SlEXP1和SlCEL2基因在改善番茄果实贮运性中的应用

技术领域

本发明属于生物技术和基因工程领域，涉及SlEXP1和SlCEL2基因在改善番茄果实贮运性中的应用，即SlEXP1和SlCEL2双突变体及协同作用提高番茄果实硬度，延缓软化进程，在改善番茄果实贮运性中应用。

技术背景

果实成熟后质地变化，主要有软化和木质化两大类。番茄果实是典型的软化类型，由于其遗传转化体系完善，被作为模式果实被广泛研究。番茄软化主要由初生壁松弛和降解导致。目前认为伸展蛋白(Expansine，EXP)是位于细胞壁上的松弛蛋白，不具有酶活性，EXP蛋白通过破坏纤维丝与木葡聚糖之间非共价键从而导致细胞壁结构松弛，帮助细胞壁降解酶，接近底物并最终水解细胞壁，导致果实软化。近30年来，果实软化研究多集中于初生细胞壁松弛和降解相关蛋白和酶的关键编码基因，包括SlEXP1、SlPME2、SlPG2a、SlPL、SlTBG4、SlEXP1、SlXTH5、SlCEL2等都展开了转基因验证，除了SlPL外，其他基因与果实软化的关系仍存在较大的未知性，敲除单一降解酶编码基因并不能有效减缓果实软化速率和改善贮运性。因此同时敲除两个及以上具有协同催化作用的细胞壁代谢关键基因，在获得耐贮运新种质材料方面具有很好的应用前景。关于SlEXP1和SlCEL2双敲突变体提高番茄果实硬度的尝试未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供SlEXP1和SlCEL2基因在改善番茄果实贮运性中的应用，本发明根据SlEXP1和SlCEL2核苷酸序列分别设计引导RNA，插入CDC45-1300载体，电转到农杆菌EHA101，对番茄子叶进行侵染转化，从而获得SlEXP1和SlCEL2定向转基因番茄突变体。所述SlEXP1的sgRNAs序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，所述SlCEL2的sgRNAs序列如SEQID NO.3和SEQ ID NO.4所示。gRNAs根据SlEXP1(SEQ ID NO.5)和SlCEL2(SEQ ID NO.6)核苷酸序列设计。

本发明同时对SlEXP1和SlCEL2基因编辑，获得的双突变体能提高番茄果实硬度，进而改善番茄果实贮运性。

本发明提供了SlEXP1和SlCEL2双突变体ec和单突变体exp1、cel2的核苷酸序列靶点突变情况。

本发明提供了双突变体ec中SlEXP1和SlCEL2功能丧失的被截短的氨基酸序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示。

本发明提供了单突变体exp1中SlEXP1功能丧失的被截短的氨基酸序列如SEQ IDNO.9所示和单突变体cel2中SlCEL2功能丧失的被截短的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示。

本发明提供了重组载体(CDC45-1300)的构建方法，将SlEXP1和SlCEL2的gRNA融合构建到CDC45-1300载体。

本发明利用农杆菌侵染法将重组质粒转化到番茄，得到SlEXP1和SlCEL2定向突变后的番茄果实，并进行性状分析。

本发明通过对两个关键的细胞壁基因SlEXP1和SlCEL2进行基因编辑，当单独突变SlEXP1和SlCEL2果实硬度与对照果实比较不存在显著性差异。当同时敲除SlEXP1和SlCEL2获得高硬度果实，整果挤压试验显示破色阶段硬度提高57％、红果阶段硬度提高62％，果皮刺穿试验显示破色阶段硬度提高96％、红果阶段硬度提高71％，采后货架显示同时敲除SlEXP1和SlCEL2的双敲突变体可至少维持2周，表明果实硬度的改变需要多个细胞壁基因协同展开，获得高硬度果实改善贮运性，多基因定向突变是一个策略。

附图说明

图1.SlEXP1和SlCEL2在果实不同组织中表达相关性分析，二者存在共表达关系。

图2.SlEXP1和SlCEL2突变体核苷酸序列上靶点编辑情况，(A)为插入碱基，----为缺失碱基。

图3.SlEXP1和SlCEL2突变体番茄果实硬度分析。

图4.SlEXP1和SlCEL2突变体番茄果实采后货架期硬度分析。

具体实施方案

本发明结合附图和实施例作进一步的说明。

实施例一

1.植物材料

本方案植物材料为番茄AC(Ailsa Craig)，种植于浙江大学植物工厂，条件为16h光照(26～29℃)、8h黑暗(17～22℃)。

2.重组载体构建

通过在线软件工具http://crispr.hzau.edu.cn/cgi-bin/CRISPR2/SCORE，分别在SlEXP1(Solyc06g051800)和SlCEL2(Solyc09g010210)基因序列外显子上选取高分小向导RNA(small guide RNA,sgRNA)，并将sgRNA序列以及它的反向互补序列装融合。

sgRNA序列：

SlEXP1-sgRNA1：

5’-GATTGGCACATGCTACATTTTACGG-3’(SEQ ID NO.1)

