一种富含酶菌元肉鸡替抗饲料复合添加剂及制备方法

技术领域

本发明属于饲料添加剂技术领域，具体涉及一种富含酶菌元肉鸡替抗饲料复合添加剂及制备方法。

背景技术

随着社会的不断发展，人们对动物蛋白的需求不断提高，直接促进了养殖业的飞速发展。如何能为广大消费者提供高营养，且符合食品安全的肉、蛋、奶等食品是当下养殖行业一直在探讨的问题，禁抗就是对食品行业最好的贡献，必定为行业的发展迈出坚实的一步。农业农村部发布194号公告，2020年7月1日起，饲料生产企业停止生产含有促生长类药物饲料添加剂(中草药除外)的商品饲料。至此，养殖行业进入饲料无抗时代，饲料标准趋严、养殖需求更多样化、消费者要求更高，作为产业链中重要中间环节的饲料如何做出调整，以满足新的更高的市场要求。

根据国外饲料禁用抗生素的历程来看，实现绿色健康养殖不仅需要提高饲养管理水平和饲料配方营养合理化，一定还需要一个合理的替抗产品，才能保证替抗，减少抗生素的使用。这类产品主要包括酸化剂、益生菌、益生元、酶制剂、植物精油和发酵类产物等，据饲料协会调查报告结果显示：饲料添加剂益生菌、酶制剂和益生元替代抗生素分别有70％、68％和53％的有效性。其中微生态制剂对于改善动物肠道菌群，提高动物机体健康以及免疫水平方面都有很好的效果，从而起到“以菌治菌”的作用。酶制剂经历了多年的使用和推广，应用已经非常普遍，其作用机理在于补充内源酶的不足，提高内源酶消化活性；破坏植物细胞壁，提高饲料养分消化率；降低肠道食糜粘度，减少畜禽后肠道有害微生物的繁殖；改变肠壁结构，提高养分吸收能力，在替抗类产品中是不可或缺的。益生元负责选择性地改变肠道微生物菌群的组成和代谢，能够增加双歧杆菌和其他对宿主健康有积极影响的菌种数量，通过培养内生性的益生菌来发挥微生态调理的功效。但替抗问题的解决不能简单化，一种产品并不能解决抗生素弃用所遗留下来的所有问题，替抗产品复合化、综合化势在必行。有效的配伍复方，合理的产品搭配、科学的组合方案是成功替代抗生素的关键。但饲料行业至今未能形成一套可行的理论体系和解决方案。

发明内容

本发明的目的旨在提供一种肉鸡替抗饲料复合添加剂，以解决抗生素禁用后，肉鸡养殖过程中生产性能下降、患病率增加、养殖成本抬高和效益下滑等问题。

为达到上述技术目的，本发明具体通过以下技术方案实现：

一种富含酶菌元肉鸡替抗饲料复合添加剂，该复合添加剂包括益生菌、酶制剂和益生元，所述的益生菌包括30×10

所述的益生菌制备：将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis CICC24675)和丁酸梭菌(Clostridium butyricum CICC 23847)菌种进行活化，待活化后菌种进行一级、二级发酵罐扩大培养后，转接三级发酵培养罐中，进行48小时发酵培养，待菌株形成95％以上的芽孢后，培养液进行喷雾干燥，形成枯草芽孢杆菌和丁酸梭菌饲用益生菌半成品。

所述的酶制剂制备：分别将木聚糖酶、果胶酶和葡萄糖氧化酶活化后进行一级、二级种子液扩大培养，待OD值达到一定时，转接到三级发酵培养罐中，采用甲醇流加的方式进行诱导产酶，待酶活力达到最大值时，对发酵酶液进行喷雾干燥处理，制备成饲用木聚糖酶、果胶酶和葡萄糖氧化酶半成品。

