借助疏水性二氧化硅从含有脂质的生物质中分离脂质的方法

本发明涉及借助疏水性二氧化硅从含有脂质的生物质中分离脂质的方法。

含PUFA(多不饱和脂肪酸)的脂质在饲料、食品和制药行业中受到高度关注。由于过度捕捞，对除鱼油之外的含有PUFA的脂质的替代来源也存在很高需求。事实证明，除了某些酵母和藻类菌株外，特别是破囊壶菌目(Thraustochytriales)那样的微藻细胞是含有PUFA的脂质的非常好的来源。

但是对于微生物有机体，特别是产生含PUFA的脂质的破囊壶菌目细胞，从细胞中分离油是一个特别的问题。分离油的最有效方法是使用像己烷的有机溶剂。但有机溶剂的使用导致危险的操作条件，需要使用昂贵的防爆设备并需要实施昂贵的溶剂回收过程，以避免环境污染。

为了避免使用有机溶剂，作为分离油的有效替代方法，已经证明了用大量氯化钠对油进行盐析。但使用大量氯化钠会导致脱脂生物质的副产物，其由于高盐含量不能用作饲料成分，因此该过程不是可持续性的。此外，高盐浓度导致所用钢制设备的快速腐蚀。

因此，本发明的目的是提供一种有效方法，其用于从含有脂质的细胞，特别是破囊壶菌目的细胞中分离脂质，特别是含有PUFA的脂质，和同时不仅避免了对有机溶剂的需求，而且还避免了对大量盐的需求，并且优选也避免了使用大量碱和/或高pH值，以实现从细胞中有效分离油。

本发明的另一个目的是提供一种方法，其用于从含有脂质的细胞，特别是破囊壶菌目的细胞中分离脂质，特别是含有PUFA的脂质，和同时提供一种可以以商业方式，优选在农业领域中使用的脱脂生物质。

结果证明，如果将生物质，特别是裂解后的生物质与疏水性二氧化硅共同孵育，优选在约中性pH，在50℃与100℃之间的温度，就可以实现从生物质中有效分离脂质。通过保持温度低于100℃和避免高pH值，可以至少基本上禁止脂肪酸酯的皂化。因此，提供了一种从生物质细胞中分离脂质的环境友好、可持续和温和的方法。

由于进一步不需要应用碱性条件，因此不需要添加碱性试剂和有机溶剂，获得了含有非常低量盐和/或基本上不含有机溶剂的生物质，并证明对特别是农业领域的应用非常有用。

因此，本发明的第一个主题是一种从含有脂质的生物质中分离脂质的方法，该方法包括以下步骤：

a)提供生物质悬浮液，其中生物质的细胞平均含有至少10重量％的脂质；

b)任选地裂解该生物质的细胞；

c)向该悬浮液中加入疏水性二氧化硅；

d)将由此所得的悬浮液加热至至少50℃，特别是50至100℃，优选65至95℃，并将悬浮液孵育至少20分钟，优选20分钟至30小时，特别是30分钟至26小时，更优选1小时至24小时、2至20小时、3至15小时，或4至10小时；

e)将含有油的轻相与含有细胞碎片的水相分离。

优选地，如所述的顺序执行步骤，但任选地，可以在悬浮液裂解前加入疏水性二氧化硅，或者另一方面，可以在悬浮液已经加热后加入疏水性二氧化硅。

优选地，在加入疏水性二氧化硅或前或后，则将生物质悬浮液浓缩至20至60重量％的总干物质含量，如果总干物质(TDM)含量超出此这一范围的话。

因此，本发明的优选主题是一种从含有脂质的生物质中分离脂质的方法，该方法包括以下步骤：

a)提供包括生物质的细胞的悬浮液，该细胞含有包含PUFA的脂质；

b)任选地裂解该生物质的细胞；

c)如果该悬浮液具有较低的总干物质(TDM)含量，则将该悬浮液浓缩至20至60重量％，优选25至60重量％，更优选30至55重量％的TDM含量；

d)向该悬浮液中加入疏水性二氧化硅；

e)将由此所得的悬浮液加热至至少50℃，特别是50至100℃，优选65至95℃，并将悬浮液孵育至少20分钟，优选20分钟至30小时，特别是30分钟至26小时，更优选1小时至24小时、2至20小时、3至15小时，或4至10小时；

f)通过机械方法将被释放的油与含有细胞碎片的水相分离。

在本发明的这一实施方案中，(a)至(f)步骤优选按照所述顺序进行。但优选地，也可以在细胞裂解前执行该生物质的浓缩，或悬浮液裂解和/或浓缩前加入疏水性二氧化硅，或者另一方面，可以在该悬浮液已经加热后加入疏水性二氧化硅。

裂解该细胞、浓缩该悬浮液、加入该疏水性二氧化硅和用疏水性二氧化硅孵育该悬浮液的步骤优选在机械混合下进行，优选通过搅拌或搅动相应的悬浮液进行。可以通过使用搅拌器和/或搅动器相应地进行搅拌和/或搅动。特别是可以应用低剪切搅动和/或轴向流搅动，特别是如WO2015/095694中所公开的。适用于搅动的叶轮包括特别是包括直叶片式叶轮、Rushton叶片式叶轮、轴流式叶轮、径流式叶轮、凹形叶片盘式叶轮、高效叶轮、螺旋桨、桨叶、涡轮机及其组合。

在根据本发明的方法中，二氧化硅的加入导致该悬浮液中所含乳剂的破裂成含有油的轻相和含有水、细胞碎片和盐的重相。在本申请上下文中，乳剂的这一破裂也被称为“破乳”。

在本发明的优选实施方案中，向该悬浮液中加入疏水性二氧化硅，以调节该悬浮液中疏水性二氧化硅的最终浓度在0.005-0.25重量％之间。特别是，加入一定量的疏水性二氧化硅，以调节最终浓度在0.008-0.20重量％之间，优选0.012-0.15重量％，更优选0.015-0.10重量％。

根据本发明，“疏水性二氧化硅”可以是指单一种类的疏水性二氧化硅或不同种类的疏水性二氧化硅的混合物。

疏水性二氧化硅的登记号为CAS No.68611-44-9且是市售的，例如，商品名为

根据本发明优选使用的疏水性二氧化硅的甲醇润湿性为至少40％，优选至少45％，特别优选至少50％，特别是40-65％，尤其是45-60％。

该甲醇润湿性是二氧化硅粉末疏水性的测量量度。为测定这一值，称取一定量的二氧化硅粉末至水中。在此，该二氧化硅粉末保留在表面上。然后测定润湿粉末所需的甲醇量。在此，“甲醇润湿性”应被理解是指甲醇水混合物的甲醇含量，其以体积％表示，其中沉积了50％的疏水性二氧化硅。

根据本发明的疏水性二氧化硅的装填密度(未筛分；基于ISO 787-11)优选为100至200g/l，优选125至175g/l。该疏水性二氧化硅的粒度(d50；激光衍射；基于ISO 13320-1)优选为2至50μm，更优选5至20μm，特别是8至15μm。该疏水性二氧化硅的干燥失重(105℃下2小时；基于ISO 787-2)优选为至多10％，特别优选至多6％。该疏水性二氧化硅的灼烧损失(1000℃下2小时；基于ISO 3262-1)优选为至多10％，特别优选至多6％。

该疏水性二氧化硅的二氧化硅含量优选为至少95重量％，特别是至少97重量％(基于ISO 3262-19)。该疏水性二氧化硅的碳含量优选为至多3.5重量％，特别是0.2至3.5重量％，特别至多2重量％，特别是0.5至2重量％(基于ISO 3262-19)。该疏水性二氧化硅的pH值(5％的水和甲醇的1:1混合物；基于ISO 787-9)，优选为7至10.5，特别是7.5至9。

例如，可以根据发明使用的疏水性二氧化硅的商品名为

在本发明的优选实施方案中，该疏水性二氧化硅以破乳剂混合物的形式来使用，该混合物除疏水性二氧化硅外还含有至少一种表面活性剂。该至少一种表面活性剂可以选自非离子表面活性剂、阴离子表面活性剂、两性离子表面活性剂、两性表面活性剂和阳离子表面活性剂。在本发明的优选实施方案中，至少一种表面活性剂优选为非离子表面活性剂。

