血浆外泌体对AAAD伴肺损伤药物研制中应用

技术领域

本发明属于急性A型主动脉夹层合并急性肺损伤防治研究技术领域，具体涉及血浆外泌体hsa-miR-206和hsa-miR-485-5p对急性A型主动脉夹层合并急性肺损伤药物研制中的应用。

背景技术

急性A型主动脉夹层(TypeA acute aortic dissection,AAAD)是致命的心血管疾病，该病起病急、进展快、死亡率高，需要紧急手术治疗，而AAAD术前急性肺损伤(AcuteLung Injury,ALI)是严重影响手术结果的并发症之一。近年来，国内外研究显示，约50％的AAAD患者术前并发肺损伤和低氧血症，不仅延长患者术后机械通气、ICU停留时间以及住院时间，亦增加围手术期死亡率，严重影响患者预后。因此，探究AAAD术前ALI的发病机制、寻找防治ALI的干预措施、控制AAAD围手术期的高死亡率仍是全球心血管领域面临的重大临床热点与前沿问题。

目前认为，AAAD术前发生ALI的主要原因是主动脉内膜撕裂后，血管壁中层组织的细胞与细胞外基质广泛暴露于血液，导致炎症细胞聚集，释放大量的炎症因子和活性氧家族，形成瀑布式级联反应，通过循环直接和间接地破坏肺血管内皮细胞间连接，导致肺血管屏障功能障碍，渗透性增高，大量液体渗入间质和肺泡内，形成水肿，使肺泡上皮进一步受损，呼吸膜结构改变，最终形成ALI。然而，国内外关于AAAD合并ALI的研究多数仍停留在生物学标志物、危险因素等临床分析，缺乏对其发病机制的深入探讨，尤其是针对AAAD患者如何通过全身循环损伤肺组织、是否存在有效靶点进行干预等问题均未曾阐明。

近年来，外泌体(Exosomes，Exos)的发现结合其独特的细胞通讯方式，为许多疾病的诊断和治疗提供了新型机制和重要价值。外泌体是一类大小约30-100nm，具有脂质双层膜的囊状结构，它是细胞在生理或病理条件下，细胞膜向内凹陷释放的细胞外囊泡，可携带大量功能性的microRNA(miRNAs)，少量的mRNA、lncRNA以及特异性蛋白质等生物活性物质，通过精确的“打包”机制被释放到细胞外并选择性的与其他细胞质膜融合，实现细胞之间的物质交换和信号传导，参与机体多种生理、病理过程。其中，miRNAs作为外泌体中的重要内含物，约占外泌体内所有RNAs的41.72％。它是一类短链非编码RNAs，在外泌体的保护下可免受血液循环中酶的降解，形成相对较长和稳定的表达时间。miRNAs可通过外泌体靶向进入受体细胞，调控转录后水平的基因表达，参与细胞分化、生长等生命活动。最新研究发现，巨噬细胞来源的外泌体与腹主动脉瘤的形成有关；血管平滑肌细胞来源的外泌体可通过miRNAs参与胸主动脉瘤的发生发展；还有研究报道，循环中miR-15与miR-23在主动脉夹层患者中显著升高，可能是其潜在诊断靶点。然而，目前有关AAAD患者循环中外泌体的分泌和功能如何，其携带的功能性miRNAs是否在AAAD合并术前ALI中起作用等问题均不清楚。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一组干预AAAD合并ALI的潜在药物靶点，为AAAD合并ALI的防治提供参考数据。本发明发现AAAD合并ALI患者与AAAD不合并ALI患者血浆外泌体内hsa-miR-206和hsa-miR-485-5p表达存在显著差异，这两种miRNAs可成为AAAD继发ALI的潜在临床生物学标志物，对AAAD合并ALI的防治及药物研制有重要的临床应用价值；

为了达到上述技术目的，本发明是通过以下技术方案实现的：

血浆外泌体hsa-miR-206和hsa-miR-485-5p在防治AAAD合并ALI的药物研制中的应用；

优选的，所述AAAD合并ALI的防治是通过上调AAAD患者血浆外泌体内hsa-miR-206，并下调其hsa-miR-485-5p；

优选的，所述AAAD患者血浆外泌体内hsa-miR-206上调，达到抑制CX43蛋白的表达作用，降低内皮细胞通透性，从而改善肺血管内皮屏障功能障碍；

优选的，所述AAAD患者血浆外泌体内hsa-miR-485-5p下调，从而抑制炎症因子表达，达到改善肺血管内皮炎症反应的作用；

优选的，所述炎症因子包括：IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-8、MPO。

本发明的有益效果是：

本发明通过血浆外泌体miRNAs的高通量测序和RT-qPCR技术，联合筛选出具有临床生物标志物性质的血浆外泌体hsa-miR-206和hsa-miR-485-5p，以及上述miRNAs对AAAD合并ALI的作用机制，可将其应用于AAAD合并ALI防治的药物研制，为降低AAAD患者术前ALI的发生、增加患者手术机会及改善预后提供有力依据，具有重要临床转化价值。

