适体制剂

技术领域

本发明涉及适体制剂，特别是以针对碱性成纤维细胞生长因子(FGF2)的适体作为有效成分的适体制剂。

背景技术

近年来，RNA适体在治疗药物，诊断试剂，试剂中的应用备受瞩目，已有若干个RNA适体进入了临床阶段或进行实用阶段。在2004年12月，世界第一个RNA适体药物Macugen(注册商标)(一般名：哌加他尼钠)作为老年性黄斑变性的治疗药而得到美国的许可，在日本也在2008年7月得到许可。Macugen(注册商标)以针对VEGF的适体为活性主体。该适体由包含28个核酸分子的合成寡核苷酸构成，在其5′末端结合有聚乙二醇(PEG)衍生物。

Macugen(注册商标)的剂型为预装填注射器注射剂，注射到晶状体内。为无色至略微着色的澄清水性注射液，添加有磷酸氢钠，磷酸二氢钠，等渗剂及pH调节剂。利用该制剂配方，在25±2℃的加速试验中经历6个月，在5±3℃的长期保存试验经历36个月的情况下均显示为稳定存在(非专利文献1)。

另一方面，在本申请进行申请时，还不存在除了Macugen(注册商标)以外的以适体作为有效成分的药物，对相对于适体制剂而言怎样的制剂配方是适当的也完全未知。

申请人正在开发以针对FGF2的适体为有效成分，以老年性黄斑变性、软骨成长不全，或癌症性疼痛作为适应症的药物(专利文献1及2)。本发明人在进行FGF2适体制剂的开发过程中，利用认为与Macugen(注册商标)大致相同的制剂配方，以磷酸缓冲生理盐水(PBS)作为介质的制剂配方得到了不能保持FGF2适体的活性的结果。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：国际公开第2011/099576号

专利文献2：国际公开第2015/147017号

非专利文献

非专利文献1：药物访谈表格老年性黄斑变性治疗剂Macugen(注册商标)晶状体内注射用试剂盒0.3mg 2015年3月(修改第5版)

发明内容

发明要解决的问题

因此，本发明的目的在于提供能够长期稳定保持适体(特别是针对FGF2的适体)活性的制剂配方，进一步提供以适体(特别是FGF2适体)作为有效成分的药物制剂。

用于解决问题的方法

本发明人为了实现上述目标进行了深入研究，结果成功地发现对于FGF2适体的最适制剂条件，从而完成了本发明。

即，本发明提供以下内容。

[1]水性液剂，其含有结合FGF2的适体或其盐，以及作为非电解质的渗透压调节剂，并且该适体或其盐为长期稳定的。

[2]根据[1]所述的水性液剂，其中，除了上述适体或其盐以外，实质上不含电解质。

[3]根据[1]或[2]所述的水性液剂，其中，上述适体包含下式(1)所示的核苷酸序列：

其中，N

(a)在该适体包含的核苷酸中，

(i)各嘧啶核苷酸的核糖的2′位为氟原子，

(ii)各嘌呤核苷酸的核糖的2′位为羟基；

(b)在该(a)的适体中，

(i)各嘧啶核苷酸的核糖的2′位的氟原子各自独立地未被置换、或被选自由氢原子，羟基及甲氧基组成的组中的原子或基团置换，

(ii)各嘌呤核苷酸的核糖的2′位的羟基各自独立地未被置换，或被选自由氢原子，甲氧基及氟原子组成的组中的原子或基团置换。

[4]根据[1]或[2]所述的水性液剂，其中，上述适体包含下式(3)所示的核苷酸序列：

其中，N

[5]根据[1]或[2]所述的水性液剂，其中，上述适体包含SEQ ID NO：3，8，9，10或12所示的任一种核苷酸序列。

[6]根据[1]～[5]中任一项所述的水性液剂，其中，适体的浓度为1～60mg/mL。

[7]根据[1]～[6]中任一项所述的水性液剂，其中，渗透压调节剂的配制比例为水性液剂总量的2～7.5％(w/v)。

[8]根据[1]～[7]中任一项所述的水性液剂，其中，渗透压调节剂为甘露醇。

[9]根据[8]所述的水性液剂，其中，甘露醇的含量为相对于适体1mg为1～50mg的比例。

[10]根据[1]～[9]中任一项所述的水性液剂，保存于5℃以下。

[11]根据[1]～[10]中任一项所述的水性液剂，其中，于4℃保存3个月之后的单体适体的比例为80％以上。

[12]根据[1]～[11]中任一项所述的水性液剂，其为注射剂。

[13]根据[1]～[12]中任一项所述的水性液剂，其用于预防或治疗伴随血管生成的疾病，骨/软骨疾病或疼痛。

[14]预防或治疗伴随血管生成的疾病，骨/软骨疾病或疼痛的方法，包括将[1]～[12]中任一项所述的水性液剂施用于对象。

[15]根据[1]～[12]中任一项所述的水性液剂，其用于伴随血管生成的疾病，骨/软骨疾病或疼痛的预防或治疗。

发明效果

根据本发明可以提供适体制剂，其能够将作为有效成分的针对FGF2的适体或其盐以水性液剂的形态长期稳定保存，因此操作容易。

具体实施方式

本发明提供以针对FGF2的适体或其盐作为有效成分，将该适体或其盐长期稳定地保持的药物制剂(下文中，也称为“本发明的适体制剂”)。在此，“长期稳定”是指当在玻璃瓶中封入该制剂并于4℃经历保存3个月后，单体适体的比例为70％以上。单体适体的比例为使用尺寸排阻层析法，根据以下条件将单体和多聚体分离并检测，从而算出(单体的峰面积)/(单体及多聚体的峰面积之和)×100(％)的值。

