一种呼吸道病毒检测试剂盒和方法

技术领域

本专利涉及一种临床检验用途的病毒检测试剂盒，采用探针Taqman实时荧光定量PCR技术，用于SARS-COV-2病毒的核酸检测。该试剂盒采用双重PCR 的方法，使用人源内标RNase P，有效质控全过程，降低假阴性。

背景技术

冠状病毒(Covs)是感染人类和动物的重要病原体，通常与呼吸道和胃肠道感染有关。Covs是直径为100-160纳米的球囊包膜病毒。每个病毒中包含一个27-32kb的正链单链rna基因组。病毒包膜包含三种不同的蛋白质:膜蛋白 (m)、包膜蛋白(e)和穗蛋白(s)。M蛋白结合核衣壳，参与病毒的组装和出芽， E蛋白参与病毒的形成和释放。S蛋白形成识别细胞受体的同源三聚体，从而协助病毒进入靶标细胞。此前，covs一直被认为是人类的次要病原体，通常认为只和普通感冒或轻微呼吸道感染有关，极少数例外会引起婴儿、幼儿和老年人的严重感染，直到2002年SARS爆发完全扭转了以前人们对冠状病毒的认识。这种由冠状病毒引起的严重急性呼吸道综合征可导致高达10％的死亡率。而2019年末爆发的COVID-19，虽然总体的致死率低于SARS，但是由于其起病更加隐匿，主诉症状更加不典型，潜伏期更是长达14天等特征，使得其防控难度非常大，SARS CoV-2的全球传播系数接近3，高于SARS和MERS。

SARS CoV-2核酸检测在冷链食品的防疫检测和高风险人群的核酸筛查方面都具有重要意义。核酸试剂盒的市场需求巨大。本专利采用双重PCR的方法，以目前多数采用的病毒ORF1ab区和N区作为目标片段采用不同荧光基团标记的 Taqman探针，在同一管内实现SARS CoV-2的目标片段和人源内标基因的同时检测，可以有效质控整个检测过程，避免由于核酸质量问题所造成的假阴性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种更为准确的呼吸道病毒检测试剂盒，特异性好，灵敏度高。

一种呼吸道病毒检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒用于检测 SARS-COV-2病毒的ORF1ab区域和N区，包括以下引物和探针：扩增ORF1ab 区域扩增引物ORF1ab-F、ORF1ab-R，探针ORF1ab-probe；扩增N区域扩增引物N-F、N-R，探针N-probe，其序列如下：

ORF1ab-F：TCTGCGGTATGTGGAAAGG

ORF1ab-R:TTATCATTGTAGATGTCAAAAGCC

ORF1ab-probe：FAM-TTGTGATCAACTCCGCGAACCCAT-BHQ1

N-F：GGCAGTAACCAGAATGGAGAAC

N-R:ATTTGGTCATCTGGACTGCTATT

N-probe：FAM-CAAAACAACGTCGGCCCCAAGGT-BHQ1.

进一步的，所述检测试剂盒还包括用于检测人源内标基因RNase P基因的以下引物和探针：扩增内标基因RNase P基因的扩增引物Rnase-P-F、Rnase-P-R，探针Rnase-P-probe，其序列如下：

Rnase-P-F：ATTGGGTGTTCAAGAGGAGG

Rnase-P-R：TCCCACTACAGCCCACTCC

Rnase-P-Probe：VIC-CAACAGGAAGACACCTTGGGGGAAC–BHQ1.

进一步的，本发明的试剂盒分别提供了阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为含有相应目的片段的合成质粒溶液；所述阴性对照为无相应目的片段溶液。

本发明还提供了一种呼吸道病毒检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)提取血清的病毒RNA；

(2)将RNA反转录为cDNA；

(3)扩增：检测体系qPCR扩增反应液包括：ReverTra Ace qPCR RT Kit(T OYOBO公司)；THNDERBIRD Probe qPCR Mix(2×)、ORF1ab上、下游引物各0.8uM、ORF1ab探针0.4uM；N上、下游引物各0.8uM、N-probe(探针) 0.4uM；Rnase-P上、下游引物各0.8uM、Rnase-P-probe(探针)0.4uM；其序列为：

ORF1ab-F：TCTGCGGTATGTGGAAAGG

ORF1ab-R:TTATCATTGTAGATGTCAAAAGCC

ORF1ab-probe：FAM-TTGTGATCAACTCCGCGAACCCAT-BHQ1

N-F：GGCAGTAACCAGAATGGAGAAC

N-R:ATTTGGTCATCTGGACTGCTATT

N-probe：FAM-CAAAACAACGTCGGCCCCAAGGT-BHQ1

Rnase-P-F：ATTGGGTGTTCAAGAGGAGG

Rnase-P-R：TCCCACTACAGCCCACTCC

Rnase-P-Probe：VIC-CAACAGGAAGACACCTTGGGGGAAC–BHQ1；

反应条件：95℃预变性1min；95℃15s，58℃35sec 40个循环；

(4)结果判断：将阈值线调整至背景信号及阴性扩增线以上，根据扩增曲线和阈值线读取Ct值；

1)内标和阳性参考均为阳性时，检测结果才认为有效；

2)阳性判断标准：Ct<36，为阳性；35≤Ct≤38，为疑似阳性，需要再次验证；Ct＞38，为阴性。

3)核酸检测结果判定标准：当ORF1ab区和N区均为阳性时判定为病毒感染阳性；当ORF1ab区和N区一阴一阳时则需要重新检测；当两者都为阴性时则判定为核酸检测阴性结果。