附图说明

图1是血浆外泌体电镜(1A)、粒径分析(1B)和Western blot(WB)(1C)鉴定结果示意图；

图2是AAAD合并ALI患者与AAAD不合并ALI患者血浆外泌体差异表达的miRNAs。2A是miRNAs测序的表达量火山图；红色：上调，绿色：下调，Q(较正的P值)<0.05；2B是根据差异倍数、平均表达量选取Top 10的上、下调miRNAs的表达量聚类热图；红色：上调，蓝色：下调；Q<0.05；Non-ALI：AAAD不合并ALI患者；ALI：AAAD合并ALI患者；

图3是Top 10的上、下调miRNAs的靶基因功能与通路富集分析；图3A-C是miRNAs靶基因的Gene Ontology(GO)功能富集分析，p<0.05；3D是miRNAs靶基因的KyotoEncyclopedia ofGenes and Genomes(KEGG)通路富集分析；p<0.05；

图4是结合测序结果选取的10个候选血浆外泌体miRNAs在AAAD有无合并ALI患者中RT-qPCR验证结果(其中hsa-miRNA-181d-5p、hsa-miRNA-26b-3p因表达量过低，无法检测)；n＝20，*：p<0.05；**：p<0.01；Non-ALI：AAAD不合并ALI患者；ALI：AAAD合并ALI患者；

图5是血浆外泌体hsa-miR-485-5p和hsa-miR-206鉴别AAAD术前ALI的ROC曲线图；5A为血浆外泌体hsa-miR-485-5p鉴别AAAD术前发生ALI的ROC曲线图；曲线下面积(AUC)值为0.733(p＝0.012，95％CI：0.572-0.893)，cut-off值：0.925，敏感性：90％，特异性：55％；5B为血浆外泌体hsa-miR-206鉴别AAAD术前发生ALI的ROC曲线图；曲线下面积(AUC)值分别为0.778(p＝0.003，95％CI：0.626-0.929)，cut-off值：0.985，敏感性：70％，特异性：80％；

图6是AAAD患者血浆外泌体与人肺微血管内皮细胞(hPMVECs)共培养后，炎症因子(6A-D，6F)与抗炎症因子(6E)表达水平；n＝15，Control：健康正常人；Non-ALI：AAAD不合并ALI患者；ALI：AAAD合并ALI患者；

图7是AAAD患者血浆外泌体与hPMVECs共培养后，CX43蛋白表达水平；n＝10，Control：健康正常人；Non-ALI：AAAD不合并ALI患者；ALI：AAAD合并ALI患者。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

在临床AAAD合并ALI的患者中验证外泌体携带hsa-miR-206和hsa-miR-485-5p的生物标志物作用；

1、临床收集病例及基础资料：本研究获得中南大学湘雅医院伦理委员会批准，按照知情同意原则进行。按以下标准收集病例：1)入选对象：收集起病时间2周以内，通过我院主动脉CTA确诊的StanfordA型主动脉夹层患者的血浆标本，按照术前是否合并ALI分成两组，即AAAD合并ALI组与AAADALI组；根据2006年《急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征诊断和治疗指南》，急性肺损伤诊断标准为：①急性起病(1周内)；②氧合指数(PaO2/FiO2)≤300mmHg(1mmHg＝0.133kPa)[不管呼气末正压通气(PEEP)水平]；③胸部正位片显示双肺均有斑片状阴影；④肺动脉嵌顿压≤18mmHg，或无左心房压力增高的临床证据；2)排除标准：①年龄＞80岁；②既往有冠心病、心脏瓣膜病、心肌病、心包疾病、肺源性心脏病、心律失常、糖尿病病史；③既往有慢性肺部疾病、慢性肝肾疾病、风湿免疫性疾病或肿瘤病史；④近2周内有创伤史或手术史；⑤入院前使用过甾体或非甾体类消炎药；⑥未签署知情同意书。3)所有纳入患者年龄均应＞18岁，男女数量均等，知情告知并签署知情同意书。4)所有纳入患者均进行三大常规、ECG、肝肾功能、心肌酶、肌钙蛋白、电解质、血脂、血糖、炎症因子四项、CRP、心脏彩超、肺部CT等检查。5)临床基本资料收集包括年龄、性别、身高、体重、是否吸烟、是否饮酒、高血压、糖尿病、马凡综合征、手术相关资料及预后资料。

