一种靶向Notch1基因的LncRNA及其应用

技术领域

本发明涉及一种靶向Notch1基因的LncRNA及其应用，属于基因工程及生物医药技术领域。

背景技术

中枢神经系统炎症性脱髓鞘疾病是很常见的一类由T细胞介导的中枢神经系统自身免疫性疾病，主要包括多发性硬化症(MS)、急性播散性脑脊髓炎(ADEM)、亚急性视神经脊髓炎(SMON)、同心圆硬化、由多种原因(例如各种生物病原体感染后、疫苗接种后、异性蛋白过敏以及药物或化学品过敏反应后)所诱发的中枢变态反应性疾病(如急性脱髓鞘白质脑病和急性脱髓鞘脊髓炎)，发病机制尚未完全阐明。

目前临床对中枢神经系统炎症性脱髓鞘疾病的治疗常使用大剂量糖皮质激素、免疫球蛋白及干扰素β-1，但长期使用副作用大，比如肥胖、胰岛素抵抗、血脂血压异常、消化性溃疡、骨质疏松并发骨坏死、皮疹、急性肾衰等，且对原发进展性MS几乎无效。

长链非编码RNA(LncRNA)是具有超过200个核苷酸但没有蛋白质编码作用的RNA转录物。现有研究表明，LncRNA可以通过调控基因mRNA转录翻译或修饰而影响疾病的发生、发展，是目前研究的热点。实时荧光定量PCR(Real-time PCR)具有高度的特异性和敏感性，可以将很小的变化通过直观的数值反映出来，已广泛用于基因转录或者LncRNA检测的研究。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术中，中枢神经系统炎症性脱髓鞘疾病治疗药物存在的问题，提供一种靶向Notch1基因的LncRNA。

技术方案

一种靶向Notch1基因的LncRNA，所述LncRNA为LncRNA Gm13568，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明人研究发现，在MS的动物模型---实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)小鼠疾病进程中，主要由Th9细胞分泌的细胞因子白细胞介素9(IL-9)显著上调，星形胶质细胞活化增生，同时伴随着Notch1信号的活化和大量促炎因子的分泌升高；进一步研究发现，IL-9活化了星形胶质细胞Notch1信号通路，促进了炎性细胞因子的产生，而敲低Notch1基因，可降低由IL-9诱导活化的小鼠原代星形胶质细胞Notch1信号的激活和促炎细胞因子的产生，而抑制Gm13568，可下调IL-9诱导的星形胶质细胞Notch1信号的激活和炎性细胞因子的产生。

上述靶向Notch1基因的LncRNA(LncRNA Gm13568)在制备治疗中枢神经系统炎症性脱髓鞘疾病的药物中的应用。通过抑制Gm13568来实现下调反应性星形胶质细胞Notch1信号的激活和炎性细胞因子的产生。

一种治疗中枢神经系统炎症性脱髓鞘疾病的药物，所述药物包括LncRNA Gm13568抑制剂，所述LncRNA Gm13568的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

所述药物的给药方式为静脉注射给药。

本发明的有益效果：本发明首次发现了靶向Notch1基因的LncRNA Gm13568，抑制Gm13568，可下调IL-9诱导的反应性星形胶质细胞Notch1信号的激活和炎性细胞因子的产生，并且在体内仅特异性靶向中枢神经系统星形胶质细胞，即可有效抑制中枢神经系统炎症和髓鞘脱失，不会对其他组织细胞造成损伤，毒副作用小。

