一种基于荧光RMA法检测日本血吸虫核酸的引物探针组、试剂盒及其检测方法

技术领域

本申请属于生物检测技术领域，具体为一种基于荧光RMA法检测日本血吸虫核酸的引物探针组、试剂盒及其检测方法。

背景技术

血吸虫病是一种具有严重危害的人兽共患寄生虫病，广泛分布于亚洲、非洲、南美洲和中东国家。现主要存在6种寄生于人体的血吸虫：日本血吸虫、曼氏血吸虫、埃及血吸虫、间插血吸虫、湄公血吸虫和马来血吸虫。在我国血吸虫病的病原是日本血吸虫(Schistosoma japonicum)，日本血吸虫病主要在中国长江流域和长江以南十三个省、直辖市、自治区流行。日本血吸虫属于扁形动物门、吸虫纲、复殖目、裂体科、血吸虫属、日本裂体吸虫种，雌雄异体。日本血吸虫能够逃避宿主的免疫攻击，在宿主的血管中存活长达十几年甚至更长时间，血吸虫感染能引起人和家畜的消瘦，重度感染可以造成人和家畜极高的发病率和死亡率。血吸虫病的诊断是血吸虫病防治的中心环节，对化疗目标人群的确定及化疗效果评价、有效控制传染源和降低虫卵对环境的污染具有重要意义。

目前日本血吸虫的检测主要有病原学诊断、免疫学诊断、分子生物学方法。传统的病原学诊断方法如毛蚴孵化法阳性率极低，漏检以及误诊较为常见；免疫学诊断如环卵沉淀试验、间接血凝试验、酶联免疫吸附试验(ELISA)等由于检测的是血吸虫感染后宿主体内产生的抗体，抗体检测窗口期长，不能区分现症感染和既往感染；分子生物学方法主要是荧光定量PCR和LAMP恒温扩增法，但PCR方法需要使用复杂的仪器和装备精良的实验室，一定程度上限制了其推广应用，而LAMP方法对引物的要求较高，且特别容易形成气溶胶污染，造成假阳性影响检测结果。

重组酶介导扩增(Recombinase MediatedAmplification,RMA)技术，是近年来发展出的一种敏感、特异、简便、快捷的等温核酸扩增技术，被认为是可替代PCR的核酸检测技术，主要依赖重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶三种酶。RMA反应可以在37～42℃进行，整个过程在30min内即可达到检测水平，可实现日本血吸虫的快速检测。

发明内容

为了解决现有技术的问题，本申请提供了一种基于荧光RMA法检测日本血吸虫核酸的引物探针组、试剂盒及其检测方法，本申请是通过下述方案实现的：

一种基于荧光RMA法检测日本血吸虫核酸的引物探针组，包括检测日本血吸虫的引物对及对应的探针，其中，

正向引物：5’-GGACCATGAGTGTTACTAACCGGCTGTAGTGGA-3’；

反向引物：5’-AGCTCACATACGCAACTGCCAACGTGACATAAA-3’；

探针：

5’-TGTCGGAGATGGCGGCTTCACGTGCGTGC(VIC-dT)(THF)(BHQ1-dT)GTCCTTCGGGCATTA(C3-spacer)-3’。

优选的，所述日本血吸虫的检测探针上标记的荧光报告基团是VIC，荧光淬灭基团是BHQ1。

一种基于荧光RMA法检测日本血吸虫核酸的试剂盒，该试剂盒中包括有：含有扩增反应试剂的检测管、缓冲液、醋酸镁、标准阳性质粒、无菌双蒸水。

优选的，所述扩增反应试剂单管分装，为干粉形态，所述扩增反应试剂包括RMA引物对及检测探针组、大肠杆菌RecA蛋白、UvsY蛋白、单链结合蛋白GP32、Bst聚合酶、核酸外切酶III、聚环氧乙烷、海藻糖、甘露醇、ATP、dNTPs、肌酸激酶和磷酸肌酸。

优选的，所述引物对及检测探针组在扩增体系中的终浓度分别为10μM；所述聚环氧乙烷的终浓度为10％w/v；所述海藻糖的终浓度为2mM；所述甘露醇的终浓度为2.5mM；所述ATP的终浓度为10mM；所述dNTPs的终浓度为2mM；所述肌酸激酶的终浓度为1000ng/mL；所述磷酸肌酸的终浓度为25mM；所述大肠杆菌RecA蛋白的终浓度为100ng/μL；所述UvsY蛋白的终浓度为40ng/μL；所述单链结合蛋白GP32的终浓度为800ng/μL；所述Bst聚合酶的终浓度为60ng/μL；所述核酸外切酶III的终浓度为80ng/μL。

优选的，所述标准阳性质粒为含有日本血吸虫基因片段的重组质粒，用于日本血吸虫核酸检测的阳性对照。

优选的，所述无菌双蒸水为阴性对照，与标准阳性质粒一起检验相应的反应体系和反应条件能否正常反应。

一种基于荧光RMA法检测日本血吸虫核酸的方法，包括以下步骤：

(1)提取待测样本的DNA；

(2)设计用于日本血吸虫核酸检测的引物对及探针；

(3)以提取的待测样本DNA作为模板，加入上述日本血吸虫核酸检测用的引物对和探针进行荧光RMA扩增反应。扩增反应在温度设定为42℃的实时荧光检测仪中进行，反应时间为20min；

