用于生产L-缬氨酸的大肠杆菌及其构建方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域中，用于生产L-缬氨酸的大肠杆菌及其构建方法。

背景技术

在微生物中，L-缬氨酸(支链氨基酸的一种)是从丙酮酸开始，经由乙酰乳酸、二羟基异戊酸和酮异戊酸生物合成的。通过乙酰羟酸合酶、乙酰羟酸还原异构酶、二羟酸脱水酶和转氨酶B催化的反应产生这些中间代谢产物。然而，这些酶还参与从丁酮酸和丙酮酸开始的L-异亮氨酸的生物合成，而且L-亮氨酸也从酮异戊酸(一种中间代谢产物)开始，经由2-异丙基苹果酸、3-异丙基苹果酸和酮异己酸生物合成。因此，因为支链氨基酸(即L-缬氨酸、L-异亮氨酸和L-亮氨酸)使用相同的酶用于其生物合成过程，所以已知工业上通过发酵生产一种类型的支链氨基酸具有难度。此外，存在的一个问题是工业的批量生产受到由L-缬氨酸(其为终产物)或其衍生物引起的反馈抑制的限制。

大肠杆菌具有明确的遗传背景，是氨基酸生产中具有吸引力的工业化生产底盘。然而，相比于谷氨酸棒杆菌，生产L-缬氨酸的大肠杆菌菌株的相关报道较少，这可能是由于大肠杆菌对L-缬氨酸生物合成的调节机制更为复杂。乙酰羟基酸合酶(AHAS)是L-缬氨酸生物合成的限速酶，大肠杆菌有三种AHAS同工酶，由ilvBN、ilvGM和ilvIH编码，具有不同的性质和调节机制。Park等人报道了通过Escherichia coli W3110和Escherichia coli W的系统代谢工程改造L-缬氨酸生产菌株，其L-缬氨酸终产量达到60.7g/L，糖酸转化率为0.22g/g。除了诱变育种和常规代谢工程修饰外，辅因子平衡也被认为是提高L-缬氨酸产量的关键瓶颈。由于胞内辅因子影响代谢网络、信号转导和物质运输，进而影响微生物细胞的生理功能。在微生物发酵生产化学品的过程中，化学品的效价和产量往往受到辅因子不平衡的限制，这主要是由合成途径中辅因子依赖酶的不平衡表达引起的。Savrasova和Stoynova等人通过用异源NADH依赖性亮氨酸脱氢酶替换天然NADPH依赖性转氨酶，构建了一株以大肠杆菌MG1655为出发菌株的L-缬氨酸工程菌。在微需氧条件下，该菌株的糖酸转化率(0.23g/g)仅为最大理论产量0.65g/g的35.4％。开发生物传感器高通量筛选方法，引入外源辅酶再生途径以平衡胞内辅因子，构建高效的工业底盘生产菌株，是需要解决关键科学问题。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何提高L

为解决上述技术问题，本发明首先提供了用于生产L-缬氨酸的工程菌，所述工程菌为对受体菌进行改造得到的重组菌；所述改造包括A4）；

A4）包括A41）、A42）和A43）：

A41）敲除所述受体菌的lacI基因，抑制所述lacI基因的表达或抑制所述lacI基因编码的蛋白质的活性；

A42）敲除所述受体菌的lacZ基因，抑制所述lacZ基因的表达或抑制所述lacZ基因编码的蛋白质的活性；

A43）增加所述受体菌中DNA聚合酶的含量或增强所述DNA聚合酶的活性。

其中，所述受体菌含有lacI基因（GeneID:945007，更新日期2023-04-14）、lacZ基因（GeneID:945006，更新日期2023-04-14）。

上述工程菌中，所述DNA聚合酶可来源于大肠杆菌（

上述工程菌中，所述DNA聚合酶可为序列表中SEQ ID No.10所示的蛋白质。

上述工程菌中，所述DNA聚合酶的编码基因可为序列表中SEQ ID No.9的第701-3352位所示的DNA分子。

所述DNA聚合酶编码基因的表达由能在所述工程菌中启动所述基因表达的启动子启动，包括但不限于强启动子，组成型启动子。

在本发明的另一个实施例中，所述DNA聚合酶编码基因的表达由PxylF启动子启动，所述PxylF启动子为SEQ ID No.9的第3353-3617位所示的DNA分子。

