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一种NphB突变体及其应用

文献发布时间：2023-06-19 16:11:11

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种NphB突变体、一种大麻萜酚酸的制备方法以及NphB突变体在制备大麻萜酚酸中的用途。

背景技术

大麻素是一类具有多种生物活性的化合物，可分为三类：(1)内源性大麻素，天然存在于人体，并且可以在人体中产生；(2)植物大麻素，仅存在于大麻植物中；(3)实验室合成大麻素。大麻素已显示出具有若干有益的医学/治疗作用，因此，大麻素是制药工业研究的活跃领域，可用作各种不同疾病的药物产品。

目前已知的植物大麻素超过了80种，主要包括四氢大麻酚(THC，致幻成瘾成分)、大麻二酚(CBD，非精神成分活性)、大麻环萜酚(CBC)、大麻酚 (CBN)、大麻萜酚(CBG)等。

大麻素由酸性大麻素在加热或长期储存条件下脱羧形成，如四氢大麻酚酸(THCA)形成THC、大麻二酚酸(CBDA)形成CBD和大麻环萜酚酸(CBCA) 形成CBC。而CBGA是通过氧化环化酶转化为酸性大麻素如THCA、CBDA 或CBCA的分支点中间体，反应路径如下，因此CBGA对THC、CBD、CBC的生产至关重要。

现有技术中多以橄榄酸和香叶基二磷酸(Gpp)经芳香族异戊二烯基转移酶(Aromatic prenyltransferase，PTase)催化的酶促方法合成CBGA，如萨斯喀彻温大学在专利US20150128301A1中公开的来自大麻的芳香族异戊二烯基转移酶，该酶被命名为CsPT1(Cannabis sativa prenyltransferase 1)。另外， LIBREDE在US20200017889A1中，也将CsPT1或其相似的基因插入酵母 (S.cerevisiae)中，从而将橄榄酸转化为CBGA。

中国专利CN110892075A也公开了一种在遗传修饰的酵母中生产大麻素的方法，其酵母中含有来自链霉属菌种CL190菌株的NphB (hydroxynaphthalene PTase)(即野生型NphB)(Bonitz等，PLos ONE，2011， 6(11)，e27336；Kuzuyama等，2005，Nature，435，983-987；Zirpel等，Journal of Biotechnology 259(2017)，204-212)或是其突变体Q161A的可溶性芳族异戊二烯基转移酶。NphB(Q161A)与野生型NphB相比能产生更多的 CBGA(Muntendam 2015)。德国专利DE102018117233A1则公布了将编码修饰的NphB突变体的基因导入宿主生物体并表达生产CBGA的方法。其中经过修饰的NphB突变体(Q295F和Q295H)相对于野生型NphB(此专利文献中SEQ ID NO:2)CBGA的合成量显著提高，CBGA相对于2-O-香叶基橄榄酸提高了20倍。

然而现有技术中的芳香族异戊二烯基转移酶酶活仍然还有待提高，以产生尽可能大量的CBGA。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种改进的芳香族异戊二烯基转移酶，具体为一种改进的NphB酶，以提高CBGA的产量。

本发明的第一方面提供一种NphB芳族异戊二烯基转移酶的突变体所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:11所示。

较佳地，编码所述突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO:10或SEQ ID NO: 12所示。

本发明的第二方面提供一种分离的核酸，其编码本发明第一方面所述的突变体。

本发明第三方面提供一种重组表达载体，其包含本发明第二方面所述的分离的核酸；所述重组表达载体优选pET28a质粒。

本发明第四方面提供一种转化体，其含有本发明第二方面所述的分离的核酸，或本发明第三方面所述的重组表达载体；所述转化体构建时使用的宿主优选为大肠杆菌，例如E.coli BL21(DE3)。