优选的阴离子表面活性剂是烷基硫酸盐、烷基聚乙二醇醚硫酸盐和烷基聚乙二醇醚羧酸(在烷基基团中有10至18个C原子和在该分子中有多达12个乙二醇醚基团)，磺基琥珀酸单烷基酯和二烷基酯(在烷基基团中有8至18个C原子)，在烷基基团中具有8至18个C原子和具有1至6个氧乙烯基团的磺基琥珀酸单烷基聚氧乙酯，单甘油酯硫酸盐、烷基和烯基醚磷酸盐以及蛋白质和脂肪酸的缩合物。

两性离子表面活性剂在该分子中携带至少一个季铵基团和至少一个-COO<->-或SO3<->基团。特别适合的两性离子乳化剂是所谓的甜菜碱类，如N-烷基-N,N-二甲基甘氨酸铵、N-酰基-氨基丙基-N,N-二甲基甘氨酸铵和2-烷基-3-羧甲基-3-羟乙基-咪唑啉(各自在烷基或酰基中有8至18个碳原子)，以及椰油酰氨基乙基羟乙基羧甲基甘氨酸盐。

根据本发明可用的示例性非离子表面活性剂为直链或支链C8-C30脂肪酸及其Na、K、铵、Ca、Mg和Zn盐；脂肪酸烷醇酰胺；脂肪酸葡萄糖酰胺(fatty acid glucamides)；N-烷基葡萄糖酰胺；和C8-C22烷基胺-N-氧化物。

根据本发明优选的非离子表面活性剂是烷氧基化的化合物，特别是乙氧基化和/或丙氧基化的化合物，优选乙氧基化的化合物，以及烷基化糖，和特别是烷氧基化烷基化糖。

烷氧基化化合物的示例是烷氧基化脂肪醇、糖醇、脂肪酸、烷基酚、蓖麻油、氢化蓖麻油、脂肪酸烷醇酰胺和脂肪酸胺；特别是直链C8-C22脂肪醇上、C12-C22脂肪酸上和C8-C15烷基酚上的4至30摩尔环氧乙烷和/或0至5摩尔环氧丙烷的加成产物；C3-C6多元醇(特别是甘油)，环氧乙烷和聚甘油上C12-C22脂肪酸单酯和二酯的1至30摩尔环氧乙烷加成产物；甲基葡萄糖苷脂肪酸酯上的加成产物，蓖麻油和氢化蓖麻油上5至60摩尔环氧乙烷的加成产物，含3-6个碳原子的多元醇与C8-C22脂肪酸的部分酯；脂肪酸烷醇酰胺和脂肪酸胺的1至30摩尔环氧乙烷的加成产物。

烷氧基化化合物的更多示例为式R<1>CO-(OCH2CHR<2>)xOR<3>的烷氧基化脂肪酸烷酯，其中R<1>CO代表具有6至22个碳原子的直链或支链、饱和和/或不饱和酰基基团，R<2>代表氢或甲基，R<3>代表具有1至4个碳原子的直链或支链烷基基团，和x代表1至20的数字。

非离子表面活性剂的更多示例为烷基单糖苷、寡糖苷和多糖苷，其对应于通式RO-(Z)x，其中R代表C8-C22烷基，特别是C8-C16烷基，Z代表糖，x代表糖单元数。

任何单糖、寡糖或多糖都可以作为糖构建模块Z加入。通常情况下，加入具有5个或6个碳原子的糖以及相应的寡糖，例如葡萄糖、果糖、半乳糖、阿拉伯糖、核糖、木糖、来苏糖、阿洛糖、阿卓糖、甘露糖、古洛糖、艾杜糖、塔罗糖和蔗糖。优选的糖构建模块是葡萄糖、果糖和蔗糖，其中葡萄糖是特别优选的。本发明可用的烷基多糖苷包括平均1.1至5个，优选1.1至2.0个，特别是优选1.1至1.8个的糖单元。根据本发明也可以使用所引用的烷基多糖苷的烷氧基化同系物。这些同系物优选包括平均多达10个环氧乙烷和/或环氧丙烷单元/烷基糖苷单元。

在本发明的非常优选的实施方案中，使用糖醇的脂肪酸酯和/或此类化合物的烷氧基化衍生物作为非离子表面活性剂。在这一情况下，优选的糖醇为甘油、聚甘油、山梨糖醇、异山梨醇(isosorbide)和脱水山梨糖醇(sorbitan)，尤其是1,4-脱水山梨糖醇。此类糖醇脂肪酸酯的示例为聚甘油-2-二聚羟基硬脂酸酯和聚甘油-3-二异硬脂酸酯。

此类糖醇脂肪酸酯的非常优选的示例为脱水山梨糖醇(特别是1,4-脱水山梨糖醇)与C12-C22脂肪酸(优选C16-C18脂肪酸)的酯，其中酯键优选与该脱水山梨糖醇的ω羟基基团形成。

特别的示例为脱水山梨糖醇单月桂酸酯、脱水山梨糖醇单棕榈酸酯、脱水山梨糖醇单硬脂酸酯、脱水山梨糖醇单油酸酯、脱水山梨糖醇倍半油酸酯、脱水山梨糖醇三油酸酯和脱水山梨糖醇异硬脂酸酯，其中脱水山梨糖醇单油酸酯是特别优选的。脱水山梨糖醇单油酸酯为市售的，其商品名为

此类糖醇的烷氧基脂肪酸酯的非常优选的示例为乙氧基化脱水山梨糖醇(特别是乙氧基化1,4-脱水山梨糖醇)与C12-C22脂肪酸的，优选与C16-C18脂肪酸的酯，其中脱水山梨糖醇的所有游离羟基基团优选携带1至5个(优选1至3个)乙氧基化基团，和其中脂肪酸键与脱水山梨糖醇的乙氧基化ω羟基形成。这些化合物也被称为聚山梨醇酯。特别的示例为PEG-20脱水山梨糖醇单月桂酸酯、PEG-4脱水山梨糖醇单月桂酸酯、PEG-20脱水山梨糖醇单棕榈酸酯、PEG-20脱水山梨糖醇单硬脂酸酯、PEG-4脱水山梨糖醇单硬脂酸酯、PEG-20脱水山梨糖醇三硬脂酸酯和PEG-20脱水山梨糖醇单油酸酯，其中PEG-20脱水山梨糖醇单油酸酯是特别优选的。PEG-20脱水山梨糖醇单油酸酯，也称为聚山梨醇酯80，其为市售的，商品名

在本发明的优选实施方案中，在该破乳剂组合物中使用至少两种非离子表面活性剂的混合物。优选地，在该破乳剂组合物中，使用低HLB(优选低于8，特别是3至6)的非离子表面活性剂和高HLB(优选高于12，特别是13至17)的非离子表面活性剂的混合物。这一混合物的优选示例为

合适的HLB低于8的乳化剂为通式R<1>-O-R<2>的特定化合物，其中R<1>是具有18至30个碳原子的伯直链烷基、烯基或酰基基团，像山嵛基、芥子基(erucyl)或花生基(arachidyl)基团，和R<2>是氢，一组x＝1或2且n＝2至4的式-(CnH2nO)x-H或具有4至6个碳原子和2至5个羟基基团的聚羟基烷基基团，像季戊四醇、三羟甲基丙烷、双甘油或甲基葡萄糖。

在将该疏水性二氧化硅与至少一种表面活性剂组合用作破乳剂混合物的情况下，疏水性二氧化硅与表面活性剂的比优选从1:50至50:1变化。在本发明的优选实施方案中，该疏水性二氧化硅以1重量％至50重量％，优选2至25重量％，特别是3至15重量％的量包含在破乳剂混合物中。

优选地，该表面活性剂形成破乳剂混合物的残留部分，但除表面活性剂外，其他成分还可以包括在破乳剂混合物中，例如，以调节破乳剂混合物的物理性质。

在本发明的非常优选的实施方案中，使用破乳剂混合物，其包括量为3至15重量％的疏水性二氧化硅，和量至少为85重量％的至少一种(优选两种)非离子表面活性剂，其中该非离子表面活性剂优选选自糖醇和/或此类化合物的烷氧基化衍生物的脂肪酸酯，特别是选自脱水山梨糖醇的脂肪酸酯(优选脱水山梨糖醇单油酸酯)和脱水山梨糖醇的乙氧基化脂肪酸酯(优选PEG-20脱水山梨糖醇单油酸酯)、及其混合物。

