一种高效纯化分离抗体的方法

技术领域：

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种高效纯化分离抗体的方法。

背景技术：

抗体是一种由浆细胞在抗原的刺激下分泌的并能与抗原特异性结合的免疫球蛋白。抗体分为五类:IgG、IgM、IgA、IgD和IgE，其中IgG含量最高，是免疫的主要抗体。每一种相对应的抗原和抗体都会因为它们之间特定的亲和力而结合，正是这种抗体-抗原的特异性结合的机理为抗体在生物技术领域和医学领域的广泛应用提供了基础。随着自然环境的恶化，人们生活习惯的改变和人口的老龄化，肿瘤的发病率和死亡率不断上升，肿瘤已经成为威胁人们生命的主要恶性疾病[4]。抗体药物具有比较低的毒副作用，同时具有比较强的靶向性和较高的特异性，在治疗肿瘤领域越来越受到人们的青睐。

用于医疗目的的抗体必须具有较高的纯度，使抗体的纯化成本大大增加，现应用最广泛的蛋白纯化分离技术是亲和层析法。亲和层析法是利用生物活性物质之间的特异性亲和力，以达到分离纯化目标产物目的的蛋白纯化方法。专利CN201811332123.X公开了一种蛋白A亲和层析法纯化抗体的方法以及抗体的纯化方法。蛋白A亲和层析法纯化抗体的方法：循环利用以下蛋白A亲和层析柱纯化目标抗体：填料为MabSelect LX、Amsphere A3或Praesto Jetted A50，柱高为5～15cm，线性流速为200～500cm/h；在用洗脱液洗脱目标抗体之前，先用pH值为5～6，电导率为20～100mS/cm的缓冲液洗涤柱床。专利CN201811226606.1提供了一种抗体的纯化方法、抗体和应用，涉及蛋白纯化的技术领域。该纯化方法包括：提供含有抗体粗品的细胞发酵液；提供用于层析的缓冲液；然后使用AKTAAvant 150对抗体粗品进行组合层析；其中组合层析依次包括(a)亲和层析以捕获抗体；(b)凝胶过滤层析置换Buffer以脱盐；(c)再次层析分离抗体以对抗体进行精纯处理。由上述现有技术可知，采用蛋白亲和层析法来纯化抗体，虽然可以得到高纯度的抗体，但是成本较大，且吸附填料的重复利用性较低。

发明内容：

本发明要解决的技术问题是，针对现有技术的不足，提供一种高效纯化分离抗体的方法。本发明首先采用制备高比表面积的异形纤维，然后在其表面涂覆二氧化硅涂层，来改善其机械性能和吸附性能，最后在二氧化硅涂层表面进行官能化处理，来提高材料与抗体的结合性能，从而达到对抗体纯化的目的。该方法操作简单，成本低，得到的抗体纯度高。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

一种高效纯化分离抗体的方法，包括以下步骤：

(1)将聚酰胺切片并由双螺杆挤出造粒，将制得的粒料经由纺丝机上的星型喷丝板挤出纺丝，制得异形纤维；

(2)将上述制得的异形纤维进行分散制得质量浓度为5-8％的分散液，将分散液转移至反应器内，滴加硅源、正丁醇以及稀盐酸的混合液，搅拌水解处理，继续加入3-缩水甘油基氧基丙基三甲氧基硅烷、无水乙醇，氮气气氛下继续搅拌反应，反应结束后，过滤，将过滤得到的沉淀干燥制得改性异形纤维填料；

(3)将上述制得的改性异形纤维填料分散在去离子水中制得质量浓度为0.15-0.25％的悬浮液，然后将悬浮液转移至层析柱内，然后干燥，制得改性异形纤维柱；

(4)首先采用缓冲溶液对装载有改性异形纤维柱的层析柱进行平衡预处理，然后将待纯化抗体溶液加载到上述层析柱内，继续采用缓冲溶液对层析柱进行洗涤，最后采用洗脱液对洗涤后的层析柱进行洗脱，并收集洗脱液；洗脱后的层析柱进行后处理再重复利用。