所述的益生元制备：利用β-甘露聚糖酶酶解魔芋精粉，对酶解后的粗纤维过滤截留，获得魔芋甘露寡糖的粗滤液，去除寡糖液中的淀粉、粗纤维颗粒和残渣，经超滤和纳滤膜提纯浓缩后，通过喷雾干燥塔进行喷雾干燥，获得魔芋低聚甘露寡糖。

所述的复合添加剂制备：利用上述制备的枯草芽孢杆菌和丁酸梭菌饲用益生菌半成品、饲用木聚糖酶、果胶酶和葡萄糖氧化酶半成品、魔芋低聚甘露寡糖按照一定的比例混合形成复合饲料添加剂。

本发明复合添加剂在使用时，在饲料中按照400g/t添加，即可替代复合抗生素。

本发明的有益效果为：

在肉鸡饲粮中添加400g/t的该发明酶菌元复合饲料添加剂，能够替代原有饲料中的复合抗生素的添加，大大减少了抗生素滥用带来的环境污染等问题。且能够有效的提高肉鸡平均日采食量和平均日增重，降低料肉比和腹泻率，增加养殖效益。

附图说明

图1是本发明1-21日龄肉鸡生长性能；

图2是本发明22-42日龄肉鸡生长性能；

图3是本发明1-21日龄肉鸡腹泻率。

具体实施方式

下面将结合本发明具体的实施例，对本发明技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1饲用益生菌的制备

(1)菌种活化

本发明实施例所用益生菌购自微生物保藏中心，枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis CICC 24675)和丁酸梭菌(Clostridium butyricum CICC 23847)。

枯草芽孢杆菌活化培养基采用LB，配方为：酵母膏0.5％、胰蛋白胨1％、氯化钠1％，固体培养基加琼脂2％。将枯草芽孢杆菌接种到平板培养基上，37℃条件下培养24小时，获得活化菌种。

丁酸梭菌活化培养基采用强化梭菌培养基，配方为：牛肉膏1％、葡萄糖05％、胰蛋白胨1％、酵母浸粉0.3％、氯化钠0.5％、可溶性淀粉0.1％、半胱氨酸盐酸盐0.05％、乙酸钠0.3％，固体培养基加琼脂2％。将丁酸梭菌接种到平板培养基上，37℃条件下厌氧培养12小时，获得活化菌种；

(2)发酵培养

将(1)活化的菌种，分别接种到液体LB和强化梭菌培养基中，制备2L的摇瓶种子，进而转接到50L和400L的一、二级发酵罐中，培养12小时。分别转接到三级10T发酵培养基中。

枯草芽孢杆菌发酵培养基配方为：葡萄糖1％、玉米粉1.5％、酵母粉1％、黄豆粉2.5％、柠檬酸钠0.45％、碳酸钙0.015％、硫酸镁0.002％，在37℃条件下培养48h，待芽孢率达到95％以上即可放罐。

丁酸梭菌发酵培养基配方为：葡萄糖5.0％、蛋白胨1.0％、酵母膏0.5％、牛肉浸膏0.3％、NaCI 0.1％、MnSO

(3)益生菌半成品制备

将(2)发酵液中加入20％的淀粉，经喷雾干燥塔进行喷雾干燥，所得喷雾干粉进行计数，测定含量。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis CICC 24675)有效活菌数可达300×10

实施例2饲用酶制剂的制备

本发明实施例所用酶制剂异源表达宿主菌均有本实验室完成构建。

(1)种子液制备

于超净工作台挑取单克隆毕赤酵母宿主菌接种于200mLYEPD培养基中，酵母膏1％、蛋白胨2％、葡萄糖2％，在30℃，250rpm培养36～38h，直至湿细胞重量达到30g/L。

种子的分批发酵分为两个阶段，分别使用50升和500升发酵罐。将种子接种于含有30L无菌发酵培养基的50L发酵罐，30℃，350rpm，添加20％(w/v)氨溶液调节pH≈4.5的条件下发酵，直至湿细胞重量达到OD600>30。第二阶段将种子转接在包含350升无菌发酵培养基的500升发酵罐中，30℃，250rpm，添加20％(w/v)氨溶液控制pH<4.5下发酵，发酵约24小时。