附图说明

图1为IL-9在EAE小鼠脊髓组织中转录和表达水平的测试结果；

图2为星形胶质细胞特异性标志物GFAP及Notch1/p-STAT3信号通路蛋白在EAE小鼠脊髓组织中表达变化的Western blot检测结果；

图3为IL-6、TNF-α、IP-10和MCP-1在EAE小鼠脊髓中mRNA转录水平的Real-timePCR检测结果；

图4为IL-6、TNF-α及IP-10和MCP-1在血清中的流式CBA法检测结果；

图5为体外IL-9刺激原代星形胶质细胞后不同时间GFAP及Notch1信号通路相关蛋白表达变化的Western blot检测结果；

图6为体外IL-9刺激原代星形胶质细胞后不同时间IL-6、TNF-α、IP-10及MCP-1mRNA转录水平的Real-time PCR检测结果；

图7为体外IL-9刺激原代星形胶质细胞后不同时间的IL-6、TNF-α、IP-10及MCP-1在细胞上清中的流式CBA法检测结果；

图8为体外IL-9刺激原代星形胶质细胞后不同时间Gm13568和Notch1的表达水平；

图9为LV-Inhibit-Gm13568处理星形胶质细胞后GFAP和Notch1信号通路相关蛋白表达情况的Western blot检测结果；

图10为LV-Inhibit-Gm13568处理星形胶质细胞后IL-6、TNF-α和IP-10的mRNA水平的Real-time PCR法检测结果；

图11为LV-Inhibit-Gm13568处理星形胶质细胞后IL-6、TNF-α和IP-10分泌水平的流式CBA法检测结果；

图12为抑制内源性Gm13568对小鼠脊髓组织中IL-9、GFAP和Notch1信号通路蛋白表达情况影响的Western blot检测结果；

图13为抑制内源性Gm13568对小鼠脊髓中IL-6、TNF-α和IP-10生成变化影响的Real-time PCR检测结果；

图14为抑制内源性Gm13568对小鼠外周血中IL-6、TNF-α和IP-10分泌水平影响的流式CBA法检测结果；

图15为苏木精-伊红染色观察脊髓内炎性细胞的浸润情况；

图16为坚牢蓝染色观察脊髓髓鞘的脱失情况。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案作进一步说明。

MOG

实施例1

实验方法：

EAE小鼠模型诱导：将300μg的髓鞘少突胶质细胞糖蛋白抗原(Myelinoligodendrocyte glycoprotein amino acids 35–55，MOG

采用Real-time RCR和Western blot检测EAE小鼠脊髓组织中IL-9的转录和表达，并应用Western blot检测EAE小鼠脊髓组织中星形胶质细胞特异性标志物胶质细胞纤维酸性蛋白(GFAP)、Notch1/p-STAT3信号通路的蛋白表达变化，Real-time PCR检测EAE小鼠脊髓组织中炎性因子白细胞介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)及趋化因子干扰素诱导蛋白-10(IP-10)和单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)的mRNA转录水平，流式CBA法检测上述炎性因子在血清中的分泌变化。结果见图1-4。

图1为IL-9在EAE小鼠脊髓组织中转录和表达水平的测试结果；图2为星形胶质细胞特异性标志物GFAP及Notch1/p-STAT3信号通路蛋白在EAE小鼠脊髓组织中表达变化的Western blot检测结果；图3为IL-6、TNF-α、IP-10和MCP-1在EAE小鼠脊髓中mRNA转录水平的Real-time PCR检测结果；图4为IL-6、TNF-α及IP-10和MCP-1在血清中的流式CBA法检测结果。由图1-4可以看出，在EAE小鼠疾病进程中，主要由Th9细胞分泌的细胞因子白细胞介素9(IL-9)显著上调，星形胶质细胞活化增生，同时伴随着Notch1信号的活化和大量促炎因子的分泌升高。

实施例2

原代细胞的培养：取新生24h内的C57BL/6乳鼠，超净工作台下用75％乙醇浸泡3～5min消毒皮肤后，断头，无菌条件下用眼科剪小心剪开头骨，取两侧大脑，体视镜下剥除脑膜，取出大脑皮质置于盛有预冷D-Hanks液的无菌培养皿内。而后，用预冷的D-Hanks液漂洗2次，剪碎大脑皮质制成糜状，以0.25％的胰酶液37℃消化5～10min，并用含有10％胎牛血清的DMEM/F12完全培养基终止消化，轻轻吹打，1200r/min离心5min，预冷的DMEM/F12完全培养基离心洗涤2次，以不锈钢网(ф＝200μm)过滤，转移至未包被多聚左旋赖氨酸的玻璃培养瓶内，加入适量DMEM/F12完全培养基，用吸管反复轻柔吹打制成单细胞悬液，调整细胞密度为1.0×10

原代小鼠星形胶质细胞在无血清培养基中培养过夜，然后用IL-9作为刺激源处理小鼠原代星形胶质细胞不同时间后，提取总蛋白和总RNA。Western blot检测GFAP及Notch1信号通路相关蛋白的表达变化，Real-time PCR检测IL-9刺激小鼠原代星形胶质细胞不同时间IL-6、TNF-α、IP-10及MCP-1的mRNA转录水平，并采用流式CBA法检测上述炎性因子在细胞上清中的分泌变化。结果见图5-7。