作为上述技术方案的优选，步骤(1)中，所述异形纤维的横截面为正五角星，长度为2-5μm，比表面积为3-5m

作为上述技术方案的优选，步骤(2)中，所述硅源为正硅酸乙酯；所述稀盐酸的浓度为0.1mol/L；所述正硅酸乙酯、正丁醇、稀盐酸的体积比为2：(3-4)：(1-2)。

作为上述技术方案的优选，步骤(2)中，所述异形纤维、正硅酸乙酯、3-缩水甘油基氧基丙基三甲氧基硅烷、无水乙醇的质量比为5：(1-2)：0.001：2。

作为上述技术方案的优选，步骤(2)中，所述搅拌水解处理的条件为：首先在常温条件、500-600rpm下搅拌处理20-40min，然后于60-70℃、1000-2000rpm下搅拌处理2-5h。

作为上述技术方案的优选，步骤(2)中，所述搅拌反应的温度为30-35℃，反应时间为1-2h。

作为上述技术方案的优选，步骤(4)中，平衡预处理以及洗涤层析柱时材料的缓冲溶液为pH为5.0的50mmol/LMES与20mmol/L氯化钠的混合溶液。

作为上述技术方案的优选，步骤(4)中，所述待纯化抗体溶液加载到层析柱时的体积流速为0.55-1.05ml/L。

作为上述技术方案的优选，步骤(4)中，所述洗脱液为pH为2.5、浓度为100mmol/L的甘氨酸溶液。

作为上述技术方案的优选，步骤(4)中，所述洗脱后的层析柱的后处理具体为：将洗脱后的层析柱采用pH为3.0的乙酸溶液进行洗涤，然后采用1mol/L的氢氧化钠溶液进行洗涤，最后采用pH6.0的Tris溶液洗涤处理。

由于采用上述技术方案，本发明具有以下有益效果：

本发明采用异形纤维作为吸附载体，其成本低，具有较高的比表面积，与蛋白质的结合能力强。为了进一步提高其与抗体的亲和性。本发明将制得的异形纤维分散后与硅源溶液混合，并合理调节硅源的水解条件，制得的二氧化硅颗粒均匀的分散在异形纤维的表面，不仅改善了异形纤维的机械性能，而且提高了异形纤维的分散性。而且二氧化硅颗粒具有较高的比表面积，表面具有较多的固定位点，抗体以多层形式吸附在二氧化硅颗粒表面，从而提高抗体回收率。为了进一步改善二氧化硅颗粒的分散性，本发明采用3-缩水甘油基氧基丙基三甲氧基硅烷对二氧化硅颗粒表面修饰，修饰后的二氧化硅颗粒表面具有更多的结合位点，从而能很好的纯化抗体。

本发明公开的纯化抗体的方法操作简单，纯化过程中采用的层析填料机械性能好，具有较高的动态吸附能力，且可以重复利用，大大降低了抗体纯化的成本。

具体实施方式：

下面通过实施例对本发明进一步说明，实施例只用于解释本发明，不会对本发明构成任何的限定。

实施例1

(1)将聚酰胺切片并由双螺杆挤出造粒，将制得的粒料经由纺丝机上的星型喷丝板挤出纺丝，制得横截面为正五角星异形纤维，其长度为2μm，比表面积为3m

(2)将5g上述制得的异形纤维进行分散制得质量浓度为5％的分散液，将分散液转移至反应器内，滴加1ml正硅酸乙酯、1.5ml正丁醇以及0.5ml浓度为0.1mol/L稀盐酸的混合液，首先在常温条件、500rpm下搅拌处理20min，然后于60℃、1000rpm下搅拌处理2h；继续加入0.001g 3-缩水甘油基氧基丙基三甲氧基硅烷、2g无水乙醇，氮气气氛、30℃下继续搅拌反应1h，反应结束后，过滤，将过滤得到的沉淀干燥制得改性异形纤维填料；