2、临床患者血浆标本采集：收集入组者肘前静脉血10ml，置于含有2％乙二胺四乙酸的一次性真空管中，将全血样品于4℃条件下以3000r/min转速离心10min，用移液枪吸取上清液血浆转移到新的离心管中，将血浆在4℃以12000r/min离心10min去除黏附在细胞残片上的细胞核酸，吸取上清液即为血浆。

3、差速超速离心法分离血浆外泌体：提取血浆后用PBS缓冲液按1:5-10倍稀释，用0.22μm滤器过滤大分子杂质后将过滤液移取至超速离心管中，120,000g，4℃离心90min。弃上清后加弃去上清液后加入预冷PBS重悬沉淀，重复上述120,000g，4℃离心90min，弃上清。用50-200μl PBS重悬沉淀，并转移到1.5ml离心管中，于-80℃保存待用。

4、透射电子显微镜鉴定外泌体形态及大小：利用磷钨酸对外泌体进行负染色，通过使用透射电镜观察血浆外泌体的大小及形状。将血浆外泌体标本从-80℃冰箱中取出后，室温下解冻。吸取10μl外泌体标本滴于200目铜网上，2min后用滤纸从铜网边缘吸去多余的液体。滴加20μl磷钨酸(3％,pH 7.0)于铜网，2min后用滤纸从铜网边缘吸去多余染液，滴加超纯水于铜网上，用滤纸从铜网边缘吸去多余水分，晾干的铜网放置于透射电镜中进行观察外泌体的大小及形状，并进行拍照。如图1A所示为电子显微镜下外泌体形态图片。

5、Zetaview纳米颗粒跟踪分析仪测外泌体浓度和粒径以及WB检测外泌体特异性标志物CD63、TSG101：通过ZetaView PMX 100及检测分析软件ZetaView 8.04.02对分离得到的外泌体样本进行纳米颗粒跟踪分析；提取分离外泌体样本，并用1ml PBS稀释后，缓慢注射外泌体溶液以避免气泡，将样品池置于仪器中，根据标准操作程序操作，如图1B所示为外泌体粒径分布图；应用WB检测外泌体特异性标志物，如1C为WB检测外泌体特异性标记蛋白(Calnexin，TSG101,CD63)。

6、外泌体miRNAs测序及表达差异分析：差速超速离心法分离得到的外泌体送华大基因，建立小RNA文库，利用BGISEQ-500测序平台进行小RNA高通量测序。首先用RNA试剂盒提取外泌体RNA，Agilent2000检测RNA质量，将总RNA使用PAGE电泳切胶分离18-30nt的小RNA，使用5’-adenylated，3’-blocked的单链DNA接头连接到RNA的3’端。经过退火、5’接头连接，合成一链cDNA。使用高敏聚合酶对cDNA进行扩增，富集同时连接有3’接头和5’接头的cDNA，放大文库产量。使用PAGE电泳分离100-120bp范围PCR产物，文库定量及pooling环化。高通量测序所得49nt序列，讲清理后的目标序列分类注释，获得样品中包括的各组分及表达量信息。将所有小RNA片段注释后，用剩下的未注释片段来进行novel miRNAs的预测。最后选取差异在1.5以上且Q值小于0.05的miRNAs，认为是显著的差异表达miRNAs，如图2A所示，AAAD有无合并ALI患者血浆外泌体的miRNAs表达存在显著差异，有283个差异分子。根据结果使用R软件中的pheatmap函数进行层次聚类分析，如图2B所示，根据差异倍数、样本表达量等选取差异排名前10的上、下调miRNAs分子。

表1：用于血浆外泌体miRNAs测序的AAAD和AAAD+ALI患者基线资料比较

AAAD：单纯急性A型主动脉夹层患者；AAAD+ALI：急性A型主动脉夹层合并急性肺损伤患者；BMI：体重指数；SBP：收缩压；DBP：舒张压；WBC：白细胞计数；OI：氧合指数；LVEF：左心室射血分数；

表2根据差异倍数、Q值以及miRNAs在2组样本中的表达量，选取Top10的下、上调差异miRNAs分子进行后续分析

7、miRNA测序结果生物信息学分析：使用miRanda、miRDB和targetscan等软件对筛选出的miRNAs的靶基因进行预测，使用R包clusterProfiler对靶基因进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，通过统计分析计算其中最为显著的靶基因。P<0.05作为显著靶基因的阈值。如图3(A-D)所示，AAAD合并与不合并ALI患者血浆外泌体差异的miRNAs的靶基因主要富集于缺氧反应、急性炎症反应、免疫效应、细胞连接、细胞骨架等通路和基因功能中。