在本发明的另一个优选实施方案中，该疏水性二氧化硅与油组合使用，特别是与含有甘油三酯的油(如微藻油或植物油)组合使用，其中植物油的示例为大豆油、菜籽油和玉米油。如果该疏水性二氧化硅与油组合使用，则该疏水性二氧化硅与油的比优选从1:50至50:1变化，特别是从1:1至1:20变化。

在本发明的特定实施方案中，该疏水性二氧化硅与至少一种非离子表面活性剂组合使用，和同时与至少一种油组合使用，特别是与至少一种含有甘油三酯的油组合使用。

根据本发明，无需升高或降低pH值，优选在约中性pH下进行该反应，以建立避免脂质皂化的温和条件。因此，该pH值优选保持在5至9之间，更优选6至8之间，和非常优选6.5至8.0之间。在发酵液的情况下，为方便起见，在发酵结束后，可以使用发酵液，而无需调节该pH值。

如有必要或需要，可以使用碱或酸调节该pH值。

通常，根据本发明，可以使用本领域技术人员已知的碱或酸来调节该pH值。通过使用有机或无机酸(像硫酸、硝酸、磷酸、硼酸、盐酸、氢溴酸、高氯酸、次氯酸、亚氯酸、氟硫酸、六氟磷酸、乙酸、柠檬酸、甲酸或其组合)，可以降低该pH值。由于希望避免高含量的氯化物，在本发明的优选实施方案中，在本发明的过程中不使用或仅使用少量的盐酸。根据本发明，硫酸是降低该pH值的优选物质。通过使用有机或无机碱(像氢氧化物，特别是氢氧化钠、氢氧化锂、氢氧化钾和/或氢氧化钙；碳酸盐，特别是碳酸钠、碳酸钾或碳酸镁；和/或碳酸氢盐，特别是碳酸氢锂、碳酸氢钠和/或碳酸氢钾)，可以升高该pH值。由于易于处理，酸和碱优选以液体形式使用，特别是作为浓缩液，其中该溶液中酸或碱的浓度优选在10至55重量％范围内，特别是在20至50重量％范围内。特别是，硫酸也优选以浓缩的形式使用。

根据本发明，在提供根据步骤(a)的悬浮液后，优选进行裂解步骤。在没有任何明确的裂解步骤的情况下，如果(例如，由于所应用的发酵条件)细胞或其大部分在以下程序的一个步骤中已经裂解或易于破裂，，则可以省略裂解步骤。

根据步骤(b)，可以通过本领域技术人员已知的方法(特别是酶学、机械、物理或化学方法，或通过应用其组合)裂解该生物质的细胞。

根据暴露时间和/或施加的力量的程度，可以获得仅包括裂解细胞的组合物或包括细胞碎片和完整细胞混合物的组合物。术语“含有裂解脂质的生物质”是指含有水、由生物质细胞释放的细胞碎片和油的悬浮液，但除此之外，还可以包括其他组分，特别是盐、完整细胞、裂解细胞的进一步内容物，以及发酵培养基的组分，特别是营养物质。在本发明的优选实施方案中，在细胞裂解步骤后，裂解的生物质中仅存在少量完整细胞，特别是小于20％，优选小于10％，更优选小于5％(相对于裂解生物质细胞之前存在的完整细胞总数)。

例如，使用弗氏细胞压碎器、超声仪、均质器、微流化器、球磨机、棒磨机、砾磨机、珠磨机、高压研磨辊、垂直轴撞击器、工业搅拌器、高剪切混合器、桨式混合器和/或polytron均质器，可以实现该细胞的裂解。

在本发明的优选实施方案中，该细胞的裂解包括通过应用细胞壁降解酶对该细胞进行酶处理。

根据本发明，该细胞壁降解酶优选选自蛋白酶、纤维素酶(例如，Cellustar CL(Dyadic)、Fibrezyme G2000(Dyadic)、Celluclast(Novozymes)、Fungamyl(Novozymes)、Viscozyme L(Novozymes))、半纤维素酶、几丁质酶、果胶酶(例如，Pectinex(Novozymes))、蔗糖酶、麦芽糖酶、乳糖酶、α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、淀粉酶(例如，Alphastar Plus(Dyadic)；特妙淀粉酶(Termamyl，Novozymes))、溶菌酶、神经氨酸苷酶、半乳糖苷酶、α-甘露糖苷酶、葡萄糖醛酸苷酶(glucuronidases)、透明质酸酶、普鲁兰酶、葡萄糖脑苷脂酶、半乳糖神经酰胺酶(galactosylceramidases)、乙酰半乳糖胺酶(acetylgalactosaminidases)、岩藻糖苷酶、己糖胺酶、艾杜糖醛酸苷酶(iduronidases)、麦芽糖酶葡萄糖淀粉酶、木聚糖酶(例如，Xylanase Plus(Dyadic)、Pentopan(Novozymes))、β-葡聚糖酶(例如，Vinoflow Max(Novozymes)、Brewzyme LP(Dyadic))、甘露聚糖酶、及其组合。该蛋白酶可以选自丝氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、谷氨酸蛋白酶、碱性蛋白酶(枯草杆菌蛋白酶)、及其组合。该几丁质酶可以为壳三糖酶。该果胶酶可以选自果胶溶解酶(pectolyases)、半乳糖醛酸酶(pectozymes)、多聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonases)、及其组合。

利用酶的适当pH值取决于该酶的最适pH。

在本发明的优选实施方案中，使用最适pH值在7.0和9.0之间，特别是约7.5的酶，从而在该步骤中应用的pH为7.0至9.0，特别是7.0至8.0，优选7.3至7.7。可以用于这一pH范围的优选酶是碱性蛋白酶。

该酶优选以浓缩酶溶液的形式加入，优选其量为0.01至1.5重量％，更优选其量为0.03至1.0重量％，尤其其量为0.05至0.5重量％，与加入的浓缩酶溶液的量相关(该浓缩酶溶液与加入浓缩酶溶液后的悬浮液的总量相关)。

在本发明的非常优选的实施方案中，该细胞的裂解如下进行：

i)加热(a)的悬浮液至50℃至70℃之间的温度，优选55℃至65℃之间的温度，并向悬浮液(特别是发酵液)中加入细胞壁降解酶，必要时调节适当的pH值，使酶在其下正常工作；

ii)将温度和pH值保持在(ii)所述范围内至少1小时，优选至少2小时，更优选2至4小时。

在步骤(i)中，可以在加热悬浮液之前或之后和/或调节该pH值之前或之后加入酶。同样，可以在调节该pH值之前或之后加热悬浮液。但是在优选的实施方案中，在悬浮液加热后和在调节pH值后加入酶，如果非常有必要调节pH值的话。在非常优选的实施方案中，或多或少同时进行所有测量。

优选地，在步骤(i)和(ii)中通过使用搅拌器和/或搅动器，连续混合悬浮液。

根据本发明，优选地使用干物质含量为20至60重量％，优选25至60重量％，特别是30至55重量％或30至45重量％的悬浮液，进行破乳。这可以通过在步骤(a)中提供具有适当高生物量的悬浮液或通过浓缩悬浮液实现，特别是在裂解生物质细胞后。因此，在本发明的优选实施方案中，在任选存在的生物质细胞裂解后和破乳步骤之前，将悬浮液浓缩至总干物质含量为20至60重量％，更优选25至60重量％，特别是30至55重量％，尤其30至50重量％或30至45重量％。

通过在不高于100℃，优选70℃至100℃，更优选80℃至90℃的温度下蒸发水，优选地进行悬浮液的浓缩，直到总干物质含量到达20至60重量％，更优选25至60重量％，特别是30至55重量％或30至45重量％。