具体的，A4）可通过CRISPR/Cas9系统，利用靶向lacI和lacZ基因的sgRNA与作为供体的SEQ ID No.9所示的DNA片段进行基因编辑实现。

上述工程菌中，所述受体菌可为大肠杆菌（

上述工程菌中，所述改造可还包括A5）：

A5）包括A51）和A52）：

A51）敲除所述受体菌的ycgH基因，抑制所述ycgH基因的表达或抑制所述ycgH基因编码的蛋白质的活性；

A52）增加所述受体菌中ilvC基因编码蛋白质的含量或增强所述ilvC基因编码蛋白质的活性。

所述受体菌还含有ycgH基因（GeneID:2847703，更新日期2023-04-14）。

上述工程菌中，所述ilvC基因来可源于大肠杆菌（

上述工程菌中，所述ilvC基因可编码序列表中SEQ ID No.12所示的蛋白质。

上述工程菌中，所述ilvC基因可为序列表中SEQ ID No.11的第794-2269位所示的DNA分子。

所述ilvC基因的表达由能在所述工程菌中启动相应基因表达的启动子启动，包括但不限于强启动子，组成型启动子。

在本发明的另一个实施例中，所述ilvC基因的表达由Ptrc启动子启动，所述Ptrc启动子为SEQ ID No.11的第2270-2343位所示的DNA分子。

具体的，A5）可通过CRISPR/Cas9系统，利用靶向ycgH基因的sgRNA与作为供体的SEQ ID No.11所示的DNA片段进行基因编辑实现。

上述工程菌中，所述受体菌可为大肠杆菌（

本发明的受体菌包括但不限于大肠埃希氏菌（

在本发明的一个实施例中，所述大肠杆菌（

在本发明的一个实施例中，所得重组菌为重组菌CGMCC22721-lacIZ和W3110-lacIZ，重组菌CGMCC22721-lacIZ和W3110-lacIZ分别是将L-缬氨酸生产菌CGMCC22721和野生型大肠杆菌W3110基因组上lacI-lacZ基因部分编码区进行敲除，同时插入了PxylF启动子启动的DNA聚合酶基因（来自大肠杆菌（

在本发明的另一个实施例中，所得重组菌为重组菌CGMCC22721-lacIZ-ycgH和W3110-lacIZ-ycgH，重组菌CGMCC22721-lacIZ-ycgH和W3110-lacIZ-ycgH分别是将L-缬氨酸生产菌CGMCC22721和野生型大肠杆菌W3110基因组上lacI-lacZ基因部分编码区进行敲除，插入了PxylF启动子启动的DNA聚合酶基因（来自大肠杆菌（

本发明还提供了制备用于生产L-缬氨酸的工程菌的方法，所述方法包括：对所述受体菌进行上述A4）的改造，得到目的工程菌。

上述方法还可包括对所述受体菌进行上述A5）的改造。

上述方法中，所述受体菌可为大肠杆菌（

本发明还提供了L

上述方法中，培养所述工程菌可采用能使所述工程菌生长的培养基进行；

和/或，培养所述重组工程菌采用能使所述工程菌生长的条件进行。

本发明还提供一种用于生产L-缬氨酸的产品，所述产品为P4）或为由P4）与P5）组成的产品：

P4）为分别或同步实现A41）、A42）和A43）的物质：

A41）敲除受体菌的lacI基因或抑制所述lacI基因的表达或抑制所述lacI基因编码的蛋白质的活性；

A42）敲除受体菌的lacZ基因或抑制所述lacZ基因的表达或抑制所述lacZ基因编码的蛋白质的活性；

A43）增加受体菌中DNA聚合酶的含量或增强所述DNA聚合酶的活性；

P5）为分别或同步实现A51）和A52）的物质：

A51）敲除受体菌的ycgH基因或抑制所述ycgH基因的表达或抑制所述ycgH基因编码的蛋白质的活性；

A52）增加受体菌中ilvC基因编码蛋白质的含量或增强所述ilvC基因编码蛋白质的活性。

所述工程菌或所述产品在生产L-缬氨酸中的应用，或在制备用于生产L-缬氨酸产品中的应用，也属于本发明的保护范围。

本发明的工程菌及其制备方法与相关产品可以用于生产多种产物，包括但不限于实施例中的L-缬氨酸，所生产的产物还可为谷氨酸、苏氨酸、色氨酸、精氨酸、赖氨酸、甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、组氨酸、莽草酸、原儿茶酸、丁二酸、a酮戊二酸、柠檬酸、鸟氨酸，瓜氨酸等。

实验证明，本发明改造后的工程菌可提高L-缬氨酸产量，可用于生产L-缬氨酸，具有很好的应用前景。

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

保藏说明：

分类命名：大肠埃希氏菌（

菌株编号：YP045。

保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

保藏单位简称：CGMCC。

保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮政编码：100101。

保藏日期：2021年06月15日。

保藏中心登记入册编号：CGMCC No.22721。

附图说明

图1、发酵培养基配方（其余为水）。

图2、发酵控制工艺。

图3、L-缬氨酸产量及显著性分析。

具体实施方式

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA/RNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA/RNA的3′末端核苷酸。

下述实施例中，L-缬氨酸生产菌CGMCC22721为大肠埃希氏菌（

实施例1、构建基因组上缺失yjiT基因同时过表达brnF-brnE基因的工程菌株。

依据NCBI公布的大肠杆菌（

一、sgRNA的构建

依据NCBI公布的大肠杆菌（

扩增sgRNA片段，无需模板，只需进行PCR退火过程即可，体系及程序如下：PCR反应体系：sgRNA-1F 10μL，sgRNA-1R 10μL；PCR反应程序：95℃变性5min，50℃退火1min。退火完成后，采用DNA纯化试剂盒回收sgRNA目的DNA片段，测定其DNA浓度，并将浓度稀释至100ng/μL。

将pGRB质粒利用

本实验所用引物如下（上海invitrogen公司合成），带下划线的核苷酸为pGRB克隆载体同源臂序列，加粗的核苷酸为sgRNA序列：

sgRNA-1F:5'-

sgRNA-1R:5'-

sgRNA-PF: 5'-GTCTCATGAGCGGATACATATTTG-3'，

sgRNA-PR: 5'-GCGTCAGGTGCATAAACAGA-3'。

二、PCR扩增同源重组片段

依据NCBI公布的大肠杆菌（

引物如下（上海invitrogen公司合成）：

P1:5'-GAGTGATGAGCGGTTGAAG-3'，

P2:5'-CTCACAATTCCACACATTATACGAGCCGGATGATTAATTGTCAAAAAACAGGCAGCAAAGTCC-3'，

P3:5'-CGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGACCGTGCAAAAAACGCAAGAG-3'，