3’-CCCGTAAAATGTAGCATGTGCCAAA-5’(SEQ ID NO.2)

SlCEL2-sgRNA2：

5’-GATTGAGAGACTCCGCATTACACGA-3’(SEQ ID NO.3)

3’-CTCGTGTAATGCGGAGTCTCTCAAA-5’(SEQ ID NO.4)

将sgRNA1和sgRNA2分别连接到U6-T和U3-T载体，测序验证成功连接的质粒作为模板分别用引物U6-T FP/U6-T RP和U3-T FP/U3-T RP进行扩增。

引物序列：

U6-T FP:ACGACGGCCAGTGCCAAGCTTCATTCGGAGTTTTTG(SEQ ID NO.11)

U6-T RP:CATCACAGGCTCGAGCTCGAGCCATTTGTCTGCAG(SEQ ID NO.12)

U3-T FP:GACAAATGGCTCGAGCTCGAGCCTGTGATGGATAAC(SEQ ID NO.13)

U3-T RP:CTTTATCATCAGGAGCCCGGGAGCTCCATTTGTC(SEQ ID NO.14)

U6和U3PCR扩增产物1:1连接后作为模板用U6T-FP/U3T-RP进行PCR扩增，产物与CRISPR载体CDC45-1300(HindIII/XmaI双酶切)按照3:1过夜连接后转化，筛选阳性克隆。构建成功的质粒，电转至EHA101农杆菌感受态，通过子叶侵染法进行遗传转化以获得转基因番茄突变体。该方法将2个基因的sgRNA同时构建到一个载体，因此仅需要一次遗传转化，即可获得单敲和双敲突变体。

3.番茄遗传转化

番茄种子用自来水浸泡摇种后消毒清洗，接种于1/2MS培养基(MS+1％sucrose+0.8％agar+100mg/L Inositol)；25℃黑暗条件下培养3d左右至生根，转入光照培养室(25℃，16h光照/8h黑暗)。将无菌苗的子叶用手术刀切下，叶背朝上置于贴好滤纸的KCMS培养基(MS+3％sucrose+0.8％agar+100mg/L Inositol+100uM Acetosyringon)中预培养1d(避光，过夜)。将子叶外植体刮取转移到培养皿中，然后倒入培养好的农杆菌菌液(OD600≈1.0)侵染；2-3min后将子叶转移到无菌滤纸上，吸干残留的菌液；叶背朝上回接到KCMS培养基上。共培养2d(避光)后，将外植体小心的转入2Z培养基(MS+3％sucrose+0.8％agar+2mg/LZeatin+320mg/L Timentin+3mg/L Hygromycin)；培养2～3周后转入0.2Z培养基(MS+3％sucrose+0.8％agar+0.2mg/L Zeatin+320mg/L Timentin+3mg/L Hygromycin)中，而后每2～3周转入一次0.2Z培养基；待再生植株长至1cm左右时，切下放入生根培养基(MS+3％sucrose+0.8％agar+320mg/L Timentin+3mg/L Hygromycin)中生根；2～4周后将生根良好、长势旺盛的转化苗移栽至土壤中。

3.突变材料的鉴定与纯合突变体获得

分别在SlEXP1和SlCEL2sgRNA上游和下游各100～200bp处设计转基因检测引物。

转基因检测引物：

SlEXP1FP:CTTCAACAACCTCAACTCC(SEQ ID NO.15)

SlEXP1RP:GGAAGGGTTTCCAGGAAGACACC(SEQ ID NO.16)

SlCEL2FP:ATGGCGCCAAAATATACCTCC(SEQ ID NO.17)

SlCEL2RP:CACATTATCTCCGGCATCG(SEQ ID NO.18)

以转基因植株番茄叶片DNA为模板进行PCR扩增，产物连接到pGEM-T Easy载体4℃过夜，连接产物42℃热击转化至DH5α大肠杆菌感受态，通过氨苄青霉素筛选后单菌落测序，测序结果分别与SlEXP1和SlCEL2原始序列比对，确定转基因植株的编辑方式。

T1代鉴定筛选获得纯合植株，提取叶片DNA，用RNase A处理去除rRNA的污染并通过Nano drop定量，稀释至20ng/μl，用Cas9引物进行RT-qPCR定量分析，筛选获得Cas9阴性的植株。与传统转基因植株不同，该方法获得的突变体材料可在完成基因编辑后将外源插入序列可通过自交的方式移除。

Cas9引物：

Cas9FP:CAAGGGCTACAAAGAAGTG(SEQ ID NO.19)

Cas9RP:AGTTCACATATTTGGAGGG(SEQ ID NO.20)

4.果实硬度分析

果实硬度测定采用TA-XT plus质构仪(Stable Micro Systems,UK)，设置参数如下：测前速度为10mm s