优选地，在强制循环蒸发器(例如，购自德国的GEA)中浓缩悬浮液，以快速除去水。或者或另外，通过降膜蒸发、薄膜蒸发和/或旋转蒸发，可以进行浓缩。

根据本发明的方法包括如下作为进一步的步骤：通过从含有水、盐、细胞碎片和残留油的水相分离含有油的轻相，从破乳组合物中收获含有PUFA的脂质。

如果未在中性pH下进行破乳，则收获含有PUFA的脂质可以包括作为中和破乳悬浮液的任选步骤。

如有必要或需要，优选地，通过加入酸(优选硫酸)或碱(优选烧碱)，调节该pH值为5至9，优选5.5至8.5，特别是6.0至8.0或6.5至7.5，以中和破乳组合物。在开始分离轻相和水相之前，可以在这一中和pH下搅拌中和该组合物数分钟至多数小时。

优选地，通过机械方法和优选在60-90℃，更优选在70-80℃的温度下，和优选在6-9，更优选在7-8.5的pH值下，实现含有油的轻相与含有水、盐和细胞碎片的重相的分离。“机械方法”特别是指本领域技术人员熟知的过滤和离心方法。

在分离含有油的轻相后，可以通过应用本领域技术人员已知的方法(特别是精炼、漂白、除臭和/或冻凝(winterizing))进一步加工由此所得的含有PUFA的油。

本发明方法的特别优点为可以在不使用任何有机溶剂(特别是不使用任何极性或非极性有机溶剂)的情况下进行。因此，在本发明的优选实施方案中，不使用或仅使用少量有机溶剂，特别是极性或非极性的有机溶剂，用于从生物质中分离含有PUFA的油。典型的有机溶剂为己烷和乙醇。

在本发明的优选实施方案中，使用小于2重量％的非极性有机溶剂，更优选小于1重量％、0.5重量％或0.1重量％。在本发明的特别优选的实施方案中，根本不使用非极性有机溶剂。在本发明的优选实施方案中，通常使用小于2重量％的机溶剂，特别优选小于1重量％、0.5重量％或0.1重量％。在本发明的非常优选的实施方案中，对于从生物质中分离含有PUFA的油，根本不使用有机溶剂。这特别是意味着对于这一实施方案，通常，在根据本发明方法中使用的悬浮液以及通过所述单一方法步骤获得的所有组合物优选含有非极性有机溶剂，优选有机溶剂，其量小于2重量％，更优选小于1重量％，特别是小于0.5重量％或0.3重量％，尤其其量小于0.1或0.05重量％。

本发明方法的另一个优点是，在不加入氯化钠的情况下，可以实现油与剩余生物质的非常有效的分离，而氯化钠通常用于从生物质中对油进行盐析。优选地，该方法在根本不加入氯盐的情况下进行，尤其是不加入任何盐以对油进行盐析。但由于发酵培养基用于生物质的生长，该悬浮液中可以存在少量氯盐，特别是氯化钠。

因此，在本发明的优选实施方案中，不使用或仅使用少量氯化钠来改善油的分离。在本发明的优选实施方案中，对于从生物质中分离油，使用小于1重量％的氯化钠，更优选使用小于0.5重量％或0.2重量％的氯化钠，尤其小于0.1重量％或0.05重量％，其中重量％与加入氯化钠后该组合物的总重量有关。这特别意味着对于这一实施方案，在根据本发明方法中使用的悬浮液以及通过所述单一方法步骤获得的所有组合物优选含有氯化钠，其量小于2重量％，更优选小于1重量％，特别是小于0.5重量％或0.3重量％，尤其其量小于0.1重量％或0.05重量％。

在本发明的特别优选的实施方案中，根本不使用或仅使用少量的氯盐来改善油的分离。在这一实施方案中，优选地，对于从生物质中分离油，使用小于1重量％的氯盐，更优选使用小于0.5重量％或0.2重量％的氯盐，尤其小于0.1重量％或0.05重量％，其中重量％与加入氯盐后该组合物的总重量有关。这特别意味着对于这一实施方案，在根据本发明方法中使用的悬浮液以及通过所述单一方法步骤获得的所有组合物优选含有氯化物，特别是氯盐，其量小于2重量％，更优选小于1重量％，特别是小于0.5重量％或0.3重量％，尤其其量小于0.1重量％或0.05重量％。

在本发明的非常优选的实施方案中，通常，根本不使用或仅使用少量的盐来改善油的分离。在这一实施方案中，优选地，对于从生物质中分离油，使用小于1重量％的盐，更优选使用小于0.5重量％或0.2重量％的盐，尤其小于0.1重量％或0.05重量％，其中重量％与加入盐后该组合物的总重量有关。优选地，这特别意味着对于这一实施方案，在根据本发明方法中使用的悬浮液以及通过所述单一方法步骤获得的所有组合物优选含有盐，通常其量小于2重量％，更优选小于1重量％，特别是小于0.5重量％或0.3重量％，尤其其量小于0.1重量％或0.05重量％。

本发明方法的另一个优点是，在不加入碱(像烧碱)的情况下，可以实现油与剩余生物质的非常有效的分离，而该碱通常用于破裂乳剂。优选地，该方法在不加入碱的情况下进行，因此也不需要随后悬浮液的中和。这确实会导致生物质只含有相对少量的盐，通常其只包括少量的灰分。但是可以加入少量的碱，特别是用于调节该pH，例如，如果发酵后悬浮液的pH值过低，或为了促进破乳过程。这意味着在本发明的优选实施方案中，根据本发明的方法中不用或仅使用少量的碱。在本发明的优选实施方案中使用小于4重量％的碱，更优选在根据本发明的方法中使用小于2重量％或1重量％的碱，尤其小于0.5重量％或0.2重量％，其中重量％与加入碱后该组合物的总重量有关。

但是，在本发明的另一个实施方案中，可以加入苛性剂，特别是烧碱，优选的是少量，以促进破乳并提高最终的油产率。

由于可以在不使用碱的情况下进行破乳，在本发明的优选实施方案中，在整个过程中，优选保持pH值低于9，特别是低于8.5、8或7.5的pH值，这允许在非常温和的条件下处理脂质，并大幅降低脂质中所含脂肪酸酯的水解程度。因此，在本发明的优选实施方案中，在整个过程中，保持pH值低于9，特别是在4.5至9的范围内，优选低于8.5、8或7.5，特别是在4.5至8.5、4.5至8或4.5至7.5的范围内。

本发明的方法可以非常有效地将生物质中所含的油与悬浮液(特别是发酵液)中所含的细胞碎片和其他物质分离。通过使用本发明的方法，生物质中所含的优选超过80重量％，特别是超过90重量％的油可以与生物质分离，并通过应用非常经济和可持续的条件来分开。

优选地，通过脂肪酸甲酯分析(FAME)，测定所释放油的产率。为此，首先用KOH皂化样品中的脂质。之后，使用MeOH甲基化游离脂肪酸。然后，使用内标物通过气相色谱法，可以测定和定量甲基化脂肪酸。

进一步证明，通过应用本发明方法获得的油比目前最新技术水平公开的含有PUFA的油具有一些优势特征。特别是，它表现出非常低的氧化值和非常低的游离脂肪酸含量。此外，由于制备方法，该油中含有一定量的疏水性二氧化硅。

因此，本发明的另一个主题是根据本发明通过方法获得或可获得的油。

因此，本发明的另一个主题也是油，优选含有PUFA的油，其包括疏水性二氧化硅，其量为5ppm(w/w)至10重量％，优选10ppm(w/w)至5重量％，特别是0.01重量％至4重量％，0.1重量％至3重量％或0.5重量％至2.5重量％。

在非常优选的实施方案中，仅使用少量疏水性二氧化硅来破裂乳剂，因此本发明的特定实施方案为含有PUFA的油，其包括疏水性二氧化硅，其量为5至200ppm(w/w)，优选10至150ppm(w/w)，更优选20至100ppm(w/w)，特别是20至80ppm(w/w)。

根据本发明的油优选包括PUFA，其量为至少10重量％，优选至少20重量％，特别是25重量％至70重量％，30重量％至65重量％或45重量％至60重量％。

根据本发明的油优选包括游离脂肪酸(FFA)，其量为小于1重量％，优选小于0.8重量％，更优选小于0.5重量％。在分离含有TAG的脂质(优选被避免)时，游离脂肪酸是不希望的副产物。

因此，本发明的另一个主题也是一种油，特别是含有PUFA的油，其包括脂肪酸酯(特别是TAG)，其量为至少50重量％，优选至少70重量％或80重量％，特别是其量至少为85重量％或90重量％，其特征在于包括游离脂肪酸(FFA)，其量小于0.6重量％，优选其量小于1重量％，特别是其量小于0.8重量％，更优选其量小于0.5重量％。