P4: 5'-CTTCACAGGTAGTGCTTTTAGTTAGAAAAGATTCACCAGTCCAAC-3'，

P5: 5'-GTGAATCTTTTCTAACTAAAAGCACTACCTGTGAAGG-3'，

P6: 5'-CTGCGGCAATAATCAACG-3'。

以大肠杆菌W3110基因组DNA为模板，以引物P1/P2、P5/P6和KAPA HiFi HotStart（上海华雅思创生物科技有限公司，KK2601）进行PCR扩增，获得大小分别为801bp的上同源臂和684bp和下同源臂片段；以谷氨酸棒状杆菌ATCC13032基因组DNA为模板，以引物P3/P4和KAPA HiFi HotStart进行PCR扩增，获得大小为1153bp的Ptrc-brnF-brnE基因片段。PCR反应结束后，采用柱式DNA凝胶回收试剂盒分别进行琼脂糖凝胶电泳回收。回收后的DNA以引物P1/P6进行overlap PCR获得同源重组DNA片段ΔyjiT-Ptrc-brnF-brnE（SEQ IDNo.1），大小为2579 bp。

SEQ ID No.1中，第758-831位所示为Ptrc启动子，第832-1910位所示为brnF-brnE基因，编码SEQ ID No.2所示的brnF蛋白质（编码序列为SEQ ID No.1的第832-1587位）与SEQ ID No.3所示的brnE蛋白质（编码序列为SEQ ID No.1的第1584-1910位）。

三、感受态的制备及转化

提取pREDCas9质粒（含有壮观霉素抗性基因），分别转化到L-缬氨酸生产菌CGMCC22721和大肠杆菌W3110感受态细胞中，涂布到含有壮观霉素（100mg/L）的2-YT琼脂平板上32℃培养，挑选抗壮观霉素（100mg/L）的单菌落用引物pRedCas9-PF/pRedCas9-PR 进行 PCR鉴定，获得943bp的为含有pREDCas9质粒的CGMCC22721-Cas9和W3110-Cas9转化子。

引物如下（上海invitrogen公司合成）：

pRedCas9-PF: 5'-GCAGTGGCGGTTTTCATG-3'；

pRedCas9-PR:5'-CCTTGGTGATCTCGCCTTTC-3'。

制备CGMCC22721-Cas9和W3110-Cas9感受态细胞。当菌体长至OD

引物如下（上海invitrogen公司合成）：

P7: 5'-GCTGTATTCCTTATGTGGACC-3'，

P8: 5'-GCAGGAATCCAAAGTCAGC-3'。

将阳性转化子接种于含壮观霉素（100mg/L）和终浓度至0.2% 阿拉伯糖的2-YT培养基中以消除质粒pGRB-sgRNA-1，挑选在壮观霉素（100mg/L）上生长而在氨苄霉素（100mg/L）上不生长的菌落，再将这些菌落转接到2-YT培养基上42℃培养以消除pREDCas9质粒，挑选在壮观霉素（100mg/L）上不生长而在无抗的2-YT上生长的菌落，再次通过引物P1/P6进行PCR鉴定，能扩增出大小2579bp（SEQ ID No.1）片段的为阳性子，将阳性子送测序，测序结果正确的菌株分别命名为CGMCC22721-yjiT和W3110-yjiT；

重组菌CGMCC22721-yjiT和W3110-yjiT均缺失yjiT基因，同时过表达Ptrc启动子启动的brnF-brnE基因（来自谷氨酸棒状杆菌（

实施例2、构建基因组上缺失yjiV基因同时过表达ilvE

依据NCBI公布的大肠杆菌（

一、sgRNA的构建

依据NCBI公布的大肠杆菌（

扩增sgRNA片段，无需模板，只需进行PCR退火过程即可，体系及程序如下：PCR反应体系：sgRNA-2F 10μL，sgRNA-2R 10μL；PCR反应程序：95℃变性5min，50℃退火1min。退火完成后，采用DNA纯化试剂盒回收sgRNA目的DNA片段，测定其DNA浓度，并将浓度稀释至100ng/μL。

将pGRB质粒利用

本实验所用引物如下（上海invitrogen公司合成），带下划线的核苷酸为pGRB克隆载体同源臂序列，加粗的核苷酸为sgRNA序列：

sgRNA-2F:5'-

sgRNA-2R:5'-

二、PCR扩增同源重组片段

依据NCBI公布的大肠杆菌（

引物如下（上海invitrogen公司合成）：

P9: 5'-TGAATGGACTGCTATGCG-3'，

P10: 5'-CACAGTGTATTAAGCAGACGTTAACAACGCAGTACTTCCTGCTG-3'，

P11: 5'-GAAGTACTGCGTTGTTAACGTCTGCTTAATACACTGTG-3'，

P12:5'-GTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGACCATGGAACTTTTTAAATATATGGAG-3'，

P13:5'-CTCACAATTCCACACATTATACGAGCCGGATGATTAATTGTCAATTAACCCCCCAGTTTCGATTTAT-3'，

P14: 5'-CCACCAGCACATCCGTTGAAATACAAAAAATGGGAC-3'，

P15: 5'-TCCCATTTTTTGTATTTCAACGGATGTGCTGGTGG-3'，

P16: 5'-TGAAGACACGCTGGCTAAC-3'。

以大肠杆菌W3110基因组DNA为模板，以引物P9/P10、P13/P14、P15/P16和KAPAHiFi HotStart进行PCR扩增，获得大小分别为831bp的上同源臂、1979bp的PilvD-ilvD基因和856bp下同源臂片段；以枯草芽孢杆菌