装置：Waters公司制ACQUITY UPLC H-Class Bio

检测器：Waters公司制TUV检测器

柱：Waters公司制ACQUITY UPLC BEH200 SEC柱

样品浓度：0.2mg/mL

注入量：5μL

洗脱液：10％乙腈/PBS

流速：0.3mL/分钟

柱温：25℃

本发明的适体制剂中含有作为有效成分的针对FGF2的适体或其盐，以及作为非电解质的渗透压调节剂。

适体是指具有相对于给定的靶分子的结合活性的核酸分子。适体通过对于给定的靶分子进行结合，可抑制该靶分子的活性。作为本发明的适体制剂的有效成分的适体为对于FGF2具有结合活性的适体。在优选的实施方式中，该适体为能够结合FGF2而抑制FGF2与FGF受体的结合的适体。即，该适体具有针对FGF2的抑制活性。

本发明使用的适体为结合FGF2的适体，进一步优选为能够结合FGF2而抑制FGF2与FGF受体的结合的适体。本发明使用的适体是否抑制FGF2与FGF受体的结合，可以通过例如实施例1等的利用了表面等离子体共振法的试验进行评价。

对针对FGF2的适体而言没有特别限制，例如在国际公开第2015/147017号中记载的适体，具体而言，所述适体包含下式(1)所示的核苷酸序列：

其中，尿嘧啶可以为胸腺嘧啶，且所述适体为以下(a)或(b)中的任一个：

(a)在该适体包含的核苷酸中，

(i)各嘧啶核苷酸的核糖的2′位为氟原子，

(ii)各嘌呤核苷酸的核糖的2′位为羟基；

(b)在该(a)的适体中，

(i)各嘧啶核苷酸的核糖的2′位的氟原子各自独立地未被置换、或被选自由氢原子，羟基及甲氧基组成的组中的原子或基团置换，

(ii)各嘌呤核苷酸的核糖的2′位的羟基各自独立地未被置换，或被选自由氢原子，甲氧基及氟原子组成的组中的原子或基团置换。

在上述式(1)中，N

对N

对N

在优选的实施方式中，在上述式(1)中，

N

N

N

N

N

N

对N

对N

在其他的优选的实施方式中，在上述式(1)中，

N

N

N

N

N

N

在优选的实施方式中，本发明使用的适体包含下式(2)或(3)所示的核苷酸序列：

(式中，N

在优选的实施方式中，本发明使用的适体包含SEQ ID NO：1～12中任一项所示的核苷酸序列。以下示出SEQ ID NO：1～12所示的核苷酸序列(其中，尿嘧啶可以为胸腺嘧啶)，(下文中，A，G，C及U分别表示核苷酸的碱基为腺嘌呤，鸟嘌呤，胞嘧啶及尿嘧啶)。

SEQ ID NO：1：

SEQ ID NO：2：

SEQ ID NO：3：

SEQ ID NO：4：

SEQ ID NO：5：

SEQ ID NO：6：

SEQ ID NO：7：

SEQ ID NO：8：

SEQ ID NO：9：

SEQ ID NO：10：

SEQ ID NO：11：

SEQ ID NO：12：

在优选的一种实施方式中，本发明使用的适体包含SEQ ID NO：1，3，4，5，6，8，9，10或12，更优选包含SEQ ID NO：3，8，9，10或12所示的核苷酸序列。

在其他的优选实施方式中，本发明使用的适体包含SEQ ID NO：2或7所示的核苷酸序列(包含在上述式(2)中)。

在进一步其他的优选的实施方式中，本发明使用的适体包含SEQ ID NO：1，3，4，5，6或8所示的核苷酸序列(包含在上述式(3)中)。

在一个实施方式中，本发明使用的适体可以包含在上述任一种核苷酸序列中的1或数个核苷酸被置换，缺失，插入或添加的核苷酸序列，只要仍与FGF2结合即可，所述适体可以为

(a)在该适体包含的核苷酸中，

(i)各嘧啶核苷酸的核糖的2′位为氟原子，

(ii)各嘌呤核苷酸的核糖的2′位为羟基的适体；

(b)在该(a)的适体中，

(i)各嘧啶核苷酸的核糖的2′位的氟原子各自独立地未被置换、或被选自由氢原子，羟基及甲氧基组成的组中的原子或基团置换，

(ii)各嘌呤核苷酸的核糖的2′位的羟基各自独立地未被置换，或被选自由氢原子，甲氧基及氟原子组成的组中的原子或基团置换的适体。

其中，对上述置换，缺失，插入或添加的核苷酸数而言没有特别限定，只要在置换，缺失，插入或添加之后也仍结合FGF2即可，例如可以为1～约10个、优选为1～6个，更优选为1～5个，进一步优选为1～4个，进一步优选为1～3个，最优选为1个或2个。对核苷酸发生置换，缺失，插入或添加的部位而言也没有特别限定，只要置换，缺失，插入或添加后也仍结合FGF2即可，在上述式(1)，(2)及(3)中，在利用一种核苷酸(即，A，G，C或U)进行特别指定的部位中，在1～3处、优选为1或2处，更优选为1处中进行核苷酸置换，缺失，插入或添加。另一方面，在式(1)，(2)及(3)中，在可以取多种核苷酸的部位(即，N