本发明的有益效果：本发明将实时荧光PCR技术结合采用Taqman探针，利用双重PCR的方法，分别在目的基因和内标基因上连接不同激发光的荧光基团，将两对引物和两条探针混合添加到1个样本核酸中，实现目的基因和内标基因的同管检测，有效的监测实验的全过程，避免了由于核酸质量问题所导致的假阳性，另外目标基因和内标基因的同管检测也有助于提高单次上机的检测样本量，提高机器的使用效率。另外该方法可以在减少检测人员工作量的同时大大降低由于实验繁复性所带来的失误。另外本发明选取了SARS CoV-2病毒的两个区域ORF1ab 和N区作为目标片段，只有2个区域的结果均解读为阳性，才判定为阳性样本，这样可以一定程度降低假阳性的发生。本发明所述试剂盒特异性好，灵敏度高，操作简便。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应当注意的是，实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法：譬如，奥斯柏和金斯顿主编的《精编分子生物学实验指南》第四版，或者按照制造厂商所建议的步骤和条件。

实施例1

检测SARS-COV-2冠状病毒的的试剂盒，包括

(i)病毒RNA抽提试剂；

(ii)检测体系qPCR反应液；

(iii)阳性对照品和阴性对照品。

其中，病毒RNA抽提试剂可购自天根RNA抽提试剂盒等商品化试剂。

检测体系qPCR扩增反应液包括：ReverTra Ace qPCR RT Kit(TOYOBO 公司)；THNDERBIRD Probe qPCR Mix(2×)、ORF1ab上、下游引物各0.8u M、ORF1ab探针0.4uM；N上、下游引物各0.8uM、N-probe(探针)0.4uM； Rnase-P上、下游引物各0.8uM、Rnase-P-probe(探针)0.4uM；其序列为：

ORF1ab-F：TCTGCGGTATGTGGAAAGG

ORF1ab-R:TTATCATTGTAGATGTCAAAAGCC

ORF1ab-probe：FAM-TTGTGATCAACTCCGCGAACCCAT-BHQ1

N-F：GGCAGTAACCAGAATGGAGAAC

N-R:ATTTGGTCATCTGGACTGCTATT

N-probe：FAM-CAAAACAACGTCGGCCCCAAGGT-BHQ1

Rnase-P-F：ATTGGGTGTTCAAGAGGAGG

Rnase-P-R：TCCCACTACAGCCCACTCC

Rnase-P-Probe：VIC-CAACAGGAAGACACCTTGGGGGAAC–BHQ1。

实施例2

病毒基因组DNA/RNA抽提试剂盒(天根生物)的操作流程：

(1)抽提血清中的病毒DNA/RNA：

1)在离心管中加入200ul血清(室温平衡)。

2)加入20μl蛋白酶K溶液。

3)加入200μl carrier RNA工作液混匀，56℃孵育15min，简短离心以去除管盖内壁的水珠。

4)加入250μl无水乙醇，充分振荡混匀15秒，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。

5)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个RNase-free吸附柱CR2中(吸附柱放入收集管中)，8000rpm离心1min，倒掉废液，将吸附柱CR2放回收集管中。

6)向吸附柱CR2中加入500μl缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，8000rpm离心1min，倒掉废液，将吸附柱CR2放入收集管中。

7)向吸附柱CR2中加入600μl漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，静置2min，8000rpm离心1min，倒掉废液，将吸附柱放入收集管中。

8)重复一次。

9)在CR2中加入500ul无水乙醇，8000rpm离心1min，弃废液。

10)将吸附柱放回收集管中，12000rpm离心3分钟，倒掉废液。将吸附柱置于室温放置3分钟，以彻底晾干。

11)将吸附柱转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加 20-150μlddH2O，室温放置5分钟，12000rpm离心1分钟，将溶液收集到离心管中。

(2)参考TOYOBO公司的Rever Tra Ace qPCR RT Kit试剂盒说明书，将 RNA反转录为cDNA。

(3)试剂配置：按检测人份数配置检测体系PCR反应液各X ul，每人份23ul 分装：

X＝23ul反应液×(n份标本+1份阳性对照+1份阴性对照+1份空白对照)；

(4)加样：加入检测体系PCR反应液中2ulcDNA；阳性对照和阴性对照直接加2ul阳性对照品和阴性对照品；空白对照加2ul生理盐水或不加任何物质。

(5)检测：检测在实时荧光PCR仪上进行，可用仪器包括ABI7300，7500(美国Applied Biosystems公司)等。反应条件：95℃预变性1min；95℃15s，58℃35sec 40个循环，荧光信号于58℃35sec时采集。

(6)结果判断：将阈值线调整至背景信号及阴性扩增线以上，根据扩增曲线和阈值线读取Ct值。

1)内标和阳性参考均为阳性时，检测结果才认为有效；

2)阳性判断标准：，Ct<36，为阳性；35≤Ct≤38，为疑似阳性，需要再次验证；Ct＞38，为阴性。

3)核酸检测结果判定标准：当ORF1ab区和N区均为阳性时判定为病毒感染阳性；当ORF1ab区和N区一阴一阳时则需要重新检测；当两者都为阴性时则判定为核酸检测阴性结果。

序列表

<110> 武汉艾迪康医学检验所有限公司

<120> 一种呼吸道病毒检测试剂盒和方法

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

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<211> 19

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 1

tctgcggtat gtggaaagg 19

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 2

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<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 3

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<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 4

ggcagtaacc agaatggaga ac 22

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 5

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<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

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<210> 7

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<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

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attgggtgtt caagaggagg 20

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<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 8

tcccactaca gcccactcc 19

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<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

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