SEQ ID No.4中，第3828-3893位所示为PilvD启动子，第1977-3827位所示为ilvD基因，编码SEQ ID No.5所示的ilvD蛋白质；第1903-1976位所示为Ptrc启动子，第808-1902位所示为ilvE基因，编码SEQ ID No.6所示的ilvE蛋白质。

三、感受态的制备及转化

将实施例1的CGMCC22721-Cas9和W3110-Cas9制备感受态细胞。当菌体长至OD

引物如下（上海invitrogen公司合成）：

P17: 5'-AGCGAGTTTCCAATACCG-3'，

P18: 5'-ATTTCTCCTGCTTTCGGC-3'。

将阳性转化子接种于含壮观霉素（100mg/L）和终浓度至0.2% 阿拉伯糖的2-YT培养基中以消除质粒pGRB-sgRNA-2，挑选在壮观霉素（100mg/L）上生长而在氨苄霉素（100mg/L）上不生长的菌落，再将这些菌落转接到2-YT培养基上42℃培养以消除pREDCas9质粒，挑选在壮观霉素（100mg/L）上不生长而在无抗的2-YT上生长的菌落，再次通过引物P9/P16进行PCR鉴定，能扩增出大小4732bp（SEQ ID No.4）片段的为阳性子，将阳性子送测序，测序结果正确的菌株分别命名为CGMCC22721-yjiV和W3110-yjiV；

重组菌CGMCC22721-yjiV和W3110-yjiV均缺失yjiV基因，同时过表达Ptrc启动子启动的ilvE基因（来自枯草芽孢杆菌

实施例3、构建基因组上缺失trpR基因同时过表达ilvH基因的工程菌株。

依据NCBI公布的大肠杆菌（

一、sgRNA的构建

依据NCBI公布的大肠杆菌（

扩增sgRNA片段，无需模板，只需进行PCR退火过程即可，体系及程序如下：PCR反应体系：sgRNA-3F 10μL，sgRNA-3R 10μL；PCR反应程序：95℃变性5min，50℃退火1min。退火完成后，采用DNA纯化试剂盒回收sgRNA目的DNA片段，测定其DNA浓度，并将浓度稀释至100ng/μL。

将pGRB质粒利用

本实验所用引物如下（上海invitrogen公司合成），带下划线的核苷酸为pGRB克隆载体同源臂序列，加粗的核苷酸为sgRNA序列：

sgRNA-3F:5'-

sgRNA-3R:5'-

二、PCR扩增同源重组片段

依据NCBI公布的大肠杆菌（

引物如下（上海invitrogen公司合成）：

P19:5'-CCAATCTGGTGAAGAGCAAG-3'，

P20:5'-CTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACATTATACGAGCCGGATGATTAATTGTCAATGCTGAATAGGGTGATTGTTG-3'，

P21:5'-CAATTTCACACAGGAAACAGACCATGCGCCGGATATTATCAGTCTTACTCGAAAATGAATCAGACGCGTTATTCCGC-3'，

P22: 5'-GTCTTATCATGCCTACCAAATCAACGCATTATTTTATCG-3'，

P23: 5'-CGATAAAATAATGCGTTGATTTGGTAGGCATGATAAGAC-3'，

P24: 5'-GTGCGTCCTAAATCGCTAC-3'。

以大肠杆菌W3110基因组DNA为模板，以引物P19/P20、P21/P22、P23/P24和KAPAHiFi HotStart进行PCR扩增，获得大小分别为831bp的上同源臂、535bp的Ptrc

SEQ ID No.7中，第761-834位所示为Ptrc启动子，第835-1326位所示为ilvH

三、感受态的制备及转化

将实施例1的CGMCC22721-Cas9和W3110-Cas9制备感受态细胞。当菌体长至OD

引物如下（上海invitrogen公司合成）：

P25: 5'-CATCGGCGAAGAGTATGAG-3'，

P26: 5'-AAAGTCCGACCACACCAGAG-3'。

将阳性转化子接种于含壮观霉素（100mg/L）和终浓度至0.2% 阿拉伯糖的2-YT培养基中以消除质粒pGRB-sgRNA-3，挑选在壮观霉素（100mg/L）上生长而在氨苄霉素（100mg/L）上不生长的菌落，再将这些菌落转接到2-YT培养基上42℃培养以消除pREDCas9质粒，挑选在壮观霉素（100mg/L）上不生长而在无抗的2-YT上生长的菌落，再次通过引物P19/P24进行PCR鉴定，能扩增出大小2108bp（SEQ ID No.7）片段的为阳性子，将阳性子送测序，测序结果正确的菌株分别命名为CGMCC22721-trpR和W3110-trpR；

重组菌CGMCC22721-trpR和W3110-trpR均缺失trpR基因，同时过表达Ptrc启动子启动的ilvH

实施例4、构建基因组上缺失lacI-lacZ基因同时过表达DNA聚合酶基因的工程菌株。

依据NCBI公布的大肠杆菌（

一、sgRNA的构建

依据NCBI公布的大肠杆菌（

扩增sgRNA片段，无需模板，只需进行PCR退火过程即可，体系及程序如下：PCR反应体系：sgRNA-4F 10μL，sgRNA-4R 10μL；PCR反应程序：95℃变性5min，50℃退火1min。退火完成后，采用DNA纯化试剂盒回收sgRNA目的DNA片段，测定其DNA浓度，并将浓度稀释至100ng/μL。