对本发明使用的适体的长度没有特别限定，通常可以为约10～约200个核苷酸，例如可以为约20个核苷酸以上(例如，25个核苷酸以上，30个核苷酸以上，31个核苷酸以上，32个核苷酸以上，33个核苷酸以上)、优选为25个核苷酸以上，更优选为30个核苷酸以上，进一步优选为33个核苷酸以上。另外，例如可以为约100个核苷酸以下，通常约80个核苷酸以下、优选为约70个核苷酸以下，更优选为约60个核苷酸以下，进一步优选为约50个核苷酸以下，进一步优选为约45个核苷酸以下(例如，44个核苷酸以下，43个核苷酸以下，42个核苷酸以下，41个核苷酸以下，40个核苷酸以下)。如果总核苷酸数少，则化学合成及大量生产更加容易，且成本方面的优点也大。另外，可认为进行化学修饰也容易，生物体内稳定性也高，毒性也低。

因而作为在本发明使用的适体的长度，通常可为约10～约200个核苷酸、优选为20～80个核苷酸，更优选为25～60个核苷酸，进一步优选为25～50个核苷酸，最优选为30～45个核苷酸。

本发明使用的适体还可以为连接物，其选自由包含上述式(1)所示的核苷酸序列的适体(适体(A))的多个的连接物，包含在上述式(1)所示的核苷酸序列中有1或数个核苷酸发生置换，缺失，插入或添加的核苷酸序列的适体(适体(B))的多个的连接物，以及1或多个适体(A)与1或多个适体(B)的连接物组成的组。这些连接物也可以结合FGF2。

在此，连接可以通过串联结合进行。另外，在连接时，也可以利用接头。作为接头，可列举核苷酸链(例如，1～约20个核苷酸)，非核苷酸链(例如，-(CH

本发明使用的适体中包含的各核苷酸可以分别是相同或不同的，为在核糖(例如，嘧啶核苷酸的核糖，嘌呤核苷酸的核糖)的2′位中包含羟基的核苷酸(即，天然的核糖核苷酸)、或者在核糖的2′位中，羟基被任意的原子或基团进行置换(修饰)的核苷酸(在本说明书中，有时记载为“修饰核苷酸”)。

可列举被作为这样的任意的原子或基团，例如：氢原子，氟原子或-O-烷基(例如，-O-Me基)，-O-酰基(例如，-O-CHO基)，氨基(例如，-NH

在本发明使用的适体中，也可以为所有嘧啶核苷酸为核糖的2′位为氟原子的核苷酸，或为该氟原子相同或不同地未被置换，或被置换为上述任意的原子或基团，优选地，选自由氢原子，羟基及甲氧基组成的组的原子或基团的核苷酸。尤其是，当作为本发明使用的适体的制备方法适用了使用DuraScribe

在本发明使用的适体中，也可以为所有嘌呤核苷酸为核糖的2′位为羟基的核苷酸，或为该羟基相同或不同地未被置换，或被置换为上述任意的原子或基团，优选地，选自由氢原子，甲氧基及氟原子组成的组的原子或基团的核苷酸。羟基被其它上述原子或基团进行置换的适体能够以后述的方法制备。

在本发明使用的适体中，也可以为所有嘧啶核苷酸为核糖的2′位的氟原子被上述任意的原子或基团，例如选自由氢原子，羟基及-O-Me基组成的组的相同原子或基团置换的核苷酸。

在本发明使用的适体中，也可以为所有嘌呤核苷酸为核糖的2′位的羟基被上述任意的原子或基团，例如选自由氢原子，氟原子及-O-Me基组成的组的相同原子或基团置换的核苷酸。

在优选的实施方式中，本发明使用的适体中包含的各嘧啶核苷酸均为在核糖的2′位包含氟原子的核苷酸，且各嘌呤核苷酸均为在核糖的2′位包含羟基的核苷酸。在其他实施方式中，上述各嘧啶核苷酸的核糖的2′位的氟原子可以各自独立地被选自由氢原子，羟基及甲氧基组成的组的原子或基团置换，且上述各嘌呤核苷酸的核糖的2′位的羟基可以各自独立地被选自由氢原子，甲氧基及氟原子组成的组的原子或基团置换。

另外，在本说明书中，将构成适体的核苷酸假设为RNA(即，将糖基假设为核糖)，对核苷酸中对糖基的修饰的实施方式进行说明，然而这并不意在指从构成适体的核苷酸中将DNA除外，可适当替换解读为对DNA的修饰。例如，当构成适体的核苷酸为DNA的情况下，将核糖的2′位的羟基替换为X，可替换解读为将脱氧核糖的2′位的氢原子替换为X的方式。

在本发明使用的适体中，通过将尿嘧啶替换为胸腺嘧啶，可以提高针对FGF2的结合性、FGF2与FGF受体的结合抑制活性，适体的稳定性、药物输送性、血液中的稳定性等。

在本发明使用的适体中，也可以将核苷酸中的磷酸二酯键中的1或数个，例如：1～2个，1～3个，1～4个，1～5个核苷酸利用任意取代基进行修饰或置换。例如：磷酸二酯键可以置换为硫代磷酸酯键，二硫代磷酸酯键，烷基膦酸酯键，磷酰胺(phosphoroamidate)键等。其中，例如“核苷酸被置换为硫代磷酸酯键”是指位于相邻核苷酸间的结合部位的磷酸基被硫化，即，表示磷酸二酯键被改变为硫代磷酸酯键。