本发明第五方面提供一种制备本发明第一方面所述的突变体的方法，其包括培养本发明第四方面所述的转化体获得发酵产物，并从发酵产物中获得所述突变体；

所述方法优选地还包括纯化所述突变体的步骤；

所述方法更优选地使用Ni柱对所述突变体进行纯化。

本发明第六方面提供一种大麻萜酚酸的制备方法，其包括以下步骤：在反应体系中，利用本发明第一方面所述的突变体催化香叶基焦磷酸和橄榄醇酸生成大麻萜酚酸。

较佳地，所述反应体系包括1mM～10mM的香叶基焦磷酸，优选2.5mM 或5mM；2mM～20mM的橄榄醇酸，优选5mM或10mM。

在某一较佳实施例中，所述突变体的终浓度为0.5g/mL～1.5g/mL，优选 1g/mL；

所述反应体系中包括1mM～10mM的MgCl

所述反应体系的pH为7.5～8.5，优选为8.0；

所述催化在30～40℃下进行，优选30℃；

所述催化的时间为1～6小时。

本发明第六方面提供本发明第一方面所述的突变体、本发明第二方面所述的分离的核酸、本发明第三方面所述的重组表达载体或者本发明第四方面所述的转化体在制备大麻萜酚酸或大麻素的应用。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：提高芳香族异戊二烯基转移酶的酶活，同时提升CBGA的产量。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

本发明中的实验方法如无特别说明均为常规方法，基因克隆操作具体可参考J.萨姆布鲁克等编的《分子克隆实验指南》。

本发明中的氨基酸简写符号如无特殊说明均为本领域常规，具体简写符号对应的氨基酸如表1所示。

表1

所述氨基酸对应的密码子也为本领域常规，具体氨基酸与密码子的对应关系如表2所示。

表2

质粒pBAD购买自Novagen公司；DpnI酶、NdeI酶、HindIII酶购买自 Thermo Fisher公司；ExnaseⅡ酶购自南京诺唯赞生物科技有限公司；E.coli BL21(DE3)感受态细胞购买自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；橄榄醇酸(OA)由实验室合成；香叶基焦磷酸(GPP)购自sigma；质粒提取试剂盒购买自生工生物工程(上海)股份有限公司。

HPLC检测方法：色谱柱：Agilent Eclipse plus C18(3.5μm，150×4.6mm)；流动相：0.1％TF水溶液为流动相A，0.1％TFA乙腈溶液为流动相B；梯度洗脱：90％A+10％B(0min)，100％B(10min)，100％B(11min)，90％A+10％B (11.5min)，90％A+10％B(16min)；检测波长：210nm/254nm；流速：1mL/min；进样体积：10μL；柱温：30℃。

实施例1NphB突变体的构建

针对序列表中野生型NphB的SEQ ID NO:1的第49、286、288位点进行点突变的突变体文库构建所设计的引物序列如表3所示，其组合突变可通过表中引物的组合扩增获得。

表3

根据序列表中SEQ ID NO:1的序列合成NphB基因，基因合成公司为苏州金唯智生物科技有限公司(苏州工业园区星湖街218号生物纳米科技园C3楼)完成，SEQ ID NO:1编码的NphB的PDB号为1ZB6。然后以NdeI 和HindIII酶切位点引入质粒pET28a，构建质粒pET28a-NphB。以质粒 pET28a-NphB为模板，进行PCR扩增目的条带。

PCR扩增体系为：

PCR扩增程序如下：

对PCR产物进行DpnI消化，37℃，2hr。反应完成转化至E.coli BL21 (DE3)感受态细胞，涂布在含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基，37℃培养过夜，收菌，得到包含不同突变体的转化子。

实施例2NphB突变体的表达

将含有突变体基因的工程菌在经平皿划线活化后，挑单菌落接种至含50 μg/ml卡那霉素的5ml LB液体培养基中，37℃震荡培养12h。按2v/v％接种量转接至50ml同样含50μg/ml卡那霉素的新鲜LB液体培养基中，37℃震荡培养至OD600达到0.8左右时，加入IPTG至其终浓度为0.1mM，25℃诱导培养16h。培养结束后，将培养液10000rpm离心10min，弃上清液，收集菌体。

实施例3NphB突变体的纯化

将上述每个突变体的菌泥均用0.1M pH 8.0磷酸缓冲液(含150mM NaCl) 洗涤两次，之后按照菌泥:缓冲液＝1:5的比例在低温高压下均质破碎，破碎液离心去除沉淀，得到的上清液为含各重组酶的粗酶液。随后用Ni柱对粗酶液进行纯化。用Bradford法测定蛋白浓度，并将其分装于2mL离心管后保存于-80℃冰箱。