将pGRB质粒利用

本实验所用引物如下（上海invitrogen公司合成），带下划线的核苷酸为pGRB克隆载体同源臂序列，加粗的核苷酸为sgRNA序列：

sgRNA-4F:5'-

sgRNA-4R: 5'-

二、PCR扩增同源重组片段

依据NCBI公布的大肠杆菌（

引物如下（上海invitrogen公司合成）：

P27:5'-CGGTAATAATCCACAGCAGG-3'，

P28: 5'-GACTTCGCGTTCGCGTAACAGGTAGCAGAGCGGGTA-3'，

P29: 5'-TACCCGCTCTGCTACCTGTTACGCGAACGCGAAGTC-3'，

P30: 5'-CTAACTACAGAAGGCCCTACACCATGAACACGATTAACATCGC-3'，

P31: 5'-GCGATGTTAATCGTGTTCATGGTGTAGGGCCTTCTGTAGTTAG-3'，

P32: 5'-CATTAAGTTCTGTCTCGGCGGAGATAATTCACAAGTGTGCG-3'，

P33: 5'-CGCACACTTGTGAATTATCTCCGCCGAGACAGAACTTAATG-3'，

P34: 5'-GGTTACGGACAGAACTACCG-3'。

以大肠杆菌W3110基因组DNA为模板，以引物P27/P28、P31/P32、P33/P34和KAPAHiFi HotStart进行PCR扩增，获得大小分别为718bp的上同源臂、305bp的PxylF启动子和928bp和下同源臂片段；以大肠杆菌BL21基因组DNA为模板，以引物P29/P30和KAPA HiFiHotStart进行PCR扩增，获得大小为2693bp的DNA聚合酶基因。PCR反应结束后，采用柱式DNA凝胶回收试剂盒分别进行琼脂糖凝胶电泳回收。回收后的DNA以引物P27/P34进行overlapPCR获得同源重组DNA片段ΔlacIZ-PxylF-DNA polymerase（SEQ ID No.9），大小为4524bp。

SEQ ID No.9中，第3353-3617位所示为PxylF启动子，第701-3352位所示为DNA聚合酶基因，编码SEQ ID No.10所示的DNA聚合酶。

三、感受态的制备及转化

将实施例1的CGMCC22721-Cas9和W3110-Cas9制备感受态细胞。当菌体长至OD

引物如下（上海invitrogen公司合成）：

P35: 5'-TTCGCCCATTGTCGTTAC-3'，P36: 5'-AGTTCCGCTTACAGCCTACC-3'。

将阳性转化子接种于含壮观霉素（100mg/L）和终浓度至0.2% 阿拉伯糖的2-YT培养基中以消除质粒pGRB-sgRNA-4，挑选在壮观霉素（100mg/L）上生长而在氨苄霉素（100mg/L）上不生长的菌落，再将这些菌落转接到2-YT培养基上42℃培养以消除pREDCas9质粒，挑选在壮观霉素（100mg/L）上不生长而在无抗的2-YT上生长的菌落，再次通过引物P27/P34进行PCR鉴定，能扩增出大小4524bp（SEQ ID No.9）片段的为阳性子，将阳性子送测序，测序结果正确的菌株分别命名为CGMCC22721-lacIZ和W3110-lacIZ；

重组菌CGMCC22721-lacIZ和W3110-lacIZ均缺失lacI-lacZ基因，同时过表达PxylF启动子启动的DNA聚合酶基因（来自大肠杆菌（

实施例5、构建基因组上缺失ycgH基因同时过表达ilvC基因的工程菌株。

依据NCBI公布的大肠杆菌（

一、sgRNA的构建

依据NCBI公布的大肠杆菌（

扩增sgRNA片段，无需模板，只需进行PCR退火过程即可，体系及程序如下：PCR反应体系：sgRNA-5F 10μL，sgRNA-5R 10μL；PCR反应程序：95℃变性5min，50℃退火1min。退火完成后，采用DNA纯化试剂盒回收sgRNA目的DNA片段，测定其DNA浓度，并将浓度稀释至100ng/μL。

将pGRB质粒利用

本实验所用引物如下（上海invitrogen公司合成），带下划线的核苷酸为pGRB克隆载体同源臂序列，加粗的核苷酸为sgRNA序列：

sgRNA-5F:5'-

sgRNA-5R:5'-

二、PCR扩增同源重组片段

依据NCBI公布的大肠杆菌（

引物如下（上海invitrogen公司合成）：

P37:5'-AAATGGAGGGATAACAGCC-3'，

P38: 5'-GCTGTTGCGGGTTAACGCTCCATTTAGAATAGAGTCGGACGAAAT-3'，

P39: 5'-CTAAATGGAGCGTTAACCCGCAACAGCAATAC-3'，

P40:5'-GCCATTTACGCCAAGTTTTTGACAATTAATCATCCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAG-3'，

P41:5'-CAGTGTATTGAAGTAGTTAGCCATGGTCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACATTATAC-3'，

P42: 5'-TTGCCTTCGGGCTTATCTC-3'。

以大肠杆菌W3110基因组DNA为模板，以引物P37/P38、P39/P40、P41/P42和KAPAHiFi HotStart进行PCR扩增，获得大小分别为808bp的上同源臂、1580bp的Ptrc

SEQ ID No.11中，第2270-2343位所示为Ptrc启动子，第794-2269位所示为ilvC基因，编码SEQ ID No.12所示的ilvC蛋白质。

