr Tyr Glu Cys Arg Ala His Asn Ser Val Gly Ser Gly Ser Trp

485 490 495

Ala Phe Ile Pro Ile Ser Ala Gly Ala His Thr His Pro Pro Asp Glu

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<210> 2

<211> 123

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 2

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Glu Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr

20 25 30

Asn Met Asn Trp Val Lys Gln Ser Asn Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Asn Ile Asp Pro Tyr Tyr Gly Gly Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Lys Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

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<210> 3

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<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 3

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Ser Ser Tyr Leu Ser Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gly Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Asp His Ile Asn Asn Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Ser Gly Ala Thr Ser Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Lys Asp Tyr Thr Leu Ser Ile Thr Ser Leu Gln Thr

65 70 75 80

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Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

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<212> PRT

<213> 小家鼠

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<212> PRT

<213> 小家鼠

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Gly

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<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 6

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<211> 11

<212> PRT

<213> 小家鼠

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<211> 7

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 8

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<211> 9

<212> PRT

<213> 小家鼠

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1 5

<210> 10

<211> 123

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 10

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr

20 25 30

Asn Met Asn Trp Val Gln Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Asn Ile Asp Pro Tyr Tyr Gly Gly Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

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100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 11

<211> 123

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 11

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr

20 25 30

Asn Met Asn Trp Val Gln Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Asn Ile Asp Pro Tyr Tyr Gly Gly Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe

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Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

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85 90 95

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<211> 123

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 12

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr

20 25 30

Asn Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Asn Ile Asp Pro Tyr Tyr Gly Gly Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe

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Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

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<210> 13

<211> 123

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 13

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr

20 25 30

Asn Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Asn Ile Asp Pro Tyr Tyr Gly Gly Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 14

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20 25 30

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65 70 75 80

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<210> 15

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 15

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1 5 10 15

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<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 16

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gly Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Asp His Ile Asn Asn Trp

20 25 30

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35 40 45

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50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

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<210> 17

<211> 6

<212> PRT

<213> 智人

<400> 17

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1 5

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 18

gcagcagatc caggggccag 20

<210> 19

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 19

gtggatagac agatgggg 18

<210> 20

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 20

gaaatcagac acaccagtg 19

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 21

gtgggagtgg acttgggctg 20

<210> 22

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<212> DNA

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<220>

<223> 合成

<400> 22

gatgtctttg gggtagaagt tgttc 25

<210> 23

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 23

ctgctcactg gatggtggga agatgg 26