(3)将上述制得的改性异形纤维填料分散在去离子水中制得质量浓度为0.15％的悬浮液，然后将悬浮液转移至层析柱内，然后干燥，制得改性异形纤维柱；

(4)首先采用pH为5.0的50mmol/LMES与20mmol/L氯化钠的混合溶液对装载有改性异形纤维柱的层析柱进行平衡预处理，然后将待纯化抗体溶液以0.55ml/L的体积流速加载到上述层析柱内，继续采用pH为5.0的50mmol/LMES与20mmol/L氯化钠的混合溶液对层析柱进行洗涤，最后采用pH为2.5、浓度为100mmol/L的甘氨酸溶液对洗涤后的层析柱进行洗脱，并收集洗脱液；洗脱后的层析柱采用pH为3.0的乙酸溶液进行洗涤，然后采用1mol/L的氢氧化钠溶液进行洗涤，最后采用pH6.0的Tris溶液洗涤处理，再重复利用。

实施例2

(1)将聚酰胺切片并由双螺杆挤出造粒，将制得的粒料经由纺丝机上的星型喷丝板挤出纺丝，制得横截面为正五角星异形纤维，其长度为5μm，比表面积为5m

(2)将8g上述制得的异形纤维进行分散制得质量浓度为8％的分散液，将分散液转移至反应器内，滴加1ml正硅酸乙酯、2ml正丁醇以及1ml浓度为0.1mol/L稀盐酸的混合液，首先在常温条件、600rpm下搅拌处理40min，然后于70℃、2000rpm下搅拌处理5h；继续加入0.001g 3-缩水甘油基氧基丙基三甲氧基硅烷、2g无水乙醇，氮气气氛、35℃下继续搅拌反应2h，反应结束后，过滤，将过滤得到的沉淀干燥制得改性异形纤维填料；

(3)将上述制得的改性异形纤维填料分散在去离子水中制得质量浓度为0.25％的悬浮液，然后将悬浮液转移至层析柱内，然后干燥，制得改性异形纤维柱；

(4)首先采用pH为5.0的50mmol/LMES与20mmol/L氯化钠的混合溶液对装载有改性异形纤维柱的层析柱进行平衡预处理，然后将待纯化抗体溶液以1.05ml/L的体积流速加载到上述层析柱内，继续采用pH为5.0的50mmol/LMES与20mmol/L氯化钠的混合溶液对层析柱进行洗涤，最后采用pH为2.5、浓度为100mmol/L的甘氨酸溶液对洗涤后的层析柱进行洗脱，并收集洗脱液；洗脱后的层析柱采用pH为3.0的乙酸溶液进行洗涤，然后采用1mol/L的氢氧化钠溶液进行洗涤，最后采用pH6.0的Tris溶液洗涤处理，再重复利用。

实施例3

(1)将聚酰胺切片并由双螺杆挤出造粒，将制得的粒料经由纺丝机上的星型喷丝板挤出纺丝，制得横截面为正五角星异形纤维，其长度为3μm，比表面积为4m

(2)将6g上述制得的异形纤维进行分散制得质量浓度为6％的分散液，将分散液转移至反应器内，滴加1ml正硅酸乙酯、1.5ml正丁醇以及1ml浓度为0.1mol/L稀盐酸的混合液，首先在常温条件、500rpm下搅拌处理40min，然后于70℃、1500rpm下搅拌处理3h；继续加入0.001g 3-缩水甘油基氧基丙基三甲氧基硅烷、2g无水乙醇，氮气气氛、30℃下继续搅拌反应1h，反应结束后，过滤，将过滤得到的沉淀干燥制得改性异形纤维填料；

(3)将上述制得的改性异形纤维填料分散在去离子水中制得质量浓度为0.2％的悬浮液，然后将悬浮液转移至层析柱内，然后干燥，制得改性异形纤维柱；

(4)首先采用pH为5.0的50mmol/LMES与20mmol/L氯化钠的混合溶液对装载有改性异形纤维柱的层析柱进行平衡预处理，然后将待纯化抗体溶液以0.75ml/L的体积流速加载到上述层析柱内，继续采用pH为5.0的50mmol/LMES与20mmol/L氯化钠的混合溶液对层析柱进行洗涤，最后采用pH为2.5、浓度为100mmol/L的甘氨酸溶液对洗涤后的层析柱进行洗脱，并收集洗脱液；洗脱后的层析柱采用pH为3.0的乙酸溶液进行洗涤，然后采用1mol/L的氢氧化钠溶液进行洗涤，最后采用pH6.0的Tris溶液洗涤处理，再重复利用。