四、感受态的制备及转化

将实施例1的CGMCC22721-Cas9和W3110-Cas9制备感受态细胞。当菌体长至OD

引物如下（上海invitrogen公司合成）：

P43: 5'-AAGACCTCTGGAAGCGTATC-3'，P44: 5'- CGTTGCGGAAGTGAAATC-3'。

将阳性转化子接种于含壮观霉素（100mg/L）和终浓度至0.2% 阿拉伯糖的2-YT培养基中以消除质粒pGRB-sgRNA-5，挑选在壮观霉素（100mg/L）上生长而在氨苄霉素（100mg/L）上不生长的菌落，再将这些菌落转接到2-YT培养基上42℃培养以消除pREDCas9质粒，挑选在壮观霉素（100mg/L）上不生长而在无抗的2-YT上生长的菌落，再次通过引物P37/P42进行PCR鉴定，能扩增出大小3189bp（SEQ ID No.11）片段的为阳性子，将阳性子送测序，测序结果正确的菌株分别命名为CGMCC22721-ycgH和W3110-ycgH；

重组菌CGMCC22721-ycgH和W3110-ycgH均缺失ycgH基因，同时过表达Ptrc启动子启动的ilvC基因（来自大肠杆菌（

实施例6、构建CGMCC22721-yjiT和W3110-yjiT上缺失yjiV基因同时过表达ilvE

依据NCBI公布的大肠杆菌（

一、PCR扩增同源重组片段

依据NCBI公布的大肠杆菌（

引物如下（上海invitrogen公司合成）：P45: 5'-AGTTCGCCCTTTGCTCTCTC-3'。

以大肠杆菌W3110-yjiT基因组DNA为模板，以引物P45/P10、P13/P14、P15/P16和KAPA HiFi HotStart进行PCR扩增，获得大小分别为812bp的上同源臂、1979bp的PilvD-ilvD基因和856bp下同源臂片段；以枯草芽孢杆菌

SEQ ID No.13中，第3809-3874位所示为PilvD启动子，第1958-3808位所示为ilvD基因，编码SEQ ID No.5所示的ilvD蛋白质；第1884-1957位所示为Ptrc启动子，第789-1883位所示为ilvE基因，编码SEQ ID No.6所示的ilvE蛋白质。

二、感受态的制备及转化

提取pREDCas9质粒（含有壮观霉素抗性基因），分别转化到实施例1的CGMCC22721-yjiT和W3110-yjiT感受态细胞中，涂布到含有壮观霉素（100mg/L）的2-YT琼脂平板上32℃培养，挑选抗壮观霉素（100mg/L）的单菌落用引物pRedCas9-PF/pRedCas9-PR 进行 PCR鉴定，获得943bp的为含有pREDCas9质粒的CGMCC22721-yjiT-Cas9和W3110-yjiT-Cas9转化子。

制备CGMCC22721-yjiT-Cas9和W3110-yjiT-Cas9感受态细胞。当菌体长至OD

引物如下（上海invitrogen公司合成）：P46: 5'-AGCGTTTCACTCCTACTGGG-3'。

将阳性转化子接种于含壮观霉素（100mg/L）和终浓度至0.2% 阿拉伯糖的2-YT培养基中以消除质粒pGRB-sgRNA-2，挑选在壮观霉素（100mg/L）上生长而在氨苄霉素（100mg/L）上不生长的菌落，再将这些菌落转接到2-YT培养基上42℃培养以消除pREDCas9质粒，挑选在壮观霉素（100mg/L）上不生长而在无抗的2-YT上生长的菌落，再次通过引物P45/P16进行PCR鉴定，能扩增出大小4713bp（SEQ ID No.13）片段的为阳性子，将阳性子送测序，测序结果正确的菌株分别命名为CGMCC22721-yjiT

重组菌CGMCC22721-yjiT

实施例7、构建CGMCC22721-yjiT

依据NCBI公布的大肠杆菌（

提取pREDCas9质粒（含有壮观霉素抗性基因），分别转化到实施例6的CGMCC22721-yjiT

制备CGMCC22721-yjiT

将阳性转化子接种于含壮观霉素（100mg/L）和终浓度至0.2% 阿拉伯糖的2-YT培养基中以消除质粒pGRB-sgRNA-3，挑选在壮观霉素（100mg/L）上生长而在氨苄霉素（100mg/L）上不生长的菌落，再将这些菌落转接到2-YT培养基上42℃培养以消除pREDCas9质粒，挑选在壮观霉素（100mg/L）上不生长而在无抗的2-YT上生长的菌落，再次通过引物P19/P24进行PCR鉴定，能扩增出大小2108bp（SEQ ID No.7）片段的为阳性子，将阳性子送测序，测序结果正确的菌株分别命名为CGMCC22721-yjiT

重组菌CGMCC22721-yjiT

实施例8、构建CGMCC22721-yjiT

依据NCBI公布的大肠杆菌（

提取pREDCas9质粒（含有壮观霉素抗性基因），分别转化到实施例7的CGMCC22721-yjiT

制备CGMCC22721-yjiT

将阳性转化子接种于含壮观霉素（100mg/L）和终浓度至0.2% 阿拉伯糖的2-YT培养基中以消除质粒pGRB-sgRNA-4，挑选在壮观霉素（100mg/L）上生长而在氨苄霉素（100mg/L）上不生长的菌落，再将这些菌落转接到2-YT培养基上42℃培养以消除pREDCas9质粒，挑选在壮观霉素（100mg/L）上不生长而在无抗的2-YT上生长的菌落，再次通过引物P27/P34进行PCR鉴定，能扩增出大小4524bp（SEQ ID No.9）片段的为阳性子，将阳性子送测序，测序结果正确的菌株分别命名为CGMCC22721-yjiT