图5为体外IL-9刺激原代星形胶质细胞后不同时间GFAP及Notch1信号通路相关蛋白表达变化的Western blot检测结果；图6为体外IL-9刺激原代星形胶质细胞后不同时间IL-6、TNF-α、IP-10及MCP-1mRNA转录水平的Real-time PCR检测结果；图7为体外IL-9刺激原代星形胶质细胞后不同时间的IL-6、TNF-α、IP-10及MCP-1在细胞上清中的流式CBA法检测结果，

实施例4

取小鼠原代星形胶质细胞在无血清培养基中孵育过夜，然后用IL-9刺激，在不同时间点收取细胞总RNA。Real-time PCR检测星形胶质细胞中Gm13568和Notch1的变化水平，结果见图8。

图8为IL-9刺激不同时间后星形胶质细胞中Gm13568和Notch1的表达水平，可以看出，Gm13568与Notch1mRNA表达水平同步上升或同步下降，变化一致，这说明Gm13568可能是Notch1的正性调节子。

扩增Gm13568序列，克隆入携带星形胶质细胞GFAP启动子的慢病毒转移载体，命名为LV-Gm13568，由于Gm13568的序列与Notch1基因9075-9497位点的正义链完全互补结合，我们采取过表达其与Notch1结合区域序列的方法，利用竞争抑制的方式实现Gm13568的下调，扩增Notch1基因的第9075-9497位点序列连接到慢病毒转移载体，命名为LV-Inhibit-Gm13568，测序验证。将其导入原代小鼠星形胶质细胞，Western blot检测Notch1在星形胶质细胞中的表达，证实了重组慢病毒载体LV-Inhibit-Gm13568构建成功，抑制内源性的Gm13568可以成功抑制Notch1基因的表达。

实施例5

用特异性靶向星形胶质细胞的重组慢病毒LV-Inhibit-Gm13568和LV-ctrl分别感染小鼠原代星形胶质细胞72h。然后在无血清培养基中孵育过夜，IL-9刺激6h后，Westernblot检测GFAP和Notch1信号通路相关蛋白的表达，Real-time PCR法检测星形胶质细胞IL-6、TNF-α和IP-10的mRNA水平，并采用流式CBA法检测星形胶质细胞IL-6、TNF-α和IP-10的分泌水平。结果见图9-11。

图9为LV-Inhibit-Gm13568处理星形胶质细胞后GFAP和Notch1信号通路相关蛋白表达情况的Western blot检测结果；图10为LV-Inhibit-Gm13568处理星形胶质细胞后IL-6、TNF-α和IP-10的mRNA水平的Real-time PCR法检测结果；图11为LV-Inhibit-Gm13568处理星形胶质细胞后IL-6、TNF-α和IP-10分泌水平的流式CBA法检测结果，

实施例6

尾静脉注射LV-ctrl或LV-Inhibit-Gm13568慢病毒7天后，用MOG

Western blot检测小鼠脊髓组织中IL-9、GFAP的表达及Notch1信号通路的蛋白表达情况；Real-time PCR法检测慢病毒感染小鼠脊髓中IL-6、TNF-α和IP-10的生成水平，CBA法检测慢病毒感染小鼠外周血中IL-6、TNF-α和IP-10的生成水平，并用苏木精-伊红(H&E)染色观察小鼠脊髓炎性细胞浸润情况，用坚牢蓝(LFB)染色观察脊髓髓鞘的脱失情况。结果见图12-16。

图12为抑制内源性Gm13568对小鼠脊髓组织中IL-9、GFAP和Notch1信号通路蛋白表达情况影响的Western blot检测结果；图13为抑制内源性Gm13568对小鼠脊髓中IL-6、TNF-α和IP-10生成变化影响的Real-time PCR检测结果；图14为抑制内源性Gm13568对小鼠外周血中IL-6、TNF-α和IP-10分泌水平影响的流式CBA法检测结果，图13和14中，

序列表

<110> 徐州医科大学

<120> 一种靶向Notch1基因的LncRNA及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 300

<212> RNA

<213> 长链非编码RNA(LncRNA)

<400> 1

gagcaaaagg gacaaccaca gacaagcaaa agaacaaaaa aagagaaaaa aaacacacaa 60

ccacaggcag agacgcgaaa cacacaaaca acacagaaga acaacacagg agcgcggcaa 120

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