通过全血提取DNA进行qPCR扩增检测获取BsmI与PvuⅡ位点碱基序列的方法
文献发布时间:2023-06-19 10:16:30
技术领域
本发明涉及基因检测技术领域,尤其涉及一种通过全血提取DNA进行qPCR扩增检测获取BsmI与PvuⅡ位点碱基序列的方法。
背景技术
骨质疏松是一种全身骨代谢性疾病,其主要特征是骨量减少及骨微结构改变,伴随骨强度下降、骨脆性增加及骨折危险性增加等。根据流行病学统计,我国50岁以上人群中骨质疏松的患病率女性为20.7%,男性为14.4%。并且根据全球的流行病学调查,各国的骨质疏松的患病率均较高。骨质疏松的发病与多种因素相关,其中性别因素和年龄因素对骨质疏松发生的相关性最大。骨质疏松导致的疼痛和骨折严重的影响了患者的生活质量,危及患者生存,而现有的治疗手段对骨质疏松的治疗效果相对有限。在老年女性中,病理性骨折多继发于骨质疏松症之后,骨质疏松性骨折致残致死率高,目前其病死率已超过老年女性罹患乳腺癌、宫颈癌及子宫体癌病死率的总和。
目前临床上诊断骨质疏松的方法主要有:1.医生询查既往病史,通过病史提供可能患有骨质疏松的高危因素,比如酗酒,大量吸烟,绝经前双侧卵巢切除术等,然后还需要进一步的检查。2.测量骨量,以测量骨矿含量和骨密度为依据,但是骨折及骨质疏松的发生不仅仅依赖于骨量。3.超声骨测定,测量超声通过骨组织的速度,振幅衰减和硬度指数反映骨结构和骨量。
现有诊断骨质疏松的方法主要有如下缺点:1.医生询查既往病史只能提供参考,并不能准确判断是否患有骨质疏松。2.骨量测量是现在常用的手段,但是是否发生骨折主要是有骨强度决定的,而骨强度由骨量、骨质量、骨骼的构成成分及骨的外形等多方面组成,因此仅仅通过骨量进行判断也不够准确。3.超声测量的结果不是骨密度或骨矿含量,不能与真值相比,需要更多的观察资料,此外超声设备巨大不便移动,每次测量成本较高等缺点。因此一种改进的诊断骨质疏松的产品是目前市场需要的。
发明内容
本发明的提供一种通过全血提取DNA进行qPCR扩增检测获取BsmI与PvuⅡ位点碱基序列的方法。
本发明的方案是:
一种通过全血提取DNA进行qPCR扩增检测获取BsmI与PvuⅡ位点碱基序列的方法,包括下列步骤:
1)所需DNA样本制备,通过全血提取样本DNA,获得的样本DNA后,置于-20℃~4℃中保存待用;
2)样本DNA的qPCR扩增,取步骤1)中的样品DNA进行稀释,稀释至5~30ng/μL,然后在PCR管中构建反应体系,然后送入PCR扩增仪器中,设定好反应程序进行反应,反应完成后获得目的基因;
3)位点检测,将步骤2)中的目的基因进行检测,获得检测报告。
通过检测BsmI位点和PvuⅡ位点的碱基序列,判断骨质疏松的风险。
作为优选的技术方案,所述全血提取样本DNA如下所示:
1-mL Tip头剪去尖头,插移液器上,伸入采血管中反复吹打全血3~4次,沉淀的白细胞充分悬浮,转移全血至EP管中,加MGS裂解液,加蛋白酶K混匀,在60℃的水浴锅中加热10min~15min,混匀次数大于2次;
从水浴锅中取出EP管,将EP管内溶液全部倒入离心吸附柱中,吸附柱放入收集管内,8000rpm,离心1min,取出吸附柱,倒掉收集管中废液;
向吸附柱中加入清洗液
漂洗处理两次,完成后取出吸附柱,倒掉收集管中的废液,将吸附柱重新放回收集管中,12000rpm,离心1min,除去残留的乙醇;
将吸附柱置于新的1.5ml离心管中室温环境干燥2-3min;向吸附柱靠近吸附膜中央悬空滴加60℃的洗脱液ET,12000rpm,离心1-2min,离心管内收集到液体即为样本DNA溶液,盖盖子后轻拨离心管内液体混匀。