重组菌CGMCC22721-yjiT

实施例9、构建CGMCC22721-yjiT

依据NCBI公布的大肠杆菌（

提取pREDCas9质粒（含有壮观霉素抗性基因），分别转化到实施例8的CGMCC22721-yjiT

制备CGMCC22721-yjiT

将阳性转化子接种于含壮观霉素（100mg/L）和终浓度至0.2% 阿拉伯糖的2-YT培养基中以消除质粒pGRB-sgRNA-5，挑选在壮观霉素（100mg/L）上生长而在氨苄霉素（100mg/L）上不生长的菌落，再将这些菌落转接到2-YT培养基上42℃培养以消除pREDCas9质粒，挑选在壮观霉素（100mg/L）上不生长而在无抗的2-YT上生长的菌落，再次通过引物P37/P42进行PCR鉴定，能扩增出大小3189bp（SEQ ID No.11）片段的为阳性子，将阳性子送测序，测序结果正确的菌株分别命名为CGMCC22721-yjiT

重组菌CGMCC22721-yjiT

实施例10、构建CGMCC22721

依据NCBI公布的大肠杆菌（

提取pREDCas9质粒（含有壮观霉素抗性基因），分别转化到实施例2的CGMCC22721

制备CGMCC22721

将阳性转化子接种于含壮观霉素（100mg/L）和终浓度至0.2% 阿拉伯糖的2-YT培养基中以消除质粒pGRB-sgRNA-3，挑选在壮观霉素（100mg/L）上生长而在氨苄霉素（100mg/L）上不生长的菌落，再将这些菌落转接到2-YT培养基上42℃培养以消除pREDCas9质粒，挑选在壮观霉素（100mg/L）上不生长而在无抗的2-YT上生长的菌落，再次通过引物P19/P24进行PCR鉴定，能扩增出大小2108bp（SEQ ID No.7）片段的为阳性子，将阳性子送测序，测序结果正确的菌株分别命名为CGMCC22721-yjiV-trpR和W3110-yjiV-trpR；

重组菌CGMCC22721

实施例11、构建CGMCC22721

依据NCBI公布的大肠杆菌（

提取pREDCas9质粒（含有壮观霉素抗性基因），分别转化到实施例10的CGMCC22721-yjiV-trpR和W3110-yjiV-trpR感受态细胞中，涂布到含有壮观霉素（100mg/L）的2-YT琼脂平板上32℃培养，挑选抗壮观霉素（100mg/L）的单菌落用引物pRedCas9-PF/pRedCas9-PR 进行 PCR鉴定，获得943bp的为含有pREDCas9质粒的CGMCC22721-yjiV-trpR-Cas9和W3110-yjiV-trpR-Cas9转化子。

制备CGMCC22721-yjiV-trpR-Cas9和W3110-yjiV-trpR-Cas9感受态细胞。当菌体长至OD

将阳性转化子接种于含壮观霉素（100mg/L）和终浓度至0.2% 阿拉伯糖的2-YT培养基中以消除质粒pGRB-sgRNA-4，挑选在壮观霉素（100mg/L）上生长而在氨苄霉素（100mg/L）上不生长的菌落，再将这些菌落转接到2-YT培养基上42℃培养以消除pREDCas9质粒，挑选在壮观霉素（100mg/L）上不生长而在无抗的2-YT上生长的菌落，再次通过引物P27/P34进行PCR鉴定，能扩增出大小4524bp（SEQ ID No.9）片段的为阳性子，将阳性子送测序，测序结果正确的菌株分别命名为CGMCC22721

重组菌CGMCC22721-yjiV-trpR-lacIZ和W3110

实施例12、构建CGMCC22721

依据NCBI公布的大肠杆菌（

提取pREDCas9质粒（含有壮观霉素抗性基因），分别转化到实施例11的CGMCC22721-yjiV-trpR-lacIZ和野生型大肠杆菌W3110-yjiV-trpR-lacIZ感受态细胞中，涂布到含有壮观霉素（100mg/L）的2-YT琼脂平板上32℃培养，挑选抗壮观霉素（100mg/L）的单菌落用引物pRedCas9-PF/pRedCas9-PR 进行 PCR鉴定，获得943bp的为含有pREDCas9质粒的CGMCC22721-yjiV-trpR-lacIZ-Cas9和W3110-yjiV-trpR-lacIZ-Cas9转化子。

制备CGMCC22721-yjiV-trpR-lacIZ-Cas9和W3110-yjiV-trpR-lacIZ-Cas9感受态细胞。当菌体长至OD

将阳性转化子接种于含壮观霉素（100mg/L）和终浓度至0.2% 阿拉伯糖的2-YT培养基中以消除质粒pGRB-sgRNA-5，挑选在壮观霉素（100mg/L）上生长而在氨苄霉素（100mg/L）上不生长的菌落，再将这些菌落转接到2-YT培养基上42℃培养以消除pREDCas9质粒，挑选在壮观霉素（100mg/L）上不生长而在无抗的2-YT上生长的菌落，再次通过引物P37/P42进行PCR鉴定，能扩增出大小3189bp（SEQ ID No.11）片段的为阳性子，将阳性子送测序，测序结果正确的菌株分别命名为CGMCC22721-yjiV-trpR-lacIZ-ycgH和W3110

