一种用于脓毒症早期预后评估的生物标志物及应用

技术领域

本发明属于快速检测技术领域，尤其涉及一种用于脓毒症早期预后评估的生物标志物及应用。

背景技术

脓毒症是一种由于宿主对感染的反应失调而导致的危及生命的器官功能障碍，是重症监护室(Intensive care unit,ICU)内的常见疾病，也一直是世界范围内重要的公共卫生问题。数十年来，脓毒症的研究不断深入，随着早期复苏策略和集束化治疗理念的不断优化，脓毒症患者的预后有所改善，但病死率仍居高不下。目前，脓毒症的预后评估主要依靠序贯器官衰竭评分(Sequential Organ Failure Assessment,SOFA)，缺乏有效的脓毒症早期预后标志物。因此，发现更有效的临床标志物有利于促进脓毒症的早期精准治疗。

玻连蛋白(Vitronectin,VTN)是一种存在于血浆和细胞外基质中的多功能糖蛋白，可与整合素受体结合，通过RGD序列参与细胞黏附和迁移，在Wang等人的研究“Circulating Vitronectin Predicts Liver Injury and Mortality in Children WithSepsis:A Prospective Observational Study”中已被证明在儿童脓毒症患者中，VTN的降低与肝功能损伤及不良预后相关。

细胞分裂控制蛋白42同源物(Cell division control protein 42 homolog，Cdc42)是小G蛋白家族中三个代表性鸟苷三磷酸酶之一，是维持和稳定屏障的主要蛋白。Cdc42可以由氧化应激、损伤等因素激活，可调节血管内皮与钙粘蛋白复合体的相互作用，影响肌动蛋白细胞骨架的重构、稳定血管内皮，也可以促进热蛋白(Pyrin)炎症小体的寡聚，诱导炎症信号的激活和放大，其功能与脓毒症病理生理机制潜在相关。

细胞质动力蛋白1重链1(Cytoplasmic dynein 1 heavy chain 1，DYNC1H1)是细胞内囊泡和细胞器微管逆行运输的动力蛋白，可能影响细胞外分泌功能。Pan等人的研究“DYNC1H1 regulates NSCLC cell growth and metastasis by IFN-γ-JAK-STATsignaling and is associated with an aberrant immune response”中报道肺癌组织中DYNC1H1高表达与临床肿瘤分期及远端转移显著相关，可作为肺癌的生物标志物。

POTE锚定域家族成员E(Prostate,ovary,testis-expressed protein ankyrindomain family member E,POTEE)是POTE锚蛋白结构域家族的成员，结直肠癌细胞系研究显示：高表达POTEE可激活Cdc42促进肿瘤细胞迁移，是潜在的粘附调控因子，其水平升高与不良预后直接相关。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种用于脓毒症早期预后评估的生物标志物及应用，本发明提供的生物标志物能够准确预测脓毒症患者的预后生存状况。

为实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种用于脓毒症早期预后评估的生物标志物，包括VTN蛋白、Cdc42蛋白、DYNC1H1蛋白和POTEE蛋白中的一种或多种。

本发明还提供了所述的生物标志物在制备脓毒症早期预后评估的试剂盒中的应用。

本发明还提供了检测所述的生物标志物的试剂在制备脓毒症早期预后评估的试剂盒中的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明通过对脓毒症患者的血清样本进行预后研究，发现VTN、Cdc42、DYNC1H1、POTEE是脓毒症的理想预后标志物，其与多种脓毒症器官功能障碍指标相关，且四种标志物的组合具有优于现有体系的预后预测的能力，可以作为脓毒症的新型预后评估体系。

附图说明

图1为DYNC1H1蛋白的丰度分布及对脓毒症患者14d的预后预测情况；

图2为POTEE蛋白的丰度分布及对脓毒症患者14d的预后预测情况；

图3为VTN蛋白的丰度分布及对脓毒症患者14d的预后预测情况；

图4为Cdc42蛋白的丰度分布及对脓毒症患者14d的预后预测情况；

图5为主要临床指标的相关性热图及其与4个预后生物标志物的相关性；

图6为基于VTN蛋白、Cdc42蛋白、DYNC1H1蛋白和POTEE蛋白的脓毒症预后预测系统的得分图；

图7为脓毒症预后得分高低两组患者的生存曲线；

图8为在训练集中预测脓毒症患者14d预后的ROC曲线；

图9为在验证集中脓毒症患者14d预后的ROC曲线。

具体实施方式

本发明提供了一种用于脓毒症早期预后评估的生物标志物，包括VTN蛋白、Cdc42蛋白、DYNC1H1蛋白和POTEE蛋白中的一种或多种。

本发明还提供了所述的生物标志物在制备脓毒症早期预后评估的试剂盒中的应用。

本发明还提供了检测所述的生物标志物的试剂在制备脓毒症早期预后评估的试剂盒中的应用。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