作为优选的技术方案,所述漂洗处理为向吸附柱中加入漂洗液Wash,8000rpm,离心30s,取出吸附柱,倒掉收集管中废液。
作为优选的技术方案,所述步骤2)中反应体系如下:
作为优选的技术方案,MGB-TaqMan-FAM在Apa I位点采用FAM6,其余均为FAM。
作为优选的技术方案,所述步骤2)中反应程序如下:
S3至S4进行45次循环。
由于采用了上述技术方案一种通过全血提取DNA进行qPCR扩增检测获取BsmI与PvuⅡ位点碱基序列的方法,1)所需DNA样本制备,通过全血提取样本DNA,获得的样本DNA后,置于-20℃~4℃中保存待用;2)样本DNA的qPCR扩增,取步骤1)中的样品DNA进行稀释,稀释至5~30ng/μL,然后在PCR管中构建反应体系,然后送入PCR扩增仪器中,设定好反应程序进行反应,反应完成后获得目的基因;3)位点检测,将步骤2)中的目的基因进行检测,获得检测报告。
本发明的优点:操作步骤简单,图形结果直观,易于解读,缩短了检测时间,提高了检测效率,提升了检测的准确性;
提供了有效的信息,从而对提高了对骨质疏松风险的预测准确度。
附图说明
图1为本发明实施例VDR BsmI检测位点GG扩增曲线图;
图2为本发明实施例VDR BsmI检测位点AG扩增曲线图;
图3为本发明实施例VDR BsmI检测位点AA扩增曲线图;
图4为本发明实施例ESR PvuⅡ检测位点AA扩增曲线图;
图5为本发明实施例ESR PvuⅡ检测位点AG扩增曲线图;
图6为本发明实施例ESR PvuⅡ检测位点GG扩增曲线图。
图7为本发明分析流程图;
图8为本发明实施例罗氏480分析软件选择分析位点界面图;
图9为本发明实施例罗氏480分析软件选择分析样品界面图;
图10为本发明实施例罗氏480分析软件选择分析参数界面图;
图11为本发明实施例罗氏480分析软件选择通道FAM界面图;
图12为本发明实施例罗氏480分析软件FAM分析结果界面图;
图13为本发明实施例罗氏480分析软件更换分析通道界面图;
图14为本发明实施例罗氏480分析软件的VIC通道界面图;
图15为本发明实施例罗氏480分析软件的将分析通道单独导入读取软件界面图;
图16为本发明实施例罗氏480分析软件显示FAM通道扩增图的界面图;
图17为本发明实施例罗氏480分析软件显示VIC通道扩增图的界面图;
图18为本发明实施例罗氏480分析软件显示FAM和VIC双通道扩增图的界面图。
具体实施方式
为了弥补以上不足,本发明提供了一种通过全血提取DNA进行qPCR扩增检测获取BsmI与PvuⅡ位点碱基序列的方法以解决上述背景技术中的问题。
一种通过全血提取DNA进行qPCR扩增检测获取BsmI与PvuⅡ位点碱基序列的方法,包括下列步骤:
1)所需DNA样本制备,通过全血提取样本DNA,获得的样本DNA后,置于-20℃~4℃中保存待用;
2)样本DNA的qPCR扩增,取步骤1)中的样品DNA进行稀释,稀释至5~30ng/μL,然后在PCR管中构建反应体系,然后送入PCR扩增仪器中,设定好反应程序进行反应,反应完成后获得目的基因;
3)位点检测,将步骤2)中的目的基因进行检测,获得检测报告。
通过检测BsmI位点和PvuⅡ位点的碱基序列,判断骨质疏松的风险。
所述全血提取样本DNA如下所示:
1-mL Tip头剪去尖头,插移液器上,伸入采血管中反复吹打全血3~4次,沉淀的白细胞充分悬浮,转移全血至EP管中,加MGS裂解液,加蛋白酶K混匀,在60℃的水浴锅中加热10min~15min,混匀次数大于2次;