在本发明使用的适体中，也可以为了使适体稳定，提高其活性的目的而将1或数个，例如：1～2个，1～3个，1～4个，1～5个核苷酸利用桥连核酸(Bridged Nucleic Acid，BNA)或锁核酸(Locked Nucleic Acid，LNA)进行置换。其中，“桥连核酸”是指具有将核酸的自由度利用分子内桥连进行限制，从而提高相对于互补序列的结合亲和性，且获得核酸酶耐性的结构的那些，可列举例如：2′，4′-BNA(LNA)，2′-O，4′-C-亚乙基-桥连核酸(ENA)等，但不限于这些。

本发明使用的适体为了提高针对FGF2的结合性、稳定性、药物输送性等，而可以为各核苷酸的糖残基(例如，核糖)经修饰的那些。作为在糖残基中被修饰的部位，可列举例如将糖残基的2′位，3′位和/或4′位的氧原子置换为其它原子的那些等。作为修饰的种类，可列举例如：氟化，O-烷基化(例如，O-甲基化，O-乙基化)，O-烯丙基化，S-烷基化(例如，S-甲基化，S-乙基化)，S-烯丙基化，氨基化(例如，-NH2)。除此以外，作为实例可列举4′位的氧被置换为硫的4′SRNA，2′位和4′位经由亚甲基桥连的LNA(Locked Nucleic Acid)，3′位的羟基被置换为氨基的3′-N-磷酰胺核酸等。对本发明使用的适体而言，根据其制备方法而存在以嘧啶核苷酸的核糖2′位的氧原子具有一定的修饰的方式进行制备的情况，例如在适用使用了DuraScribe

本发明使用的适体为了提高针对FGF2的结合性、防止多聚体化，稳定性、药物输送性等，也可以为将核酸碱基(例如，嘌呤，嘧啶)发生改变(例如，化学置换)的那些。作为这样的改变，可列举例如：5位嘧啶改变，6和/或8位嘌呤改变，利用环外胺的改变，利用4-硫基尿苷的置换，利用5-溴或5-碘-尿嘧啶的置换。另外，为了使得对于核酸酶及水解具有耐性，本发明使用的适体中包含的磷酸基也可以进行改变。例如：P(O)O基可以被P(O)S(硫代)，P(S)S(二硫代)，P(O)N(R)R′(酰胺化)，P(O)R，P(O)OR，CO或CH

作为连接基团，可例示-O-，-N-或-S-，通过这些连接基团可以与相邻的核苷酸结合。

改变也可以包括诸如加帽的3′及5′的改变。

对改变而言，进一步可以通过在末端添加聚乙二醇(PEG)，氨基酸，肽，反向dT(inverted dT)，核酸，核苷，肉豆蔻酰基，胆石酸-油基，二十二酰基，月桂酰基，硬脂酰基，棕榈酰基，油酰基，亚油酰基，除此以外的脂质，类固醇，胆固醇，咖啡因，维生素，色素，荧光物质，抗癌剂，毒素，酶，放射性物质，生物素等而进行。对于这样的改变，例如参考：美国专利第5,660,985号及第5,756,703号。

尤其是，当改变在通过在PEG的末端添加而进行的情况下，对PEG的分子量没有特别限定，优选为1000～100000，更优选为30000～90000。PEG可以为直链状，也可以为分支为二条以上的链的情况(多臂PEG)。PEG的末端添加在后述的适体的多聚体化的防止中有用。

作为这样的PEG没有特别限定，只要是本领域技术人员，就能够适当选择市售或者公知的PEG进行使用(例如参考：http：//www.peg-drug.com/peg_product/branched.html)，作为本发明使用的适体中适用的PEG的优选例，具体可列举分子量40000的2分支GS型PEG(SUNBRIGHT GL2-400GS日油制)，分子量40000的2分支TS型PEG(SUNBRIGHTGL2-400TS日油制)，分子量40000的4分支TS型PEG(SUNBRIGHT GL4-400TS日油制)，分子量80000的2分支TS型PEG(SUNBRIGHT GL2-800TS日油制)，或分子量80000的4分支TS型PEG(SUNBRIGHT GL4-800TS日油制)等。

在该情况下，对本发明使用的适体而言，PEG可以直接添加到末端，更优选在其末端添加具有能够与PEG结合的基团的接头等，通过其将PEG添加到本发明使用的适体。

作为PEG和本发明使用的适体的接头，没有特别限定，碳链数、官能团等可以根据结合部位、PEG的种类等进行适当选择。作为这样的接头，例如可以举出具有氨基的接头，具体而言当添加到5′末端时，可例示ssH接头(SAFC)或DMS(O)MT-AMINO-MODIFIER(Glenresearch)，当添加到3′末端时，为TFA Amino C-6lcaa CPG(ChemGenes)等。在选择该接头的情况下，可以在PEG中添加例如了N-羟基琥珀酰亚胺的活性基的基础上，使其与接头侧的氨基发生反应，由此将本发明使用的适体与PEG通过接头结合。

需要说明的是，作为PEG、接头，优选可以使用市售的那些。另外，PEG，接头及本发明使用的适体的结合所涉及的反应条件等，只要是本领域技术人员就能够适当设定。

作为本发明使用的适体的更优选实施方式，包含SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列的适体ID1：