实施例4

(1)将聚酰胺切片并由双螺杆挤出造粒，将制得的粒料经由纺丝机上的星型喷丝板挤出纺丝，制得横截面为正五角星异形纤维，其长度为4μm，比表面积为3m

(2)将7g上述制得的异形纤维进行分散制得质量浓度为7％的分散液，将分散液转移至反应器内，滴加1ml正硅酸乙酯、2ml正丁醇以及0.5ml浓度为0.1mol/L稀盐酸的混合液，首先在常温条件、600rpm下搅拌处理30min，然后于60℃、1500rpm下搅拌处理3h；继续加入0.001g 3-缩水甘油基氧基丙基三甲氧基硅烷、2g无水乙醇，氮气气氛、30℃下继续搅拌反应2h，反应结束后，过滤，将过滤得到的沉淀干燥制得改性异形纤维填料；

(3)将上述制得的改性异形纤维填料分散在去离子水中制得质量浓度为0.15％的悬浮液，然后将悬浮液转移至层析柱内，然后干燥，制得改性异形纤维柱；

(4)首先采用pH为5.0的50mmol/LMES与20mmol/L氯化钠的混合溶液对装载有改性异形纤维柱的层析柱进行平衡预处理，然后将待纯化抗体溶液以0.95ml/L的体积流速加载到上述层析柱内，继续采用pH为5.0的50mmol/LMES与20mmol/L氯化钠的混合溶液对层析柱进行洗涤，最后采用pH为2.5、浓度为100mmol/L的甘氨酸溶液对洗涤后的层析柱进行洗脱，并收集洗脱液；洗脱后的层析柱采用pH为3.0的乙酸溶液进行洗涤，然后采用1mol/L的氢氧化钠溶液进行洗涤，最后采用pH6.0的Tris溶液洗涤处理，再重复利用。

实施例5

(1)将聚酰胺切片并由双螺杆挤出造粒，将制得的粒料经由纺丝机上的星型喷丝板挤出纺丝，制得横截面为正五角星异形纤维，其长度为5μm，比表面积为4m

(2)将5g上述制得的异形纤维进行分散制得质量浓度为5％的分散液，将分散液转移至反应器内，滴加1ml正硅酸乙酯、1.5ml正丁醇以及0.5ml浓度为0.1mol/L稀盐酸的混合液，首先在常温条件、600rpm下搅拌处理30min，然后于60℃、2000rpm下搅拌处理4h；继续加入0.001g 3-缩水甘油基氧基丙基三甲氧基硅烷、2g无水乙醇，氮气气氛、35℃下继续搅拌反应1h，反应结束后，过滤，将过滤得到的沉淀干燥制得改性异形纤维填料；

(3)将上述制得的改性异形纤维填料分散在去离子水中制得质量浓度为0.15％的悬浮液，然后将悬浮液转移至层析柱内，然后干燥，制得改性异形纤维柱；

(4)首先采用pH为5.0的50mmol/LMES与20mmol/L氯化钠的混合溶液对装载有改性异形纤维柱的层析柱进行平衡预处理，然后将待纯化抗体溶液以0.55ml/L的体积流速加载到上述层析柱内，继续采用pH为5.0的50mmol/LMES与20mmol/L氯化钠的混合溶液对层析柱进行洗涤，最后采用pH为2.5、浓度为100mmol/L的甘氨酸溶液对洗涤后的层析柱进行洗脱，并收集洗脱液；洗脱后的层析柱采用pH为3.0的乙酸溶液进行洗涤，然后采用1mol/L的氢氧化钠溶液进行洗涤，最后采用pH6.0的Tris溶液洗涤处理，再重复利用。

对比例

层析内的填料只采用异形纤维，其他条件和实施例5相同。

下面对纯化后的抗体的纯度以及回收率进行测试，测试结果如表1所示：

表1

从上述测试结果可以看出，本发明公开的纯化抗体方法，制得的抗体的纯度不仅高，且抗体回收率也得到明显改善。

虽然已经对本发明的具体实施方案进行了描述，但是本发明的许多其他形式和改变对本领域技术人员而言是显而易见的。应理解所附权利要求和本发明通常涵盖本发明真实精神和范围内的所有这些明显的形式和改变。