实施例4NphB突变体的活性测定

酶活的测定采用如下方法进行。反应体系中加入终浓度为2.5mM香叶基焦磷酸(GPP)、5mM橄榄醇酸(OA)、5mM MgCl

单位酶活的定义：在特定反应条件(30℃)下，每分钟生成1μmoL CBGA 所需要的酶量。

酶活提高倍数：突变体酶活与野生型酶活的比值。

表4

“/”处的序列可以从SEQ ID NO:1～20中推导出。

实施例5酶催化合成CBGA

酶催化体系采用如下方法进行。反应体系中加入终浓度为5mM香叶基焦磷酸(GPP)、10mM橄榄醇酸(OA)、5mM MgCl

SEQUENCE LISTING

<110> 弈柯莱生物科技（上海）股份有限公司

<120> 一种NphB突变体及其应用

<130> P20017665C

<160> 30

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 307

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 野生型NphB序列

<400> 1

Met Ser Glu Ala Ala Asp Val Glu Arg Val Tyr Ala Ala Met Glu Glu

1 5 10 15

Ala Ala Gly Leu Leu Gly Val Ala Cys Ala Arg Asp Lys Ile Tyr Pro

20 25 30

Leu Leu Ser Thr Phe Gln Asp Thr Leu Val Glu Gly Gly Ser Val Val

35 40 45

Val Phe Ser Met Ala Ser Gly Arg His Ser Thr Glu Leu Asp Phe Ser

50 55 60

Ile Ser Val Pro Thr Ser His Gly Asp Pro Tyr Ala Thr Val Val Glu

65 70 75 80

Lys Gly Leu Phe Pro Ala Thr Gly His Pro Val Asp Asp Leu Leu Ala

85 90 95

Asp Thr Gln Lys His Leu Pro Val Ser Met Phe Ala Ile Asp Gly Glu

100 105 110

Val Thr Gly Gly Phe Lys Lys Thr Tyr Ala Phe Phe Pro Thr Asp Asn

115 120 125

Met Pro Gly Val Ala Glu Leu Ser Ala Ile Pro Ser Met Pro Pro Ala

130 135 140

Val Ala Glu Asn Ala Glu Leu Phe Ala Arg Tyr Gly Leu Asp Lys Val

145 150 155 160

Gln Met Thr Ser Met Asp Tyr Lys Lys Arg Gln Val Asn Leu Tyr Phe

165 170 175

Ser Glu Leu Ser Ala Gln Thr Leu Glu Ala Glu Ser Val Leu Ala Leu

180 185 190

Val Arg Glu Leu Gly Leu His Val Pro Asn Glu Leu Gly Leu Lys Phe

195 200 205

Cys Lys Arg Ser Phe Ser Val Tyr Pro Thr Leu Asn Trp Glu Thr Gly

210 215 220

Lys Ile Asp Arg Leu Cys Phe Ala Val Ile Ser Asn Asp Pro Thr Leu

225 230 235 240

Val Pro Ser Ser Asp Glu Gly Asp Ile Glu Lys Phe His Asn Tyr Ala

245 250 255

Thr Lys Ala Pro Tyr Ala Tyr Val Gly Glu Lys Arg Thr Leu Val Tyr

260 265 270

Gly Leu Thr Leu Ser Pro Lys Glu Glu Tyr Tyr Lys Leu Gly Ala Tyr

275 280 285

Tyr His Ile Thr Asp Val Gln Arg Gly Leu Leu Lys Ala Phe Asp Ser

290 295 300

Leu Glu Asp

305

<210> 2

<211> 924

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 野生型NphB序列

<400> 2

atgtctgaag ctgctgatgt tgaaagagtt tacgctgcta tggaagaagc tgctggtttg 60

ttgggtgttg cttgtgctag agataagatc tacccattgt tgtctacttt tcaagatact 120

ttggttgaag gtggttctgt tgttgttttt agtatggctt ctggtagaca ttctactgaa 180

ttggattttt ctatttctgt tccaacttct catggtgacc catacgctac tgttgttgaa 240

aagggtttgt ttccagctac tggtcatcca gttgatgatt tgttggctga tactcaaaag 300