重组菌CGMCC22721-yjiV-trpR-lacIZ-ycgH和W3110

实施例13、构建CGMCC22721-trpR和W3110

依据NCBI公布的大肠杆菌（

提取pREDCas9质粒（含有壮观霉素抗性基因），分别转化到实施例3的CGMCC22721-trpR和W3110-trpR感受态细胞中，涂布到含有壮观霉素（100mg/L）的2-YT琼脂平板上32℃培养，挑选抗壮观霉素（100mg/L）的单菌落用引物pRedCas9-PF/pRedCas9-PR 进行 PCR鉴定，获得943bp）的为含有pREDCas9质粒的CGMCC22721-trpR-Cas9和W3110-trpR-Cas9转化子。

制备CGMCC22721-trpR-Cas9和W3110-trpR-Cas9感受态细胞。当菌体长至OD

将阳性转化子接种于含壮观霉素（100mg/L）和终浓度至0.2% 阿拉伯糖的2-YT培养基中以消除质粒pGRB-sgRNA-4，挑选在壮观霉素（100mg/L）上生长而在氨苄霉素（100mg/L）上不生长的菌落，再将这些菌落转接到2-YT培养基上42℃培养以消除pREDCas9质粒，挑选在壮观霉素（100mg/L）上不生长而在无抗的2-YT上生长的菌落，再次通过引物P27/P34进行PCR鉴定，能扩增出大小4524bp（SEQ ID No.9）片段的为阳性子，将阳性子送测序，测序结果正确的菌株分别命名为CGMCC22721

重组菌CGMCC22721-trpR-lacIZ和W3110-trpR-lacIZ均缺失trpR基因，同时过表达Ptrc启动子启动的ilvH

实施例14、构建CGMCC22721

依据NCBI公布的大肠杆菌（

提取pREDCas9质粒（含有壮观霉素抗性基因），分别转化到实施例13的CGMCC22721-trpR-lacIZ和野生型大肠杆菌W3110-trpR-lacIZ感受态细胞中，涂布到含有壮观霉素（100mg/L）的2-YT琼脂平板上32℃培养，挑选抗壮观霉素（100mg/L）的单菌落用引物pRedCas9-PF/pRedCas9-PR 进行 PCR鉴定，获得943bp的为含有pREDCas9质粒的CGMCC22721-trpR-lacIZ-Cas9和W3110-trpR-lacIZ-Cas9转化子。

制备CGMCC22721-trpR-lacIZ-Cas9和W3110-trpR-lacIZ-Cas9感受态细胞。当菌体长至OD

将阳性转化子接种于含壮观霉素（100mg/L）和终浓度至0.2% 阿拉伯糖的2-YT培养基中以消除质粒pGRB-sgRNA-5，挑选在壮观霉素（100mg/L）上生长而在氨苄霉素（100mg/L）上不生长的菌落，再将这些菌落转接到2-YT培养基上42℃培养以消除pREDCas9质粒，挑选在壮观霉素（100mg/L）上不生长而在无抗的2-YT上生长的菌落，再次通过引物P37/P42进行PCR鉴定，能扩增出大小3189bp（SEQ ID No.11）片段的为阳性子，将阳性子送测序，测序结果正确的菌株分别命名为CGMCC22721-trpR-lacIZ-ycgH和W3110-trpR-lacIZ-ycgH；

重组菌CGMCC22721-trpR-lacIZ-ycgH和W3110-trpR-lacIZ-ycgH均缺失trpR基因，同时过表达Ptrc启动子启动的ilvH

实施例15、构建CGMCC22721

依据NCBI公布的大肠杆菌（

提取pREDCas9质粒（含有壮观霉素抗性基因），分别转化到实施例4的CGMCC22721-lacIZ和野生型大肠杆菌W3110-lacIZ感受态细胞中，涂布到含有壮观霉素（100mg/L）的2-YT琼脂平板上32℃培养，挑选抗壮观霉素（100mg/L）的单菌落用引物pRedCas9-PF/pRedCas9-PR 进行 PCR鉴定，获得943bp的为含有pREDCas9质粒的CGMCC22721-lacIZ-Cas9和W3110-lacIZ-Cas9转化子。

制备CGMCC22721-lacIZ-Cas9和W3110-lacIZ-Cas9感受态细胞。当菌体长至OD

将阳性转化子接种于含壮观霉素（100mg/L）和终浓度至0.2% 阿拉伯糖的2-YT培养基中以消除质粒pGRB-sgRNA-5，挑选在壮观霉素（100mg/L）上生长而在氨苄霉素（100mg/L）上不生长的菌落，再将这些菌落转接到2-YT培养基上42℃培养以消除pREDCas9质粒，挑选在壮观霉素（100mg/L）上不生长而在无抗的2-YT上生长的菌落，再次通过引物P37/P42进行PCR鉴定，能扩增出大小3189bp（SEQ ID No.11）片段的为阳性子，将阳性子送测序，测序结果正确的菌株分别命名为CGMCC22721-lacIZ-ycgH和W3110-lacIZ-ycgH；

重组菌CGMCC22721-lacIZ-ycgH和W3110-lacIZ-ycgH均缺失lacI-lacZ基因，同时过表达PxylF启动子启动的DNA聚合酶基因（来自大肠杆菌（

实施例16、L-缬氨酸发酵实验。

将上述实施例1-15构建的菌株和L-缬氨酸生产菌CGMCC22721及野生型大肠杆菌W3110在BLBIO-5GC-4-H型号的发酵罐（上海百仑生物科技有限公司）中以图1所示的培养基和图2所示的控制工艺进行发酵实验。每个菌株重复三次，结果如图3所示。由以上发酵结果所示，无论对于产L-缬氨酸的菌株CGMCC22721，还是模式菌株野生型大肠杆菌W3110，经过实施例1-15的改造后均有助于L-缬氨酸产量的提高。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。