(2)产酶发酵

在三级发酵罐中以30℃，50rpm，由20％(w/v)氨溶液控制pH≈4.7～5.0的条件下进行发酵，直到湿细胞重量达到64g/L。高密度发酵培养基：每升发酵培养基均包含40mL甘油，5.0mL H

该发酵过程包括四个步骤，第一步，甘油流加培养步骤，是为了促进巴斯德毕赤酵母的生长而进行的，整个过程历时约17小时，控制pH，直到湿重达到47.2g/L。在第二阶段，当溶解氧(DO)含量达到100％饱和，并保持2小时后，以50L/h的流速向培养基中注入250L，50％的甘油，该过程持续5h，直到达到140-150g/L的湿重。整个过程中，溶氧量保持在20％至30％。在第三阶段中，以50L/h的流量将250L的50％甘油-20％甲醇混合物注入，该过程持续5h，直到达到140～160g/L的湿重。在第四阶段，注入15L/h甲醇。分批补料发酵在30℃和大约4.7～5的pH值下进行，同时在恒定的DO(20～30％)下添加20％(v/v)的氨水反应使用DO级联模式进行，搅拌速度调节至150～180rpm，进口空气为1～1.2VVM，整个分批补料培养阶段的物理压力保持在0.05MPa。该阶段持续120～150小时。

(3)饲用酶制剂半成品的制备

将(2)发酵液中加入20％的淀粉，经喷雾干燥塔进行喷雾干燥，所得喷雾干粉进行酶活力测定。木聚糖酶酶活力为100000U/g、果胶酶酶活力为50000U/g和葡萄糖氧化酶酶活力为5000U/g。

实施例3低聚甘露寡糖的制备

(1)魔芋寡糖的水解液制备

取100kg纯净水，间接加热到60℃，加入β-甘露聚酶使酶解罐中的酶活达到50IU/mL，搅拌混合均匀。称取12.5kg魔芋精粉，缓缓加入到酶解罐中，边搅边加，20min后，继续加入12.5kg魔芋粉；全部加完后搅拌水解1小时，测定黏度、还原糖和总糖度。反应结束后，加热升温到80℃，保温10min，进行终止酶解反应，冷却到50℃，利用筛网对反应体系中的粗纤维进行过滤截留，获得魔芋寡糖的粗滤液。

(2)离心过滤

通过8000rpm高速离心去除寡糖液中的淀粉、粗纤维颗粒和残渣，用不锈钢容器收集寡糖离心液。

(3)陶瓷膜过滤

利用0.2μm孔径的陶瓷膜截留寡糖液中少量的蛋白、可溶性淀粉、纤维等微粒物质，充分洗出所需要的魔芋寡糖。设备驱动后，管道设置压力0.3MPa，使用不锈钢容器盛装滤出的透过液，中间加水不断循环洗滤至滤出的液体糖度低于1°Bx为止。

(4)超滤

通过超滤提纯，截留去除寡糖透过液的大分子物质，筛分寡糖组分。将陶瓷膜过滤后的寡糖液加入超滤膜设备中，启动机子，设置过滤压力为0.3MPa，开始过滤分离，使用不锈钢容器盛装滤出的寡糖液。

(5)纳滤浓缩

纳滤是对超滤液中的魔芋寡糖的截留和对离子、盐类物质、水的滤过，从而达到纯化和浓缩的作用。将超滤液倒入纳滤缓冲设备中，设置浓缩压力为1.5MPa。启动设备，开始浓缩。

(6)喷雾干燥

将经过纳滤膜提纯浓缩完成的魔芋寡糖液通过喷雾干燥塔进行喷雾干燥。启动干燥塔引风机，再启动干燥塔加热装置对塔内加热升温，待塔内温度升到180℃时打开雾化器设备，转数为2000r/min，再打开进料泵电源，设置蠕动泵流速为5L/h，启动蠕动泵开始寡糖液喷雾干燥。