1.1选取159例血清样本，其中，125例作为训练集使用，具体的：35例为正常人的血清样本，50例为脓毒症存活患者的血清样本(Survivor组)，40例为脓毒症确诊24h内患者的血清样本(确诊后14d内死亡，Nonsurvivor组)；剩余的34例血清样本(作为验证集使用)为进行验证实验时使用的患者样本，其中，18例为脓毒症存活患者的血清样本，16例为脓毒症确诊24h内患者的血清样本(确诊后14d内死亡)。

所述脓毒症患者(包括脓毒症存活患者和脓毒症确诊24h内的患者)的血清样本为：2019年10月到2020年8月期间在郑州大学第一附属医院综合ICU住院的患者。

诊断标准：(1)符合美国重症医学会/欧洲危重病医学会制定的sepsis-3.0脓毒症诊断标准：a.疑似或确诊感染：临床医生诊断；b.急性器官功能障碍的证据：对于既往没有慢性器官功能不全的患者，假设其基线SOFA评分为0，SOFA≥2分；对于既往存在慢性器官功能不全的患者应根据基线情况进行SOFA评分，SOFA较基线升高≥2分；(2)入科后48h内诊断脓毒症。

14d内死亡的脓毒症患者：同期于郑州大学第一附属医院体检中心体检的年龄性别匹配的患者。

排除标准：(1)年龄小于18岁，或年龄大于80岁；(2)妊娠或哺乳；(3)纽约心脏病协会分级4级的充血性心力衰竭、非感染性心源性休克或未控制的急性失血；(4)晚期肺纤维化或研究入选前已接受无创通气；(5)实体器官或骨髓移植受者；(6)研究入选前72h内接受过心肺复苏；(7)中性粒细胞计数小于0.5×10

1.2吸取10μL血清样本，与190μL、25mM碳酸氢铵、血清样本4倍体积预冷的丙酮混合，涡旋20s，置于-40℃环境中沉淀蛋白1h，4℃、10000g离心10min，去上清，使用500μL预冷的80％丙酮润洗沉淀1次，4℃、10000g离心10min，去上清，向蛋白沉淀中加入600μL、25mM碳酸氢铵溶解沉淀，用BCA试剂盒(购自北京索莱宝科技有限公司)测定蛋白浓度，再用25mM碳酸氢铵调整蛋白浓度为0.5μg/μL，体积为200μL，加入终浓度为5mM的二硫苏糖醇(DTT，购自sigma公司)，混匀，置于55℃、700rpm孵育30min，加入胰蛋白酶Trypsin(Trypsin：蛋白＝1:50(w/w))，置于37℃、700rpm孵育2h，获得多肽。

1.3将多肽加入500μLACN平衡C

1.4用EASY-nLC 1200液相系统进行分离，使用在线Thermo QE HF-X质谱仪DDA模式进行检测。其中，

液相分离系统的参数如下：预柱：150μm*3cm C

质谱检测参数如下：扫描范围：150-2000m/z；数据采集模式：DDA采集方式，top20碎片图谱；MS1分辨率(200m/z)：60000；MS1 AGCtarget：3e

1.5数据分析及结果

为选择最适的预后相关特征组合，将脓毒症患病组队列(包括Survivor组及Nonsurvivor组)按照7:3的比例划分为训练集及验证集，在训练集中通过S、集合特征选择算法进行特征选择，该算法通过对多种二分类特征选择方法结果的归一化得分计算特征重要性得分，最终得分在0到1之间，得分越大代表变量对于区分结局的重要性越高，同时能够避免重要变量之间的自相关。

对于选择纳入Wilcoxon符号秩检验、Spearman秩相关检验、Pearson积矩相关检验、logsitic回归的β值和随机森林算法的基尼系数、错误率进行综合特征重要性得分计算。相关性系数阈值为0.7，随机森林进行500次运算。重要性得分通过堆积棒状图进行可视化。

为了选择具有最佳预后预测能力的最简组合，通过R包glmnet进行套索回归。将EFS算法重要性得分前30位的特征丰度作为输入，结局变量为二分类，弹性网络混合参数设置为1，计算0-1之内的100个惩罚系数λ值，通过三折交叉验证计算模型的均方误差，选择均方误差最小时对应λ加1倍标准差的值作为惩罚系数计算套索回归系数，以获得最简预后相关蛋白组合，回归系数>0的特征被输出进行后续分析。

通过发现队列的特征选择及变量缩减，发现DYNC1H1、POTEE、VTN、Cdc42四个血清蛋白具有最理想的脓毒症预后预测能力，它们在Survivor(Sepsis)组和Nonsurvivor组间差异均显著(P<0.001)。即4个血清蛋白的丰度与脓毒症的不良预后相关。结果如图1-4所示。

pearson相关性系数及检验相关性分析结果显示：4个血清蛋白预后标志物均与多种脓毒症器官功能障碍指标相关，提示与疾病严重程度具有良好的关联。结果如图5所示。

偏最小二乘回归分析(PLSDA)显示：基于四种蛋白标记物建立的预后预测模型能够很好区分预后差的脓毒症患者与治愈患者，此预测模型的得分直接影响患者的生存周期。结果如图6-7所示。