从水浴锅中取出EP管,将EP管内溶液全部倒入离心吸附柱中,吸附柱放入收集管内,8000rpm,离心1min,取出吸附柱,倒掉收集管中废液;
向吸附柱中加入清洗液
漂洗处理两次,完成后取出吸附柱,倒掉收集管中的废液,将吸附柱重新放回收集管中,12000rpm,离心1min,除去残留的乙醇;
将吸附柱置于新的1.5ml离心管中室温环境干燥2-3min;向吸附柱靠近吸附膜中央悬空滴加60℃的洗脱液ET,12000rpm,离心1-2min,离心管内收集到液体即为样本DNA溶液,盖盖子后轻拨离心管内液体混匀。
所述漂洗处理为向吸附柱中加入漂洗液Wash,8000rpm,离心30s,取出吸附柱,倒掉收集管中废液。
所述步骤2)中反应体系如下:
MGB-TaqMan-FAM在Apa I位点采用FAM6,其余均为FAM。
作为优选的技术方案,所述步骤2)中反应程序如下:
S3至S4进行45次循环。
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解,下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。
实施例:
提取全血中DNA
1、1-mL Tip头剪去尖头,插移液器上伸入采血管中反复吹打全血3-4次,使沉淀的白细胞充分悬浮,转移200μl全血至2ml EP管中,加入200μl MGS裂解液,20μl蛋白酶K混匀,在60℃水浴锅中加热10min(不超过15min),期间至少混匀2~3次,否则血红蛋白抱团结块。
2、从水浴锅中取出样品,将溶液全部倒入离心吸附柱中,吸附柱放入收集管内,8000rpm,离心1min,取出吸附柱,倒掉收集管中废液。
3、向吸附柱中加入500μl清洗液
4、向吸附柱中加入500μl漂洗液Wash,8000rpm,离心30s,取出吸附柱,倒掉收集管中废液。
5、重复4一次。
6、取出吸附柱,并倒掉收集管中的废液,将吸附柱重新放回收集管中,12000rpm,离心1min,以尽量除去残留的乙醇。
7、将吸附柱置于新的1.5ml离心管中室温环境干燥2-3min。
8、向吸附柱靠近吸附膜中央悬空滴加50-100μl洗脱液ET(预先将洗脱液ET在65℃预热使用可以提高洗脱效率)。12000rpm,离心1-2min,离心管内收集到液体即为DNA溶液。盖盖子后轻拨离心管内液体混匀。根据用途将样品DNA置于4℃或-20℃长期保存。
9、可直接用于PCR、酶切、建库及测序反应等。
qPCR扩增
质检合格的DNA样本稀释至5-30ng/μL;
qPCR反应体系
罗氏480反应程序
按照结果判读标准判读结果并出具检测报告;罗氏480分析软件操作如图8至图18,从而对扩增曲线分析;
通过检测BsmI位点和PvuⅡ位点的碱基序列,判断骨质疏松的风险,见图1至图6;
骨质疏松风险判读
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征及本发明的优点。本行业的技术人员应该了解,本发明不受上述实施例的限制,上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理,在不脱离本发明精神和范围的前提下,本发明还会有各种变化和改进,这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
- 通过全血提取DNA进行qPCR扩增检测获取BsmI与PvuⅡ位点碱基序列的方法
- 一种通过全血提取DNA进行PCR扩增测序分析方法