catttgccag tttctatgtt tgctatcgat ggtgaagtta caggtggttt taagaaaact 360

tacgctttct tcccaactga taacatgcca ggtgttgctg aattgtctgc tattccatct 420

atgccaccag ctgtcgctga aaacgctgaa ttgtttgcta gatacggttt ggataaggtt 480

caaatgactt ctatggatta caaaaagaga caagtcaact tgtacttttc tgaattgtct 540

gctcaaactt tggaagctga atctgtcttg gctttggtta gagaattggg tttgcatgtt 600

ccaaacgaat tgggtttgaa gttttgtaag agatcctttt cagtgtaccc tactttgaac 660

tgggaaactg gtaaaattga tagattgtgt tttgctgtta tttctaatga tccaactttg 720

gttccatctt ctgatgaagg tgacattgaa aagtttcata actacgctac taaggctcca 780

tacgcttacg ttggtgaaaa gagaactttg gtttacggtt tgactttgtc tccaaaggaa 840

gaatactaca agttgggtgc ttactaccat attactgatg ttcaaagagg tttgttgaag 900

gcttttgatt ctttggaaga ttaa 924

<210> 3

<211> 307

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> G286S/Y288A序列

<400> 3

Met Ser Glu Ala Ala Asp Val Glu Arg Val Tyr Ala Ala Met Glu Glu

1 5 10 15

Ala Ala Gly Leu Leu Gly Val Ala Cys Ala Arg Asp Lys Ile Tyr Pro

20 25 30

Leu Leu Ser Thr Phe Gln Asp Thr Leu Val Glu Gly Gly Ser Val Val

35 40 45

Val Phe Ser Met Ala Ser Gly Arg His Ser Thr Glu Leu Asp Phe Ser

50 55 60

Ile Ser Val Pro Thr Ser His Gly Asp Pro Tyr Ala Thr Val Val Glu

65 70 75 80

Lys Gly Leu Phe Pro Ala Thr Gly His Pro Val Asp Asp Leu Leu Ala

85 90 95

Asp Thr Gln Lys His Leu Pro Val Ser Met Phe Ala Ile Asp Gly Glu

100 105 110

Val Thr Gly Gly Phe Lys Lys Thr Tyr Ala Phe Phe Pro Thr Asp Asn

115 120 125

Met Pro Gly Val Ala Glu Leu Ser Ala Ile Pro Ser Met Pro Pro Ala

130 135 140

Val Ala Glu Asn Ala Glu Leu Phe Ala Arg Tyr Gly Leu Asp Lys Val

145 150 155 160

Gln Met Thr Ser Met Asp Tyr Lys Lys Arg Gln Val Asn Leu Tyr Phe

165 170 175

Ser Glu Leu Ser Ala Gln Thr Leu Glu Ala Glu Ser Val Leu Ala Leu

180 185 190

Val Arg Glu Leu Gly Leu His Val Pro Asn Glu Leu Gly Leu Lys Phe

195 200 205

Cys Lys Arg Ser Phe Ser Val Tyr Pro Thr Leu Asn Trp Glu Thr Gly

210 215 220

Lys Ile Asp Arg Leu Cys Phe Ala Val Ile Ser Asn Asp Pro Thr Leu

225 230 235 240

Val Pro Ser Ser Asp Glu Gly Asp Ile Glu Lys Phe His Asn Tyr Ala

245 250 255

Thr Lys Ala Pro Tyr Ala Tyr Val Gly Glu Lys Arg Thr Leu Val Tyr

260 265 270

Gly Leu Thr Leu Ser Pro Lys Glu Glu Tyr Tyr Lys Leu Ser Ala Ala

275 280 285

Tyr His Ile Thr Asp Val Gln Arg Gly Leu Leu Lys Ala Phe Asp Ser

290 295 300

Leu Glu Asp

305

<210> 4

<211> 924

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> G286S/Y288A序列

<400> 4