8、血浆外泌体miRNAs提取：按Qiagen血浆外泌体miRNA提取试剂盒操作，并添加cel-miR-39作为后续相对定量检测的外参。

9、RT-qPCR验证：按上述血浆外泌体miRNAs提取方法提取miRNA，使用Sigma公司的MystiCqTM microRNA cDNA Synthesis Mix试剂盒，通过Poly(A)聚合酶给miRNA加尾，进行逆转录。然后在加尾反应产物中配置cDNA合成体系，混匀离心，42℃20min，85℃5min，合成得到miRNA的cDNA。通过microRNADatabase查找miRNA的序列并设计合成miRNA扩增引物，并按试剂盒要求，配置20μl qPCR反应体系，使用PCR仪进行PCR扩增反应，通过3个复孔计算平均Ct值，以cel-miR-39为外参进行归一化处理，用2

表3应用RT-qPCR验证的AAAD和AAAD+ALI组患者基线资料比较

AAAD：单纯急性A型主动脉夹层患者；AAAD+ALI：急性A型主动脉夹层合并急性肺损伤患者；BMI：体重指数；SBP：收缩压；DBP：舒张压；WBC：白细胞计数；OI：氧合指数；LVEF：左心室射血分数；

表4通过表达量、保守性、组间差异及文献检索，筛选出的10个用于RT-qPCR验证的血浆外泌体候选miRNAs(其中上调5个，下调5个)

10、临床诊断模型构建以及评估：按照纳入排除标准收集AAAD有无合并ALI患者的人口统计学资料、临床数据，根据目标血浆外泌体miRNAs(hsa-miR-206、hsa-miR-485-5p)相对表达量，按7:3随机把病例分成建模队列以及验证队列；分别对建模队列以及验证队列进行：①进行单因素连续变量分析确定目标miRNAs是急性肺损伤的独立预测因子；②构建Logistic回归模型并进行ROC曲线构建，根据约登指数设定Cut-off值；并且计算AUC值确定miR-101-3p的预测效力(0.5-0.7：预测效力低；0.7-0.9：预测效力中等；>0.9：预测效力高)；③计算C-指数评价目标miRNA预测效力(0.5-0.7：预测效力低；0.7-0.9：预测效力中等；>0.9：预测效力高)。④绘制校准曲线以及决策分析曲线以分析目标miRNAs对AAAD合并ALI的预测与临床预测的符合程度以及该指标诊断的获益程度。同时，结合人口统计学指标，血常规生化指标进行多因素logistics回归分析并选取其中P<0.05的指标进行临床预测模型的构建并同时进行ROC曲线，C-指数，校准曲线以及决策分析曲线的绘制和比较。所有的统计分析通过SPSS 25.0以及R 3.5.3进行。如图5所示，图5A为血浆外泌体hsa-miR-485-5p鉴别AAAD术前发生ALI，界限值为0.925，鉴别的诊断价值为中等，敏感性为90％，特异性为55％；5B为血浆外泌体hsa-miR-206鉴别AAAD术前发生ALI，界限值为0.985，鉴别的诊断价值为中等，敏感性：70％，特异性：80％。logistic回归分析显示hsa-miR-485-5p、hsa-miR-206与AAAD发生ALI独立相关。

表5单因素、多因素logistic回归分析

单因素、多因素logistic回归分析显示hsa-miR-485-5p是AAAD术前发生ALI的独立危险因素，hsa-miR-206是AAAD术前发生ALI的独立保护因素。多因素分析调整的变量：年龄、性别、吸烟、白细胞计数、C反应蛋白、α肿瘤坏死因子、白介素-6。

实施例2

通过AAAD合并ALI患者血浆外泌体与hPMVECs共培养，检测炎症因子和CX43蛋白水平表达

1)成功提取健康正常人、AAAD不合并ALI患者、AAAD合并ALI患者血浆外泌体；

2)将各组血浆外泌体与hPMVECs共培养，RT-qPCR检测细胞炎症因子IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α、MPO和抗炎因子IL-10，WB检测CX43蛋白表达水平。如图6所示，将各组提取后的血浆外泌体(100ug/ml)与hPMVECs共培养24h后，提取处理后细胞内总RNA进行RT-qPCR，检测炎症因子(6A-D，6F)与抗炎因子(6E)表达。Control：健康正常人群；Non-ALI：单纯急性A型主动脉夹层患者；ALI：急性A型主动脉夹层合并急性肺损伤患者；n＝15；*:P<0.05；**:P<0.01。如图7所示，将各组提取后的血浆外泌体(100ug/ml)与hPMVECs共培养24h后，提取处理后细胞内总蛋白进行WB，检测CX43蛋白表达。Control：健康正常人群；Non-ALI：单纯急性A型主动脉夹层患者；ALI：急性A型主动脉夹层合并急性肺损伤患者；n＝10；*:P<0.05；**:P<0.01。