(4)结果分析：在荧光RMA扩增反应过程中，通过实时荧光采集，在扩增结束后，根据是否产生荧光信号判断日本血吸虫核酸的阴、阳性。若待检样本包含日本血吸虫核酸，则标记VIC的探针产生荧光信号。

有益效果：RMA反应的最适温度在37℃-42℃之间，无需变性，在常温下即可进行，不需要温控设备，30分钟内即可出诊断结果，可以真正实现便携式的快速核酸检测；整个反应均在封闭的反应管内进行，避免了其他核酸检测方法气溶胶污染造成的假阳性结果；采用冻干工艺，提高试剂稳定性，只需一次加样、一步操作，节省检测时间，降低检测成本。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1荧光RMA法检测日本血吸虫核酸的灵敏度实验；

图2荧光RMA法检测日本血吸虫核酸的特异性实验。

具体实施方式

为使本申请的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本申请实施方式作进一步地详细描述。

实施例1

1、阳性标准质粒的制备

提取日本血吸虫核酸为模板，对日本血吸虫的特异性基因进行PCR扩增，PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳，割胶回收，克隆连接至pMD18-T载体，转化至大肠杆菌感受态细胞，蓝白斑筛选，挑取白色菌落，进行菌落PCR验证。将阳性重组菌送公司测序，将测序正确的重组菌培养过夜，提取质粒DNA，获得阳性质粒；

2、荧光RMA引物与探针的设计

根据日本血吸虫的28S rRNA基因区域设计了特异性荧光RMA引物与探针，具体如表1所示：

表1引物与探针序列

注：日本血吸虫核酸检测探针的荧光基团用VIC修饰、淬灭基团用BHQ1修饰，3’末端被阻断基团C3-spacer修饰。

3、荧光RMA反应体系的建立

将42.5μL缓冲液和5μL提取的日本血吸虫核酸模板加入到含有扩增反应试剂的检测管中并混匀，后向管中加入2.5μL的280mM醋酸镁溶液并混匀，将上述反应管放置于实时荧光检测仪中，在42℃反应20min。每次反应均以标准阳性质粒作为阳性对照，以无菌双蒸水为阴性对照；

其中，所述扩增反应试剂包括RMA引物对及检测探针组、大肠杆菌RecA蛋白、UvsY蛋白、单链结合蛋白GP32、Bst聚合酶、核酸外切酶III、聚环氧乙烷、海藻糖、甘露醇、ATP、dNTPs、肌酸激酶和磷酸肌酸；

所述引物对及检测探针组在扩增体系中的终浓度分别为10μM；所述聚环氧乙烷的终浓度为10％w/v；所述海藻糖的终浓度为2mM；所述甘露醇的终浓度为2.5mM；所述ATP的终浓度为10mM；所述dNTPs的终浓度为2mM；所述肌酸激酶的终浓度为1000ng/mL；所述磷酸肌酸的终浓度为25mM；所述大肠杆菌RecA蛋白的终浓度为100ng/μL；所述UvsY蛋白的终浓度为40ng/μL；所述单链结合蛋白GP32的终浓度为800ng/μL；所述Bst聚合酶的终浓度为60ng/μL；所述核酸外切酶III的终浓度为80ng/μL；

所述标准阳性质粒为含有日本血吸虫基因片段的重组质粒，用于日本血吸虫核酸检测的阳性对照；

所述无菌双蒸水为阴性对照，与标准阳性质粒一起检验相应的反应体系和反应条件能否正常反应；

所述扩增反应试剂单管分装，为干粉形态；

4、结果判读

根据是否产生相应的荧光信号，分析待测样本中是否含有日本血吸虫核酸。产生标记VIC的荧光信号表示为日本血吸虫核酸阳性；

5、荧光RMA法检测日本血吸虫核酸的灵敏度分析

将标准阳性质粒经PBS进行10倍系列稀释(包括10

6、荧光RMA法检测日本血吸虫核酸的特异性分析

用建立的荧光RMA方法分别检测日本血吸虫、曼氏血吸虫、埃及血吸虫、华支睾吸虫、布氏姜片吸虫、卫氏并殖吸虫等病原体核酸样本，评价方法的特异性，以无菌双蒸水作为阴性对照，每个试验重复检测3次。根据图2可知，仅标记VIC的探针产生荧光信号，则检测为日本血吸虫核酸阳性，而对其他病原体检测为阴性。说明该荧光RMA法具有良好的检出效果和特异性。

以上所述仅为本申请的较佳实施例，并不用以限制本申请，凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

序列表

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<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 33

<212> DNA

<213> 日本血吸虫(Schistosoma japonicum)

<400> 1

ggaccatgag tgttactaac cggctgtagt gga 33

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<212> DNA

<213> 日本血吸虫(Schistosoma japonicum)

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<212> DNA

<213> 日本血吸虫(Schistosoma japonicum)

<400> 3

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