GL2-400TS-C6-G(M)G(M)G(M)A(M)U(M)A

(M)C(M)U(F)A(M)G(M)G(M)GC(M)A(M)U(M)U(F)A(M)A(M)U(M)G(M)U(F)U(M)A(M)C(M)C(M)A(M)GU(F)GU(F)A(M)G(M)U(M)C(M)C(M)C(M)-idT；

包含SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列的适体ID2：

GL2-400TS-C6-C(M)G(M)G(M)A(M)U(M)A(M)C(M)U(F)A(M)G(M)G(M)GC(M)A(M)U(M)U(F)A(M)A(M)U(M)G(M)U(F)U(M)A(M)C(M)C(M)A(M)GU(F)GU(F)A(M)G(M)U(M)C(M)C(M)G(M)-idT；

包含SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列的适体ID3：

GL2-400TS-C6-C(M)C(M)G(M)A(M)U(M)A(M)C(M)U(F)A(M)G(M)G(M)GC(M)A(M)U(M)U(F)A(M)A(M)U(M)G(M)U(F)U(M)A(M)C(M)C(M)A(M)GU(F)GU(F)A(M)G(M)U(M)C(M)G(M)G(M)-idT；

包含SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列的适体ID4：

GL2-400TS-C6-G(M)G(M)G(M)A(M)U(M)A(M)C(M)U(F)A(M)G(M)G(M)GC(M)G(M)U(M)U(F)A(M)A(M)C(M)G(M)U(F)U(M)A(M)C(M)C(M)A(M)GU(F)GU(F)A(M)G(M)U(M)C(M)C(M)C(M)-idT；

包含SEQ ID NO：12所示的核苷酸序列的适体ID5：

GL2-400TS-C6-G(M)G(M)G(M)A(M)U(M)A(M)C(M)U(F)A(M)G(M)G(M)GC(M)A(M)U(M)U(F)U(M)A(M)U(M)G(M)U(F)U(M)A(M)C(M)C(M)A(M)GU(F)GU(F)A(M)G(M)U(M)C(M)C(M)C(M)-idT；及

包含SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列的适体ID6：

idT-G(M)G(M)G(M)A(M)U(M)A(M)C(M)U(F)A(M)G(M)G(M)GC(M)A(M)U(M)U(F)A(M)A(M)U(M)G(M)U(F)U(M)A(M)C(M)C(M)A(M)GU(F)GU(F)A(M)G(M)U(M)C(M)C(M)C(M)-C6-GL2-400TS

(在上述各式中，各核苷酸中的括号显示了核糖的2′位的修饰，F表示氟原子，M为甲氧基。)

这些适体由于使用其中任一种都能在本发明的适体制剂的构成中稳定存在，因此，作为本发明的适体制剂的有效成分是合适的。

本发明使用的适体可以为游离体，可以为其药学上允许的盐。作为这样的盐，可列举金属盐，铵盐，有机胺加成盐，氨基酸加成盐等。作为金属盐，可列举钠盐，钾盐等碱金属盐，镁盐，钙盐等碱土金属盐，铝盐，锌盐等。作为铵盐，可列举铵，四甲基铵等的盐。作为有机胺加成盐，可列举三羟基氨基甲烷等的盐。作为氨基酸加成盐，可列举赖氨酸，精氨酸，组氨酸，色氨酸，鸟氨酸等的盐。

对本发明所用的针对FGF2的适体的浓度没有特别限定，只要本发明的适体制剂发挥目的効能效果，含有多少都是可以的。本说明书中“适体的浓度”是指构成适体分子的以5′→3′磷酸键连接的核酸部分的重量占制剂总体积的比例(mg/mL)。作为该适体的浓度，可列举例如：1～60mg/mL。

如果针对FGF2的适体的浓度超过20mg/mL，则即使在普通的保存温度的4～5℃时，也有容易产生该适体的多聚体的倾向。针对FGF2的适体在以单体形式存在的情况下结合FGF2，抑制FGF2的功能并发挥其药效，但如果发生了多聚体化，则在使用BIAcore的测定中观察不到与FGF2的结合，认为并不抑制FGF2的功能(参考实施例4)。在适体的浓度较低时，分子间距离较远，变为多聚体的倾向较低，但如果适体浓度超过20mg/mL，则在普通的保存温度的4～5℃时也发生多聚体化，结果导致有与FGF2的结合活性在整体上降低的倾向(参考实施例5)。因此，本发明的适体制剂中的FGF2适体浓度的上限优选为不超过20mg/mL的浓度。另外，在本发明的适体制剂的适体浓度较低的情况下，有得不到作为注射剂的效果的情况。因此，虽然对在本发明的适体制剂中的FGF2适体浓度的下限而言没有特别限定，只要是可得到作为注射剂的效果的浓度，优选例如为1mg/mL以上的浓度。

本发明的适体制剂的剂型没有特别限定，只要为水性液剂，优选为注射剂。由于本发明的适体制剂为水性液剂，因此作为有效成分的针对FGF2的适体在溶剂中溶解而存在。

通常广知的是，适体为了保持其高级结构，需要作为强电解质的无机盐。在作为目前已经上市的唯一的适体药物的Macugen(注册商标)中，也添加了磷酸氢钠，磷酸二氢钠，等渗剂及pH调节剂。在该状态下，Macugen在25±2℃的加速试验中经历6个月，在5±3℃的长期保存试验中也经历36个月而显示稳定存在。因此，对于本领域技术人员应该认为：为了使适体的高级结构保持不变地存在于注射剂中，无机盐(电解质)是必要的。