实施例4酶菌元复合饲料添加剂的的制备

利用实施例1饲用益生菌、实施例2饲用酶制剂、实施例3饲用魔芋甘露寡糖半成品配制酶菌元复合饲料添加剂，每公斤含有枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis CICC 24675)100g、丁酸梭菌(Clostridium butyricum CICC 23847)100g、木聚糖酶100g、果胶酶100g、葡萄糖氧化酶100g、魔芋低聚甘露寡糖100g和玉米淀粉400g，使用混合机将其混合均匀。最终枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis CICC 24675)含量为30×10

实施例5肉鸡养殖实验

1)肉鸡饲料的制备

按照表1进行基础日粮的配制，肉鸡替抗饲料在基础日粮中添加400g/t的本发明的酶菌元复合饲料添加剂，有抗饲料在基础日粮基础上添加复合抗生素。上述三种日粮经混合机混合均匀、并制粒，形成3种不同的肉鸡日粮。

表1基础饲粮组成及营养水平(风干基础)

2)实验方案

试验前对鸡舍进行全面消毒，试验鸡全期采用笼养方式饲养，24h光照，自由采食、饮水，常规的日常管理，按正常免疫程序进行免疫接种。每日观察鸡群的生长状况并进行记录。选取1日龄白羽肉鸡300羽，随机分成3组，每组100羽。A组喂食基础日粮，B组喂食复合抗生素+基础日粮，C组喂食400g/t的本发明的酶菌元复合饲料添加剂+基础日粮。饲养试验开展二阶段评估，1～21d阶段和21～42d阶段。1、21、42日龄，分别以重复为单位对试验鸡进行空腹称重，统计每天饲粮消耗量，计算1～21日龄和21～42日龄的平均日增重、平均日采食量和料重比。幼龄肉仔鸡极易因腹泻而导致粪便敷住肛门，因此以处理组为单位，观察并记录“敷肛”的试验鸡数量，视为腹泻，并计算腹泻率。腹泻率＝(试验全期每组腹泻鸡只次/该组试验鸡只总数)×100％。

试验指标及意义：

平均日增重：该生长阶段，每天增重、生长情况；数值越大越好。

平均日采食量：该生长阶段，每天吃的饲料数量；适当范围较好。

料重比：该生长阶段，平均日采食量÷平均日增重；数值越小越好。

腹泻指数：该生长阶段，(腹泻鸡数量×腹泻天数)÷(总试验鸡数量×试验天数)×100％；数值越小越好。

实验结果：由图1可知，第一阶段(1～21日龄)与无抗日粮组相比，喂食400g/t的本发明的酶菌元复合饲料添加剂+基础日粮的肉鸡可使料肉比下降3.50％，且差异显著(P<0.05)；日增重有提高3.96％的趋势，差异不显著(P>0.05)；日均采食量差异不显著(P>0.05)；与有抗日粮正对照组相比，差异不显著(P>0.05)。

由图2可知，第二阶段(21～42日龄)与无抗日粮组相比，可使料肉比下降2.29％，日增重有提高4.95％，且差异显著(P<0.05)；与有抗日粮正对照组相比，日增重有提高5.95％，且差异显著(P<0.05)。

由图3可知，1～21日龄与无抗日粮组相比，喂食400g/t的本发明的酶菌元复合饲料添加剂+基础日粮的肉鸡可使腹泻率下降42.86％，且差异极显著(P<0.01)。

综上，本发明通过合理的优化和配伍，通过益生菌、酶制剂和益生元的组合，发明了一种可替代肉鸡日粮中抗生素的复合微生态饲料添加剂，这种复合微生态饲料添加剂能够增加肉鸡养殖过程中的日采食量、日增重，降低料肉比和腹泻率，从而增加肉鸡饲养过程中的生产性能和经验效益，同时起到环保的作用。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。