1.6验证集结果

ROC曲线结果(如图8-9所示)显示：基于4个生物标志物的脓毒症预后预测系统在验证集中的表现与训练集基本一致，均具有理想的脓毒症预后判断能力。

与脓毒症现有评估指标相比，基于4个生物标志物的脓毒症预后预测系统在样本全集中具有最佳的预后预测能力。具体评比内容如表1所示：

表1不同评估指标对于脓毒症预后的判断能力

注：“*”代表与4生物标志物相比，P<0.05。

实施例2

采用skyline软件分析实施例1测得质谱数据，得到蛋白代表性肽段的色谱保留时间，将该保留时间与目标肽段母离子和其相对应的碎片离子结合构建用于质谱检测时所采集的PRM离子列表。结果如表2-5所示。

表2VTN目标肽段的母离子及其对应的碎片离子

表3Cdc42目标肽段的母离子及其对应的碎片离子

表4DYNC1H1目标肽段的母离子及其对应的碎片离子

表5POTEE目标肽段的母离子及其对应的碎片离子

注：每个母离子都有多个碎片离子且每个碎片离子都可存在多个价态，本发明仅列出常规选取且相对丰度较高的1价或2价碎片离子。

实施例3

采用Trypsin[KR|P]酶解4个生物标志物后进行后续实验。

在质谱检测中亦可采用多种酶解样品的方案，如Trypsin(semi)[KR|P]；Trypsin/p[KR|-]；TrypsinK[K|P]；TrypsinR[R|P]；ChymoTrypsin[FWYL|P]；ArgC[R|P]；AspN[-|D]n-term；Clostripain[R|-]；CNBr[M|P]；Elastase[GVLIA|P]；FormicAcid[D|P]；GluC[DE|P]；GluCbicarb[E|P]；Iodosobenzoate[W|-]；LysC[K|P]；LysC/P[K|-]；LysN[-|K]n-term；LysNpromisc[-|KASR]n-term；PepsinA[FL|P]；Proteinendopeptidase[P|-]；Staphprotease[E|-]；Trypsin-CNBr[KRM|P]；Trypsin-GluC[DEKR|P]等。

(通过这些酶解或采用超声等物理方案处理后的样品也可检测。)

对基于生物标志物的早期脓毒症预后评估系统的快速血清生化检测方法：

将抗VTN抗体(Anti-Vitronectin Antibody,clone 8E6(LJ8),MAB88917)、抗Cdc42抗体(Monoclonal Anti-CDC42BPB antibody produced in mouse,WH0009578M1)、抗DYNC1H1抗体(Anti-DYNC1H1 antibody produced in rabbit，HPA003742)、抗POTEE抗体(Anti-POTE(C-term L446)antibody produced in rabbit，SAB1300545)(均购自sigma公司)用包被稀释液稀释到适当浓度，每孔加入100μL抗体，37℃孵育4h，弃去孔中液体，加入5％小牛血清，37℃封闭40min，(封闭时将封闭液加满各反应孔，并除去各孔中的气泡)，封闭结束后用洗涤液满孔洗涤3遍，每遍3min，吸干孔内反应液，将洗涤液注满孔板，放置2min略作摇动，吸干孔内液，倾去液体后在吸水纸上拍干，反复洗涤3次；加入血清样本样品，采用1:400的稀释度稀释样品，并保证样品的吸取量>20μL；将稀释好的样品加入酶标反应孔中，每份样品加双孔，每孔100μL，37℃孵育40min，再用洗涤液满孔洗涤3次，每次3min；再根据试剂盒提供的参考工作稀释度进行稀释，每孔加100μL稀释液，置于37℃孵育50min，(孵育时间短于30min会导致结果不稳定)，用洗涤液满孔洗涤3次，每次3min；加入100μL TMB-过氧化氢尿素溶液(购自AATBioquest公司，AAT-B11003)，每孔100μL，37℃避光放置3min，每孔加入50μL终止液显色，终止反应，于20min内测定实验结果。

显色后在450nm波长处检测TMB反应产物。

根据标准品曲线获得血清蛋白浓度，进行脓毒症患者预后评估。

实施例4

将实施例1采集的血清样本按照实施例1的方式进行处理。

在使用EASY-nLC1200液相系统进行分离，使用在线Thermo QE HF-X质谱仪检测时，设定液相分离系统参数为：预柱：75μm*2cm PepMap C

设定质谱检测参数为：数据采集模式：PRM采集方式，top20碎片图谱；MS2分辨率(200m/z)：30000；MS2AGCtarget：2e

调整质谱参数后，根据实施例2中的表2-5快速检测样本；

采用skyline、SpectroDive、spectranaut等分析软件中的一种分析质谱测定结果(分析获得的是蛋白快速检测代表肽段的定量信息，即丰度)。

根据软件分析出的患者血清中4种生物标志物的代表肽段的信号强度代表绝对量，判定患者预后。

若响应值，VTN>1.461799×10

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。