然而，如后述实施例中所示那样，可知对本发明中的作为有效成分的上述针对FGF2的适体而言，如果作为溶剂使用了PBS、生理盐水，则在作为强电解质的无机盐的影响下失去稳定性，存在形成多聚体的倾向，其结果丧失对FGF2的结合活性。为此，本发明人当作为溶剂使用了不含有无机盐(电解质)的水时发现，预计之外地，FGF2适体的多聚体化受到抑制，FGF2适体以单体形式存在的比例增大(参考实施例3)。

不意在以任何理论进行限制，在将FGF2适体溶解在水中的情况下，如实施例1所示那样不能测定FGF2适体的Tm值，另外，在实施例2中所示那样不能观察到NMR中的质子位移，因此设想在水中溶解的FGF2适体为以单体进行伸展的状态存在。即，可认为通过作为溶剂使用不包含无机盐的水，由此，认为对活性构建而言是必要的适体的高级结构被破坏，改性而以单链状态存在，由此可以防止发生失活(变成多聚体)。而且，根据如实施例4及5所示那样，当在包含电解质的溶液中溶解并实施表面等离子共振(SPR)测定时，FGF2适体保持了针对FGF2的结合活性这点，证实如果将在水中溶解的FGF2适体施用到体内，则由于体液中存在的电解质的作用而使对于适体活性而言必要的高级结构发生再构建，从而能够发挥活性。

明确了像这样通过溶解于不包含电解质的溶剂中而特意使FGF2适体的高级结构崩溃而成为伸展的状态，由此在长期保存中也防止多聚体化，通过在施用后暴露在生理性盐浓度中，由此再构建了高级结构而发挥药效的制剂配方，结果为能够长期保持FGF2适体的活性。本发明是通过详细验证了在这样的溶液中的适体的存在方式而完成的，是即使作为本领域技术人员也无法容易想到的。

根据以上所述，作为本发明的适体制剂中可使用的溶剂，优选为不包含无机盐(电解质)的水性溶剂，特别优选为水。

本发明的适体制剂由于使用上述那样的不包含无机盐(电解质)的溶剂，因而渗透压低，不能直接作为注射剂使用。因此，在本发明的适体制剂中，出于将相对于血浆渗透压的渗透压比调整为1以上、优选为1～3的目的，而包含为非电解质的渗透压调节剂(渗透剂)。

作为在本发明的适体制剂中使用的渗透压调节剂没有特别限定，只要是非电解质即可，只要是除了无机离子类(钾离子，氯化物离子等)以外通常使用的渗透压调节剂就可以使用。作为这样的渗透压调节剂，可列举多元醇(丙三醇，甘露醇，海藻糖，葡萄糖，蔗糖，山梨糖醇，肌醇等)，氨基酸类(丙氨酸，甘氨酸，谷氨酸，脯氨酸，GABA，牛磺酸，四氢嘧啶等)，甲基铵类(TMAO，胆碱，乙酰胆碱，甘氨酸甜菜碱，GPC，DMSP等)，尿素类等，优选为使用多元醇，更优选可以使用甘露醇。

对渗透压调节剂的量没有特别限定，作为本领域技术人员可以根据制剂中包含的FGF2适体的量，使用的渗透压调节剂的种类(分子量)，目的渗透压而进行适当变更。例如，当作为渗透压调节剂使用甘露醇，使相对于生理盐水的渗透压比为约1时，渗透压调节剂在注射剂总量中的配制比例成为2～7.5％(w/v)。更具体而言，使相对于生理盐水的渗透压比为1时，如果上述FGF2适体的浓度为2mg/ml，则甘露醇的配制比例成为4.9％，如果上述FGF2适体的浓度为20mg/ml，则甘露醇的配制比例成为3.6％。

本发明的适体制剂优选除了作为有效成分的针对FGF2的适体或其盐以外，实质上不含电解质。在此，“实质上不含”是指在制剂中FGF2适体可以长期稳定保存范围内，也可以含有少量的电解质。更优选在本发明的适体制剂中，除了作为有效成分的针对FGF2的适体或其盐以外不含电解质。

在本发明的适体制剂中，根据需要可以进一步含有药学上允许的添加剂。作为这样的添加剂，可以举出例如：稳定剂，保存剂，增溶剂，缓冲剂，pH调节剂，安抚剂等，可以优选使用以往作为注射剂用的添加剂而众所周知常用的为非电解质的药物添加物。

对本发明的适体制剂的pH没有特别限制，在作为注射剂使用的情况下，优选为中性附近的pH，可以在例如pH5～9、优选为6～8的范围内适当选择。由于将作为有效成分的针对FGF2的适体或其盐溶解在水中时，溶液的pH成为上述范围内，因此在本发明的适体制剂中不需要特别添加为电解质的pH调节剂，缓冲剂。

在本发明的适体制剂中，只要对FGF2适体的活性、稳定性没有不良影响，也可以配制其它活性成分。作为这样的活性成分，也可以包含作为伴随血管生成的疾病等的治疗药McGen(注册商标)，Lucentis(注册商标)，Airia(注册商标)，Avastin(注册商标)等VGEF抑制剂，类固醇等抗炎剂，作为骨疾病治疗药等的Norditropin(注册商标)，Genotropin(注册商标)等人生长激素制剂，吗啡等镇痛、镇静剂。可列举老年性黄斑变性等伴随血管生成的疾病，骨质疏松，类风湿性关节炎，骨关节炎，骨折等骨/软骨疾病，疼痛的治疗用或预防用的药物化合物。

