一种人源免疫细胞培养方法

技术领域

本发明涉及一种细胞培养方法，特别是一种人源免疫细胞培养方法。

背景技术

随着发病率和死亡率的迅速增加，肿瘤己经成为危害世界公众人群健康的最主要原因，是值得密切关注的公共健康问题。免疫治疗的出现，给肿瘤的治疗带来了新的希望，而CAR-T细胞治疗是目前最有前景的肿瘤免疫治疗手段之一。CAR-T细胞治疗是一种利用嵌合抗原受体T细胞进行过继细胞回输从而快速建立肿瘤免疫来治疗肿瘤的方法，过继回输的CAR-T细胞能够消除大小不等肿瘤负荷，是最有希望的肿瘤治疗策略之一，CAR-T细胞治疗已经在多种肿瘤中都展现出良好的治疗效果。但是就目前的临床结果来看，CAR-T细胞治疗其实也仅在血液系统肿瘤中效果较好，而在实体瘤中并没有达到预期的效果，其原因可能在于，实体瘤中有多种免疫逃逸机制的存在，易形成肿瘤免疫抑制的微环境(Tumorimmunosuppression microenvironment，TIME)来抑制CAR-T细胞的功能。尽管有众多研究人员尝试了多种解决方案，但这样的问题仍未被有效克服。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种人源免疫细胞培养方法，以克服现有技术中的不足。

为实现前述发明目的，本发明采用了如下技术方案：

本发明实施例提供了一种人源免疫细胞培养方法，其包括：

提供颗粒状的三维多孔复合材料，所述三维多孔复合材料包括由二硫化钼纳米片和石墨烯材料形成的三维多孔骨架结构，所述三维多孔复合材料所含孔洞的孔径为200-800μm、孔隙率为90-96％；

在室温下，将所述三维多孔复合材料于含有250-800mg/L L-亮氨酸和300-500mg/L层粘连蛋白的磷酸盐缓冲液中浸渍2-8h，之后取出并在室温下自然干燥；

将所述三维多孔复合材料分散于含人源免疫细胞的人源免疫细胞无血清培养基中共孵育24-48h，之后离心分离出其中的人源免疫细胞。

在一些实施方式中，所述的人源免疫细胞培养方法包括：将氧化石墨烯在混合强酸溶液中浸泡2h以上，其中所述混合强酸采用HNO

在一些实施方式中，所述混合强酸采用体积比为1：1-2的HNO

在一些实施方式中，所述的人源免疫细胞培养方法包括：将所述石墨烯材料及二硫化钼纳米片分散于DMSO中，之后加入苯胺低聚物，超声分散，之后进行抽滤，将滤出物在60-80℃干燥，之后破碎为粒径在1-2mm的颗粒。

在一些实施方式中，所述石墨烯材料与二硫化钼纳米片的质量比为1：0.2-0.5。

在一些实施方式中，所述石墨烯材料与苯胺低聚物的质量比为1：1.5-3。

在一些实施方式中，所述苯胺低聚物包括苯胺三聚体或苯胺四聚体。

在一些实施方式中，所述二硫化钼纳米片的片径为300-500nm，厚度为1-2nm。

在一些实施方式中，所述二硫化钼纳米片的纯度在98％以上。

在一些实施方式中，所述石墨烯材料的片径为200-300nm，厚度为1-2nm。

与现有技术相比，本发明提供的人源免疫细胞培养方法可以使人源免疫细胞高效扩增，且使其免疫功能得到明显增强，在应用于实体肿瘤的治疗时，能有效对抗肿瘤免疫抑制微环境，从而能够更有效的杀伤实体肿瘤细胞，同时该方法简单易操作，成本低且安全无副作用。

具体实施方式

下面结合若干实施例对本发明作进一步的详细描述。

实施例1：

(1)将市售氧化石墨烯在混合强酸溶液中浸泡2h，其中混合强酸采用体积比为1：1的HNO

(2)将所述石墨烯材料及二硫化钼纳米片分散于DMSO中，其中，石墨烯材料与二硫化钼纳米片的质量比为1：0.2，二硫化钼纳米片的片径为300-500nm、厚度为1-2nm、纯度在98％以上，之后加入苯胺四聚体，使石墨烯材料与苯胺四聚体的质量比为1：1.5，超声分散，之后进行抽滤，将滤出物在60℃真空干燥，之后破碎为粒径在1-2mm的颗粒，即为三维多孔复合材料，其中所含孔洞的孔径为200-800μm、孔隙率为90-96％；