因此，本发明的另一个主题也是一种含有PUFA的油，其表现出以下特征：a)疏水性二氧化硅，其量为5ppm(w/w)至10重量％，优选10ppm(w/w)至5重量％，特别是0.01重量％至4重量％，0.1重量％至3重量％或0.5重量％至2.5重量％；b)优选地，游离脂肪酸含量小于1重量％，优选小于0.8重量％，特别是小于0.5重量％；c)优选地，过氧化值小于0.5，更优选小于0.3，特别是小于0.15；d)优选地，茴香胺值小于15，更优选小于10；e)优选地，水分含量和杂质含量小于1重量％，优选小于0.5重量％；f)优选地，粘度小于250cps，更优选小于200cps，特别是小于160cps；g)优选地，闪点为至少350℃，更优选至少400℃，特别是至少450℃；h)优选地，ω-3脂肪酸(特别是DHA和EPA)的含量为至少35重量％，优选至少40重量％或45重量％，尤其至少50重量％；i)优选地，DHA和EPA，各自的量为至少8重量％，优选至少10重量％，尤其至少15重量％；j)优选地，三酰甘油含量为至少50重量％，特别是至少70重量％或80重量％，更优选至少90重量％；k)优选地，有机溶剂的量小于0.5重量％，更优选小于0.1重量％，特别是小于0.05重量％，尤其小于0.01重量％；l)优选地，氯化物的量小于0.1重量％，更优选小于0.05重量％，特别是小于0.01重量％；m)优选地，粗脂肪含量超过90重量％。

根据AOCS官方方法Cd 18-90，测定茴香胺值(AV)。AV是油氧化期间脂肪酸副反应产物(如醛和酮)的测量量度。

根据AOCS官方方法CD 8-53，测定过氧化值(PV)。PV是油氧化期间主要反应产物(如过氧化物和氢过氧化物)的测量量度。根据发明，PV以meq/kg计量。

根据AOCS官方方法AOCS Ca 5a-40，测定游离脂肪酸的含量。根据AOCS官方方法AOAC 930.15、935.29，测定水分含量。根据AOCS官方方法AOCS 3a-46，测定不溶性杂质的含量。根据AOCS官方方法AOCS Ce 1b-89，测定DHA和EPA的含量。根据AOCS官方方法AOCS996.06，测定总脂肪量。根据AOCS官方方法AOAC 920.39、954.02，测定粗脂肪量。

由于油的分离是通过不使用或仅使用少量溶剂以及也不使用或仅使用少量氯化钠进行的，因此作为副产物获得的水相优选也基本不含有机溶剂和氯化钠。因此，水相可以以不同的方式使用，或在油相分离后直接使用，或在进一步处理(像浓缩和/或干燥)后使用。

因此，本发明的另一个主题是一种含有脂质(特别是PUFA)的含水悬浮液，其含有生物质，优选脱脂生物质，正如根据本发明方法获得的或可获得的。因此，本发明的另一个主题也是一种通过浓缩和/或干燥这一含水悬浮液获得或可获得的浓缩液或干燥产物。当浓缩该含水悬浮液时，优选干燥直到总干物质(TDM)含量达到20-60重量％。在下文中，表达“根据发明的含水悬浮液”是指正如油相分离后获得的水相以及正如通过浓缩这一水相获得的这一水相的任何浓缩悬浮液。优选通过溶剂蒸发进行干燥，正如下所述。

因此，本发明的另一个主题还是一种含有脂质(特别是PUFA)的含水悬浮液，其含有生物质，特别是脱脂生物质的细胞碎片，其特征在于盐含量小于15重量％，优选4至12重量％，特别是6至10重量％，和优选地其特征还在于非极性有机溶剂含量小于1重量％，优选小于0.5重量％或0.2重量％，更优选小于0.1重量％或0.05重量％，尤其小于0.01重量％，和优选地其特征还在于氯离子含量小于1重量％，优选小于0.5重量％或0.2重量％，更优选小于0.1重量％或0.05重量％。

因此，本发明的另一个主题特别还是一种含有脂质(特别是PUFA)的含水悬浮液，其含有生物质，特别是脱脂生物质的细胞碎片，其特征在于盐含量小于15重量％，优选4至12重量％，特别是6至10重量％，和优选地其特征还在于有机溶剂含量小于1重量％，优选小于0.5重量％或0.2重量％，更优选小于0.1重量％或0.05重量％，尤其小于0.01重量％，和优选地其特征还在于氯离子含量小于1重量％，优选小于0.5重量％或0.2重量％，更优选小于0.1重量％或0.05重量％。

因此，本发明优选的主题还是一种含有脂质(特别是PUFA)的含水悬浮液，其含有破囊壶菌生物质，特别是脱脂破囊壶菌生物质的细胞碎片，其特征在于盐含量小于15重量％，优选4至12重量％，特别是6至10重量％，和优选地其特征还在于非极性有机溶剂含量小于1重量％，优选小于0.5重量％或0.2重量％，更优选小于0.1重量％或0.05重量％，尤其小于0.01重量％，和优选地其特征还在于氯离子含量小于1重量％，优选小于0.5重量％或0.2重量％，更优选小于0.1重量％或0.05重量％。

因此，本发明特别优选的主题还是一种含有脂质(特别是PUFA)的含水悬浮液，其含有破囊壶菌生物质，特别是脱脂破囊壶菌生物质的细胞碎片，其特征在于盐含量小于15重量％，优选4至12重量％，特别是6至10重量％，和优选地其特征还在于有机溶剂含量小于1重量％，优选小于0.5重量％或0.2重量％，更优选小于0.1重量％或0.05重量％，尤其小于0.01重量％，和优选地其特征还在于氯离子含量小于1重量％，优选小于0.5重量％或0.2重量％，更优选小于0.1重量％或0.05重量％。

如前所述，本发明的含水悬浮液优选表现出总干物质(TDM)含量为20至60重量％，特别是25至55重量％，更优选30至50重量％，如此浓缩悬浮液特别适用于下述本发明的应用。

本发明的含水悬浮液可以用作如下进一步公开的不同用途的产物。替代地，也可以进一步处理该含水悬浮液，以提高总油产率。使用烧碱，可以进行进一步处理和进一步油分离。

根据本发明的“氯化物”是指可检出氯的量。例如，根据DIN EN ISO11885的元素分析，可以测定如存在的氯含量。氯以盐的形式存在，其被称为“氯化物”。根据本发明提到的氯化物含量，也被称为“氯离子”，仅是指可检出氯的量，而不是完整氯化物盐的量，其除氯离子外还包括阳离子反离子。

优选地，通过重量分析法，测定总干物质含量(TDM)。为此，在冻干前后称量具有特定体积的均匀的悬浮液样品。干燥样品的剩余重量对应于该特定体积悬浮液中所含的总干物质。

在本发明的特别优选实施方案中，通过将生物质干燥至超过90重量％的总干物质含量，将含有水、盐、残留油和细胞碎片的水相(在如前所述的油收获步骤中作为副产物获得的)转化为干燥的生物质。

由于该生产方法，该生物质包括非常低的盐含量，优选灰分，其量小于30重量％，特别是15至20重量％。

因此，本发明的另一个主题还是一种含有脂质(特别是PUFA)的生物质，特别是脱脂生物质，其特征在于灰分含量，特别是盐的含量，小于30重量％，优选8至30重量％，更优选12至20重量％，特别是15至20重量％。

优选地，根据本发明的生物质，特别是脱脂生物质的特征在于非极性有机溶剂的含量小于2重量％，优选小于1重量％、0.5重量％或0.2重量％，更优选小于0.1重量％、0.05重量％或0.02重量％，和优选其特征还在于氯离子含量小于2重量％，优选小于1重量％、0.5重量％或0.2重量％，更优选小于0.1重量％或0.05重量％。

因此，本发明优选的主题还是一种含有脂质(特别是PUFA)的破囊壶菌生物质，特别是脱脂破囊壶菌生物质，其特征在于灰分(特别是盐)含量小于30重量％，优选8至30重量％，更优选12至20重量％，特别是15至20重量％，和优选地，非极性有机溶剂含量小于2重量％，优选小于1重量％、0.5重量％或0.2重量％，更优选小于0.1重量％、0.05重量％或0.02重量％，和优选地其特征还在于氯离子含量小于2重量％，优选小于1重量％、0.5重量％或0.2重量％，更优选小于0.1重量％或0.05重量％。