本发明的适体制剂通过具有上述的构成，于4℃也为3个月以上稳定。在此“稳定”是指如上所述当在玻璃瓶中封入该制剂并于4℃保管后，在制剂中存在的单体适体的比例为70％以上。优选地，本发明的适体制剂，于4℃3个月保存之后的制剂中单体适体的比例为80％以上。另外，本发明的适体制剂在暴露于白色荧光灯、近紫外荧光灯的状态下也稳定。

因此，本发明的适体制剂能够直接以水性液剂的形态，优选地为填充完毕的注射器剂、药筒剂等注射剂的剂型中，通过在5℃以下的冷藏保存而长期稳定地保存，操作极其容易。

本发明的适体制剂优选可以作为例如：老年性黄斑变性等伴随血管生成的疾病，骨质疏松，类风湿性关节炎，骨关节炎，骨折等骨/软骨疾病，疼痛的治疗用或预防用的药物使用。

本发明的适体制剂可以非经口地(例如：静脉内施用，皮下施用，肌内施用，局部施用，腹膜内施用，经鼻施用，经肺施用，滴眼施用等)施用。本发明的适体制剂的施用量，根据FGF2适体的种类、活性，病的危重度，作为施用对象的动物种类，施用对象的药物接受性、体重，年龄等而不同，通常，以成人每天有效成分(适体的寡核苷酸部分)的量计可以为约0.0001～约100mg/kg，例如约0.0001～约10mg/kg、优选为约0.005～约1mg/kg。

实施例

以下，结合实施例对进行更为详细的说明，但本发明并不限定于这些实施例。

实施例1(溶剂中的FGF2适体的结构分析：Tm值的确定)

将适体ID1所示的适体的结构示于以下。大写文字表示RNA，小写文字表示DNA，idT表示反向dT。需要说明的是，在各核苷酸中的括号示出了其2′位的修饰，F表示氟原子，M表示O-甲基。C6为-(CH

适体ID1：

GL2-400TS-C6-G(M)G(M)G(M)A(M)U(M)A(M)C(M)U(F)A(M)G(M)G(M)GC(M)A(M)U(M)U(F)A(M)A(M)U(M)G(M)U(F)U(M)A(M)C(M)C(M)A(M)GU(F)GU(F)A(M)G(M)U(M)C(M)C(M)C(M)-idT

将适体ID1表示的适体以0.1mg/mL用水，以0.06mg/mL用PBS或生理盐水进行溶解。将得到的溶液于95℃加热5分钟后，冷却到室温，填充到石英玻璃制的比色皿中。将温度从20℃变化到90℃，同时利用分光光度计测定UV吸收而确定Tm值。

结果，在PBS中为60.1℃，生理盐水中为69.6℃。另一方面，在水中未观察到特定的Tm值。由此设想，以适体ID1表示的适体在能够成为通常注射剂的溶剂的PBS、生理盐水中，由于分子间相互作用而形成了高级结构。另外，设想以适体ID1表示的适体在不包含电解质的水中，在分子间，分子内没有形成碱基对，没有构成高级结构。

实施例2(重水中的FGF2适体的结构分析：NMR谱的测定)

将20mg的以适体ID1表示的适体填充到玻璃制小瓶中，使其溶解于约1mL的重水而制成了测定样品。使用Bruker Avance 600MHz NMR光谱仪进行测定。结果，未观察到在低于8ppm的低磁场中应该观察到的来自碱基对形成的亚氨基质子信号。

由此，设想以适体ID1表示的适体在不包含电解质的水中，在分子间，分子内没有形成碱基对，没有构成高级结构。

实施例3(在包含电解质的溶液中的FGF2适体的结构分析：SEC-MALS测定)

将以适体ID1表示的适体以20mg/mL溶解在生理盐水中，于37℃温育2周而人工地制备了形成高级结构的FGF2适体制剂。将其与制备之后立即进行冷冻保存而将使高级结构的形成为最小限度的样品以0.2mg/mL用生理盐水分别进行稀释而进行了分析。

通过尺寸排阻层析法将单体与多聚体分离，将各自的分子量利用WyattTechnology公司的MALS(多角度光散射，Multi Angle Light Scattering)检测器进行测定。尺寸排阻层析法通过Waters公司制ACQUITYUPLC使用BEH200 SEC柱实施。

结果，测定得被认为是单体的峰的分子量为约64000，被认为是由多聚体构成的高级结构的峰的分子量为约122000。根据该结果可知，以适体ID1表示的适体在包含的电解质水中形成的高级结构为二聚体。

实施例4(适体的单体含有率与结合活性的关联)

将以适体ID1表示的适体以20mg/mL或2mg/mL用PBS，生理盐水或3.3％的甘露醇水溶液进行溶解，在表1中所示的保存条件下制备了显示各种单体含有率的FGF2适体制剂。其中，制备的各FGF2适体制剂的单体含量通过尺寸排阻层析法确定。将其结果也示于表1。