(3)在室温下，将所述三维多孔复合材料于含有250mg/L L-亮氨酸和300mg/L层粘连蛋白的磷酸盐缓冲液中浸渍2h，之后取出并在室温下自然干燥；

(4)将所述三维多孔复合材料分散于含间皮素CAR-T细胞的LONZA X-VIVO 15无血清免疫细胞培养基中共孵育24h，之后离心分离出其中的人源免疫细胞。

实施例2：

(1)将市售氧化石墨烯在混合强酸溶液中浸泡3h左右，其中混合强酸采用体积比为1：2的HNO

(2)将所述石墨烯材料及二硫化钼纳米片分散于DMSO中，其中，石墨烯材料与二硫化钼纳米片的质量比为1：0.5，二硫化钼纳米片的片径为300-500nm、厚度为1-2nm、纯度在98％以上，之后加入苯胺三聚体，使石墨烯材料与苯胺三聚体的质量比为1：3，超声分散，之后进行抽滤，将滤出物在80℃真空干燥，之后破碎为粒径在1-2mm的颗粒，即为三维多孔复合材料，其中所含孔洞的孔径为200-800μm、孔隙率为90-96％；

(3)在室温下，将所述三维多孔复合材料于含有800mg/L L-亮氨酸和500mg/L层粘连蛋白的磷酸盐缓冲液中浸渍8h，之后取出并在室温下自然干燥；

(4)将所述三维多孔复合材料分散于含间皮素CAR-T细胞的LONZA X-VIVO 15无血清免疫细胞培养基中共孵育48h，之后离心分离出其中的人源免疫细胞。

实施例3：

(1)将市售氧化石墨烯在混合强酸溶液中浸泡2h，其中混合强酸采用体积比为1：2的HNO

(2)将所述石墨烯材料及二硫化钼纳米片分散于DMSO中，其中，石墨烯材料与二硫化钼纳米片的质量比为1：0.3，二硫化钼纳米片的片径为300-500nm、厚度为1-2nm、纯度在98％以上，之后加入苯胺三聚体，使石墨烯材料与苯胺三聚体的质量比为1：2，超声分散，之后进行抽滤，将滤出物在60-80℃真空干燥，之后破碎为粒径在1-2mm的颗粒，即为三维多孔复合材料，其中所含孔洞的孔径为200-800μm、孔隙率为90-96％；

(3)在室温下，将所述三维多孔复合材料于含有400mg/L L-亮氨酸和350mg/L层粘连蛋白的磷酸盐缓冲液中浸渍6h，之后取出并在室温下自然干燥；

(4)将所述三维多孔复合材料分散于含间皮素CAR-T细胞的LONZA X-VIVO 15无血清免疫细胞培养基中共孵育48h，之后离心分离出其中的人源免疫细胞。

对照例1：本对照例与实施例1基本相同，但步骤(2)中未添加二硫化钼纳米片。

对照例2：本对照例与实施例1基本相同，但步骤(2)中未添加石墨烯材料。

对照例3：本对照例与实施例1基本相同，但步骤(2)中未添加苯胺四聚体。

对比例4：依照常规方法，将间皮素CAR-T细胞于LONZA X-VIVO 15无血清免疫细胞培养基中培养48h。

对实施例1-3及对照例1-4所获得的间皮素CAR-T细胞的数量进行检测，可以发现，其扩增数量的排序为：实施例3产品、实施例2产品、实施例1产品、对比例2产品、对比例3产品、对比例1产品、对比例4产品。

取实施例1-3及对照例1-4所获得的间皮素CAR-T细胞分别在体外与食管癌细胞共孵育，并检测其对食管癌细胞的杀伤情况，可以看到，这些间皮素CAR-T细胞在体外对食管癌细胞都有较好杀伤效果，但杀伤效力的排序为：实施例3产品、实施例1产品、实施例2产品、对比例3产品、对比例2产品、对比例1产品、对比例4产品。

另将实施例1-3及对照例1-4所获得的间皮素CAR-T细胞分别注射到患有食道癌的活体小鼠的肿瘤组织内，并检测其治疗效果，结果显示，实施例3产品、实施例1产品、实施例2产品能使肿瘤组织在3天-一周迅速缩小30％-50％体积，而对比例2产品、对比例3产品能使肿瘤组织在一周内微幅缩小5％-8％体积，对比例1、4产品使肿瘤组织在一周内维持体积基本不变。

应当理解，对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。