因此，本发明特别优选的主题还是一种含有脂质(特别是PUFA)的破囊壶菌生物质，特别是脱脂破囊壶菌生物质，其特征在于灰分(特别是盐)含量小于30重量％，优选8至30重量％，更优选12至20重量％，特别是15至20重量％，和优选有机溶剂含量小于2重量％，优选小于1重量％、0.5重量％或0.2重量％，更优选小于0.1重量％、0.05重量％或0.02重量％，和优选地其特征还在于氯离子含量小于2重量％，优选小于1重量％、0.5重量％或0.2重量％，更优选小于0.1重量％或0.05重量％。

由于优选在不使用非极性有机溶剂的情况下进行制备，优选根本不使用任何有机溶剂，并且不使用氯化钠，优选根本不使用氯化物盐，所得的生物质优选不含任何非极性有机溶剂，优选不含任何有机溶剂，通常，和还基本不含任何氯离子，其中“基本不含”是指其含有的氯离子量小于0.1重量％，特别是其量小于0.05重量％。

优选地，根据本发明的生物质的水分含量不超过10重量％，优选不超过5重量％。

优选地，由此所得的生物质包括脂质(粗脂肪)，其量为约3至14重量％，特别是约4至约14重量％，优选其量为约4.5至12重量％，更优选其量为约5至约10重量％。此外，该脂质优选包括至少一种选自DHA和EPA的PUFA，更优选DHA和EPA的混合物，其中DHA与EPA的比优选在3:2至4:1之间，其中DHA的量优选为所含脂质总量的30至50重量％，EPA的量优选为所含脂质总量的10至20重量％。因此，优选地，如前所述的含水悬浮液的特征还在于通过将含水悬浮液干燥至水分含量不超过10重量％，优选不超过5重量％，使其通过干燥为具有这种粗脂肪含量和/或EPA含量和/或DHA含量的生物质而能够转化。

该生物质优选还包括蛋白质和/或氨基酸，其量为15至25重量％，更优选其量为17至23重量％，和优选显示为粗蛋白含量为25至35重量％。由于破乳是在温和条件下进行的，游离氨基酸与蛋白质和肽的总和的重量比优选小于9:1，更优选小于5:1，特别是小于1:1。因此，优选地，如前所述的含水悬浮液的特征还在于通过将含水悬浮液干燥至水分含量不超过10重量％，优选不超过5重量％，使其通过干燥为具有这种氨基酸和/或粗蛋白质含量和/或游离氨基酸与蛋白质和肽的比的生物质而能够转化。

优选地，该生物质还表现出粗纤维含量小于5重量％，优选小于2重量％，更优选约0重量％。因此，优选地，如前所述的含水悬浮液的特征还在于通过将含水悬浮液干燥至水分含量不超过10重量％，优选不超过5重量％，使其通过干燥为具有这种粗纤维含量的生物质而能够转化。

该干燥的生物质优选为脱脂生物质，这意味着其中大部分脂质已被去除优选通过本申请中公开的方法已被去除的生物质。由于从生物质中分离油是非常有效的，优选地，生物质中剩余的油小于生物质中最初所含有的油的20重量％，优选小于生物质中最初所含有的油的15重量％，更优选小于生物质中最初所含有的油的10重量％。但由于此类方法不能完全去除油，根据本发明的脱脂生物质中仍然还含有可观量的油。这意味着根据本发明的术语“脱脂生物质”是指裂解的生物质，其中大部分油已被去除，优选通过本申请中公开的过程或方法，但仍含有可观部分的脂质，特别是含有PUFA的脂质，其中干燥的脱脂生物质中脂质的量优选为3-14重量％，特别是4-14重量％，优选4.5-12重量％，更优选5-10重量％。因此，根据本发明的“脱脂生物质”也可以被称为“部分脱脂生物质”或“基本脱脂生物质”。

因此，本发明的另一个主题是一种获得低盐含量、通常基本上不含非极性有机溶剂(优选不含有机溶剂)和通常还基本上不含氯化钠(通常不含氯化物盐)的生物质的方法，其包括上述方法的步骤。

将含有水、盐、剩余油和细胞碎片的重相(在油收获步骤中作为副产物获得)通过干燥生物质至总干物质含量超过90重量％转化为干燥的生物质可以以不同的方式进行。

在非常优选的方式中，通过将重相浓缩至干物质含量为30-50重量％，优选35-45重量％进行转化，和随后通过流化床造粒方法对生物质进行喷雾造粒。这样，以非常有效的方式，可以获得具有优势特征的生物质。在EP13176661.0中更详细地公开了通过流化床造粒方法的喷雾造粒。

优选地，通过溶剂蒸发，特别是真空蒸发，和/或使用旋转蒸发器、薄膜蒸发器或降膜蒸发器，将重相浓缩至干物质含量为30-50重量％。溶剂蒸发有用的替代方法是反渗透。

作为喷雾造粒的替代方法，浓缩的重相的其他干燥方法，特别是其他对流干燥方法，像隧道干燥或喷雾干燥，特别是喷嘴喷雾干燥，或接触干燥方法，像滚筒干燥，或辐射干燥方法，像红外干燥，将是适用的替代方法，其中通过使用这些方法通常可以获得直径较小或较大的颗粒。

根据本发明，在干燥过程中，可以任选在生物质中加入抗结块剂，特别是二氧化硅，优选疏水性或亲水性二氧化硅，以防止结块。为此，优选将悬浮液，特别是发酵液(包括生物质和二氧化硅)，喷洒到特定干燥区域。或者或另外地，在干燥过程后，将生物质与抗结块剂混合。关于使用二氧化硅作为抗结块剂，特别参考了专利申请EP13187631.0。

通过造粒过程，可以实现将细粒粉末转化为粗粒度无尘产物。通常在食品加工或饲料加工中用作粘合剂、凝胶剂或增稠剂的传统有机或无机助剂或载体，如淀粉、明胶、纤维素衍生物或类似物质，可以任选地用于随后的造粒过程。在WO 2016/050560中公开了根据本发明优选使用的其他助剂，其中羧甲基纤维素为特别优选的粘合剂。

干燥和任选造粒和/或筛分该生物质后，优选地储存或包装干燥的生物质。

本发明的颗粒生物质以及本发明的含水悬浮液可以以不同的方式使用。例如，它们可以为了生产食品或饲料而使用。或者，它们可以直接用作食品或饲料。

因此，本发明的另一个主题还是一种用于生产饲料或食品的方法，其中使用根据本发明的颗粒生物质和/或含水悬浮液，和根据本发明的颗粒生物质和/或含水悬浮液优选与其他饲料或食品成分混合。

在本发明的优选实施方案中，该颗粒生物质和/或含水悬浮液用于生产食品或饲料，其中该生物质和/或含水悬浮液优选与其他食品或饲料成分混合，和然后进行加工以得到食品或饲料。

在优选实施方案中，通过挤出过程，对生物质和/或含水悬浮液与其他食品或饲料成分的混合物进行处理，以获得准备销售的食品或饲料部分。或者，也可以使用制粒方法。

在挤出过程中，优选使用单螺杆或双螺杆挤出机。优选地，在80-220℃，特别是100-190℃的温度下，10-40Bar的压力下，100-1000rpm特别是300-700rpm的轴转速下，进行挤出过程。引入混合物的驻留时间优选为5-30秒，特别是10-20秒。

在根据本发明优选的挤出过程模式中，该工艺包括压实步骤和压片步骤(compression step)。

在进行挤出过程之前，优选将组分彼此紧密混合。优选地，这在配备叶片的转筒中进行。在这一混合步骤中，优选的实施方案包括注入蒸汽，特别是为了使优选存在的淀粉膨胀。

与生物质和/或含水悬浮液混合前，优选将其他食品或饲料成分粉碎(如需要)，以确保在混合步骤中获得均匀的混合物。可以进行其他食品或饲料成分的粉碎，例如，使用锤磨机。

因此，本发明的另一个主题是一种饲养动物的方法，其中向动物提供根据本发明的颗粒生物质和/或含水悬浮液，优选在将颗粒生物质和/或含水悬浮液与其他饲料成分混合后，其中动物优选选自家禽、猪、貂、反刍动物，特别是小牛和肉牛、绵羊、山羊、宠物或水产养殖中的动物。