制备的各FGF2适体制剂的与FGF2蛋白质的结合活性使用GE公司制的BiacoreT200通过表面等离子共振(SPR)进行测定。感应器芯片使用了与氨基进行反应的CM4。将人FGF2溶解于固定溶液(10mM乙酸钠，pH6)中，使浓度为10μg/mL。在蛋白质侧的氨基和芯片侧的羧基的反应中使用了乙基-3-碳二亚胺盐酸化物和N-羟基琥珀酰亚胺。反应之后，进行了利用乙醇胺的封闭。使FGF2的固定量为约1000RU。将分析用的适体制备为5μM。在运行缓冲液中使用了295mM氯化钠，5.4mM氯化钾，0.8mM氯化镁，1.8mM氯化钙，20mM Tris，0.05％Tween20，pH 7.6)，作为再生溶液使用了2M氯化钠。FGF2通过固定于流动池(flow cell)FC2，或FC4，减去FC1或FC3的结果由此形成最终的传感图(Sensorgram)。对活性而言，以相对于FGF2适体制剂标准的相对值进行了评价，所述FGF2适体制剂标准利用不包含电解质的溶液在用时才制备，多聚体含量极其低。

将各FGF2适体制剂的制备方法，单体含有率及与FGF2蛋白质的结合活性的测定结果示于表1。根据该结果可知，FGF2适体制剂的单体的含量和对FGF2蛋白质的结合活性是相关的。

[表1]

FGF2适体制剂的单体含有率和与FGF2蛋白质的结合活性

实施例5(FGF2适体制剂的稳定性试验)

将以适体ID1表示的适体以20mg/mL或2mg/mL溶解于3.3％或3.6％或4.9％的甘露醇溶液中，在表2所示的各种温度条件下保存3个月后，通过尺寸排阻层析法及SPR法测定了单体含有率和结合活性。将结果示于表2中。

根据该结果可知，利用不包含电解质的甘露醇水溶液制备的FGF2适体制剂是稳定的。

[表2]

FGF2 适体制剂的稳定性试验结果

实施例6(其它FGF2适体制剂中的结果)

将以适体ID2～6表示的适体，利用水(甘露醇水溶液)，生理盐水或PBS以适当的浓度进行溶解，制备了FGF2适体制剂。将得到的各FGF2适体制剂在各种温度条件、保存温度中保存数月后，通过尺寸排阻层析法及SPR法测定了单体含有率和结合活性。

适体ID2：

GL2-400TS-C6-C(M)G(M)G(M)A(M)U(M)A(M)C(M)U(F)A(M)G(M)G(M)GC(M)A(M)U(M)U(F)A(M)A(M)U(M)G(M)U(F)U(M)A(M)C(M)C(M)A(M)GU(F)GU(F)A(M)G(M)U(M)C(M)C(M)G(M)-idT；

适体ID3：

GL2-400TS-C6-C(M)C(M)G(M)A(M)U(M)A(M)C(M)U(F)A(M)G(M)G(M)GC(M)A(M)U(M)U(F)A(M)A(M)∪(M)G(M)∪(F)∪(M)A(M)C(M)C(M)A(M)GU(F)GU(F)A(M)G(M)U(M)C(M)G(M)G(M)-idT；

适体ID4：

GL2-400TS-C6-G(M)G(M)G(M)A(M)U(M)A(M)C(M)U(F)A(M)G(M)G(M)GC(M)G(M)U(M)U(F)A(M)A(M)C(M)G(M)U(F)U(M)A(M)C(M)C(M)A(M)GU(F)GU(F)A(M)G(M)U(M)C(M)C(M)C(M)idT-；

适体ID5：

GL2-400TS-C6-G(M)G(M)G(M)A(M)U(M)A(M)C(M)U(F)A(M)G(M)G(M)GC(M)A(M)U(M)U(F)U(M)A(M)U(M)G(M)U(F)U(M)A(M)C(M)C(M)A(M)GU(F)GU(F)A(M)G(M)U(M)C(M)C(M)C(M)idT-；及

适体ID6：

idT-G(M)G(M)G(M)A(M)U(M)A(M)C(M)U(F)A(M)G(M)G(M)GC(M)A(M)U(M)U(F)A(M)A(M)U(M)G(M)U(F)U(M)A(M)C(M)C(M)A(M)GU(F)GU(F)A(M)G(M)U(M)C(M)C(M)C(M)-C6-GL2-400TS

根据这些结果可知，在其它FGF2适体中，利用不包含电解质的甘露醇水溶液制备FGF2适体制剂也是稳定的。

比较例1(FGF2适体制剂的稳定性试验)

将以适体ID1表示的适体利用生理盐水或PBS以20mg/mL进行溶解，制备了FGF2适体制剂。将得到的各FGF2适体制剂在表3所示的各种温度条件下保存3个月后，通过尺寸排阻层析法测定了单体含有率。将结果示于表3。根据该结果可知，利用包含电解质的生理盐水、PBS制备的FGF2适体制剂是不稳定的。

[表3]

用含有电解质的溶液制备的FGF2适体制剂的稳定性试验结果

工业实用性

本发明的适体制剂由于将针对FGF2的适体或其盐以注射剂等水性液剂的形态，即使冷藏保存也能够长期稳定保存，因此作为对于通过抑制FGF2能够发挥药效的疾病(例如，老年性黄斑变性等伴随血管生成的疾病，骨质疏松，类风湿性关节炎，骨关节炎，骨折等骨/软骨疾病，疼痛)的治疗或预防剂，从能提供操作性优异的制剂方面而言极其有用。

本申请以在日本申请的日本特愿2018-124390(申请日：2018年6月29日)为基础，并将其内容全部并入本说明书。