或者，根据本发明的生物质和/或含水悬浮液可以用于土地应用，特别是作为(有机)肥料、NPC(氮/磷/钾源)、土壤增强剂、植物增强剂和/或堆肥助剂，以用于生产沼气，用于废水处理或作为替代燃料，特别是用于水泥窑。它可以还用作生产微生物的发酵培养基的一部分，特别是用于生产还含有PUFA的生物质。

因此，本发明的另一个主题是一种增强土壤的方法，其中将根据本发明的颗粒生物质和/或含水悬浮液散布在地面上，并可以与地面混合，特别是与农田土壤或花园土壤混合。

因此，本发明的另一个主题也是一种施肥和/或堆肥土地特别是农田或花园的方法，其中将根据本发明的颗粒生物质和/或含水悬浮液散布在土地上，并可以与土地混合，特别是与农田土壤或花园土壤混合。

因此，本发明的另一个主题也是一种生产沼气的方法，其中根据本发明的颗粒生物质和/或含水悬浮液在厌氧条件下进行微生物降解，特别是通过利用产甲烷菌。

因此，本发明的另一个主题也是一种废水处理方法，其中将废水与根据本发明的颗粒生物质和/或含水悬浮液混合。

因此，本发明的另一个主题也是一种用于生产微生物的方法，特别是用于生产含有PUFA的生物质，其中根据本发明的颗粒生物质和/或含水悬浮液用作发酵培养基的一部分。

根据本发明的含有脂质的细胞平均含有至少10重量％的脂质，优选至少20重量％或30重量％，更优选至少40重量％或50重量％的脂质。

优选地，根据本发明的含有脂质的细胞还含有多不饱和脂肪酸(PUFA)。

优选地，含有脂质，特别是PUFA的生物质细胞为微生物细胞或植物细胞。在本发明的优选实施方案中，由于聚酮合成酶系统，该细胞能够产生PUFA。该聚酮合成酶系统可以是内源性的，或者由于基因工程可以是外源性的。

因此，根据本发明的“脱脂生物质”特别是指在经过油分离过程后，特别是如之前所公开的，此类含有PUFA的细胞(其包括生物质)的残留物。

该植物细胞可以特别为选自十字花科、胡颓子科和豆科的细胞。十字花科的细胞可以选自芸苔属，特别是油菜、芜菁和印度芥菜；胡颓子科的细胞可以选自胡颓子属，特别是油橄榄(Oleae europaea)种；豆科的细胞可以选自大豆(Glycine)属，特别是大豆种。

在现有技术中广泛描述了含有PUFA脂质的微生物。在这一情况下，使用的细胞可以特别是已经天然产生PUFA(多不饱和脂肪酸)的细胞；然而，它们也可以是由于合适的基因工程方法或由于随机诱变而获得的细胞，该细胞示出改善的PUFA产生或者已经能产生PUFA。PUFA的生成可以是营养缺陷型、混合营养型或异养型。

生物质优选包括异养产生PUFA的细胞。根据本发明的细胞优选选自藻类、真菌，特别是酵母菌、细菌或原生生物。该细胞更优选为微生物藻类或真菌。

合适的产油酵母菌细胞特别是耶氏酵母属(Yarrowia)、念珠菌属(Candida)、红酵母属(Rhodotorula)、红冬孢酵母属(Rhodosporidium)、隐球菌属(Cryptococcus)、毛孢子菌属(Trichosporon)和油脂酵母属(Lipomyces)的菌株。

合适的产油微藻类和藻类样微生物细胞特别是选自不等鞭毛类(Stramenopiles)门(也称为Heterokonta)的微生物。不等鞭毛类门微生物可以特别选自以下微生物：汉姆门(Hamatores)、普罗特蒙门(Proteromonads)、欧帕门(Opalines)、德维尔派门(Develpayella)、戴普罗弗门(Diplophrys)、拉普利门(Labrinthulids)、破囊壶菌门(Thraustochytrids)、拜尔瑟门(Biosecids)、水霉门(Oomycetes)、海植戴尔门(Hypochytridiomycetes)、康曼门(Commation)、瑞可罗门(Reticulosphaera)、普莱格门(Pelagomonas)、普莱格可门(Pelagococcus)、欧里可拉门(Ollicola)、奥瑞可门(Aureococcus)、小壳藻门(Parmales)、娃藻门(Diatoms)、黄藻门(Xanthophytes)、褐藻门(Phaeophytes，褐藻类)、黄绿藻门(Eustigmatophytes)、绿鞭藻门(Raphidophytes)、新纽门(Synurids)、爱科斯汀门(Axodines，包括瑞佐克姆纲(Rhizochromulinaales)、硅鞭藻纲(Pedinellales)、硅鞭藻纲(Dictyochales))、克里索达纲(Chrysomeridales)、萨西诺达纲(Sarcinochrysidales)、水树藻目(Hydrurales)、蟄居金藻目(Hibberdiales)和色金藻目(Chromulinales)。其他优选的微藻类群包括绿藻和甲藻的成员，甲藻包括隐甲藻(Crypthecodiurn)属的成员。

根据本发明的生物质优选包含如下细胞，优选基本由如下这类细胞组成：网粘菌纲(taxon Labyrinthulomycetes)(盘根足虫纲(Labyrinthulea)、净粘液真菌(net slimefungi)、网粘菌(slime nets))，特别是来自破囊壶菌(Thraustochytriaceae)科的那些细胞。破囊壶菌科(也称作破囊壶菌)包括如下属：Althomia、不动茶菌属(Aplanochytrium)、Aurantiochytrium、Botryochytrium、Elnia、日本壶菌属(Japonochytrium)、Oblongichytrium、Parietichytrium、裂殖壶菌属(Schizochytrium)、Sicyoidochytrium、破囊壶菌属(Thraustochytrium)和吾肯氏壶菌属(Ulkenia)。生物质特别优选包括以下属的细胞：Aurantiochytrium、Oblongichytrium、裂殖壶菌或者破囊壶菌，尤其裂殖壶菌属的细胞。

根据本发明，该多不饱和脂肪酸(PUFA)优选为高度不饱和脂肪酸(HUFA)。

存在于生物质中的细胞优选地通过以下事实来区分：在每种情况下基于细胞干物质，它们含有至少20重量％，优选至少30重量％，特别是至少35重量％的PUFA。

根据本发明，术语“脂质”包括磷脂；游离脂肪酸；脂肪酸酯；三酰甘油；甾醇和甾醇酯；类胡萝卜素；叶黄素(例如，氧化类胡萝卜素)；烃类；类异戊二烯衍生的化合物和本领域技术人员已知的其他脂质。根据本发明，术语“脂质”和“油”可互换使用。

在优选的实施方案中，在这一情况下，大多数脂质以甘油三酯的形式存在，优选至少50重量％、特别是至少75重量％，和在尤其优选的实施方案中，至少90重量％的脂质以甘油三酯的形式存在于细胞中。

根据发明，多不饱和脂肪酸(PUFA)被理解为是指至少有两个，特别是至少三个C-C双键的脂肪酸。根据本发明，在PUFA中优选高度不饱和脂肪酸(HUFA)。根据本发明，HUFA被理解为具有至少四个C-C双键的脂肪酸。

PUFA可以以游离形式或结合形式存在于细胞中。结合形式存在的示例是PUFA的磷脂和酯，特别是单酰基甘油酯、二酰基甘油酯和三酰基甘油酯。在优选的实施方案中，大多数PUFA以甘油三酯的形式存在，优选至少50重量％、特别是至少75重量％，和在尤其优选的实施方案中，至少90重量％的PUFA以甘油三酯的形式存在于细胞中。

优选的PUFA为ω-3脂肪酸和ω-6脂肪酸，其中ω-3脂肪酸尤其是优选的。在此，优选的ω-3脂肪酸为二十碳五烯酸(EPA，20:5ω-3)，特别是(5Z,8Z,11Z,14Z,17Z)-二十碳-5,8,11,14,17-五烯酸和二十二碳六烯酸(DHA，22:6ω-3)，特别是(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酸。

在本发明的非常优选的实施方案中，使用同时产生大量EPA和DHA的细胞，特别是裂殖壶菌属菌株，其中DHA的产生量优选是至少20重量％、优选量是至少30重量％、特别地量是30-50重量％，和EPA的产生量是至少5重量％，优选量是至少10重量％、特别地量是10-20重量％(分别相对于细胞中所含脂质的总量)。产生DHA和EPA的裂殖壶菌属菌株可以通过连续诱变、随后适当选择显示出优异EPA和DHA产生以及特定EPA:DHA比例的突变菌株而获得。能诱导酵母细胞遗传改变的任何化学或非化学(例如紫外线(UV)辐射)试剂均可以用作诱变剂。这些试剂可以单独使用或彼此组合使用，和化学试剂可以作为纯试剂使用或者与溶剂一起使用。

如前所述，同时大量产生EPA和DHA的优选裂殖壶菌属微生物物种以ATCC登记号PTA-10208、PTA-10209、PTA-10210或PTA-10211、PTA-10212、PTA-10213、PTA-10214、PTA-10215保藏。

根据本发明的生物质悬浮液优选是发酵液。悬浮液，特别是发酵液，优选具有的生物质密度为至少80g/l或100g/l，特别是80g/l或100g/l至250g/l，优选至少120g/l或140g/l，特别是120g/l或140g/l至220g/l，更优选至少160g/l或180g/l，特别是160g/l至200g/l(以干物质含量计算)。因此，可以通过在微生物产生PUFA的条件下，在发酵培养基中培养和生长适当的细胞来获得悬浮液。

在现有技术中详细描述了产生生物质(特别是含有脂质特别是PUFA的细胞，特别是破囊壶菌目细胞的生物质)的方法(例如，参见WO91/07498、WO94/08467、WO97/37032、WO97/36996、WO01/54510)。通常，通过在存在碳源和氮源的发酵罐中培养的细胞以及许多允许微生物生长和PUFA产生的其他物质(像矿物质)而使该产生发生。在这一情况下，可以达到超过100g/l的生物质密度和超过0.5g脂质/小时的产生率。该过程优选在所谓的分批补料工艺中进行，即在发酵过程中逐步补料碳源和氮源。当获得所需的生物质时，可以通过各种测量量度来引起脂质产生，例如通过限制氮源、碳源或氧含量或这些措施的组合。

在本发明的优选实施方案中，细胞生长直至其达到生物质密度为至少80g/l或100g/l，特别是80g/l或100g/l至250g/l，优选至少120g/l或140g/l，特别是120g/l或140g/l至220g/l，更优选至少160g/l或180g/l，特别是160g/l至200g/l(以干物质含量计算)。例如，此类过程在US 7,732,170中公开。

优选地，该细胞在低盐度的培养基中发酵，特别是为了避免腐蚀。这可以通过使用无氯钠盐作为钠源而不是氯化钠来实现，例如，如硫酸钠、碳酸钠、碳酸氢钠或苏打灰。优选地，发酵中使用的氯化物的量小于3g/l，特别是小于500mg/l，尤其优选小于100mg/l。

合适的碳源既是酒精的又是非酒精的碳源。酒精碳源的示例是甲醇、乙醇和异丙醇。非酒精碳源的示例是果糖、葡萄糖、蔗糖、糖蜜、淀粉和玉米糖浆。

合适的氮源既是无机氮源又是有机氮源。无机氮源的示例是硝酸盐和铵盐，特别是硫酸铵和氢氧化铵。有机氮源的示例是氨基酸，特别是谷氨酸和尿素。

此外，还可以加入无机或有机磷化合物和/或已知的促生长物质，例如酵母提取物或玉米浆，从而对发酵产生积极影响。

优选在pH为3至11，特别是4至10，和优选在温度至少20℃，特别是20至40℃，尤其优选至少30℃下发酵细胞。典型的发酵过程大约需要100小时。

发酵结束后，可以对细胞进行巴氏灭菌，以杀死细胞并将可以促进脂质降解的酶灭活。巴氏杀菌优选是将生物质加热至50至121℃，优选50至70℃，持续5至150分钟，特别是20至100分钟。

同样，发酵结束后，可以加入抗氧化剂，以保护生物质中存在的PUFA免受氧化降解。在这一情况下，优选的抗氧化剂为BHT、BHA、TBHA、乙氧喹、β-胡萝卜素、维生素E(特别是生育酚)，和维生素C。如果使用抗氧化剂，优选相对于加入抗氧化剂后发酵液的总量，其加入量为0.001至0.1重量％，优选地其量为0.002至0.05重量％％。

工作实施例

实施例1：裂解和浓缩发酵液的制备

在搅动的容器中，将含有生物质密度超过100g/l的微生物细胞(裂殖壶菌属)的未清洗的细胞培养液加热至60℃。加热悬浮液后，在加入0.5重量％(按培养液重量)液体形式的碱性蛋白酶(

实施例2：使用疏水性二氧化硅和表面活性剂混合物的破乳

向根据实施例1获得的1000g的裂解和浓缩的发酵液样品中加入5g的破乳剂混合物(其含有47.5重量％的Tween 80、47.5重量％的Span 80和5重量％的选自

加入破乳剂混合物后，将由此所得悬浮液在搅动的容器中加热至90℃的温度。分别在1小时和22小时后取出100ml的样品，和随后通过离心从水相中分离油。

结果如下表所示。

表1：使用疏水性二氧化硅和表面活性剂混合物的破乳

可以看出，孵育1小时后已经可以获得高产率的油，但孵育22小时后产率更高。

实施例3：使用不同量破乳剂混合物的破乳

向根据实施例1获得的1000g的裂解和浓缩发酵液样品中加入1g、3g、5g或8g的破乳剂混合物(其含有47.5重量％的Tween 80、47.5重量％的Span 80和5重量％的

结果如下表所公开。

表2：使用疏水性二氧化硅和表面活性剂混合物的破乳

可以看出，通过加入1g的破乳剂混合物/kg悬浮液(相当于悬浮液中0.005重量％的疏水性二氧化硅的量)，已经发生了有效破乳。

实施例4：不同孵育时间的破乳

向根据实施例1获得的1000g的裂解和浓缩发酵液样品中加入5g的破乳剂混合物(其含有47.5重量％的Tween 80、47.5重量％的Span 80和5重量％的

将由此所得的悬浮液在搅动的容器中加热至90℃的温度。2小时、4小时、6小时和24小时后分别取出100ml的样品，和随后通过离心从水相中分离油。

结果如下表所公开。

表3：使用疏水性二氧化硅和表面活性剂混合物的破乳

可以看出，根据表1中公开的结果，在短的孵育时间内已经发生了有效的破乳，但孵育时间超过5小时可以获得更好的产率。孵育时间相对较短的优点是最终产物中的游离脂肪酸(FFA)量非常低。

实施例5：不同温度下的破乳

向根据实施例1获得的1000g的四个裂解和浓缩发酵液样品中分别加入5g的破乳剂混合物(其含有47.5重量％的Tween 80、47.5重量％的Span80和5重量％的

在搅动的容器中，将所得样品分别在30℃、50℃、70℃和90℃的不同温度下加热24小时。24小时后分别取出100ml的样品，和随后通过离心从水相中分离油。

结果如下表所公开。

表4：不同温度下的破乳

可以看出，在非常低的温度下已经发生了破乳，但在高于50℃的温度下获得了良好的产率。与低孵育时间一样，在较低温度下孵育时也可以获得较低的FFA值。

实施例6：破乳剂混合物中表面活性剂的量和性质的变化

向根据实施例1获得的1000g的裂解和浓缩发酵液样品中加入不同量的破乳剂混合物(其含有疏水性二氧化硅

将由此所得样品在搅动的容器中在90℃加热。24小时后分别取出100ml的样品，和随后通过离心从水相中分离油。

下表公开了破乳剂混合物的不同组合物和加入量，以及获得油的产率：

表5：破乳剂混合物的组合物和使用量

表6：表面活性剂对油产率的影响

可以看出，使用不同的表面活性剂和即使不使用表面活性剂，也会发生有效的破乳。但表面活性剂对产率有明显的正面影响。