一种血小板聚集功能巴曲酶杯检测试剂及其制备方法

技术领域

本发明属于凝血检测技术领域，具体涉及一种血小板聚集功能巴曲酶杯检测试剂及其制备方法。

背景技术

血栓弹力图(TEG)是一种对血小板聚集、凝血、纤溶等整个过程实施实时、动态、连续监测的凝血功能分析仪，对病人凝血状况做出定性或定量分析。

血栓弹力图仪于1948年由德国人Harter发明，应用于指导临床术中输血，目前已成为检测凝血功能最重要的手段之一。血栓弹力图检测血液凝血功能的原理是将传感器探头浸入血液标本中，血液标本与传感器探头间存在粘滞力，该粘滞力随着血小板聚集、凝血、纤溶等变化而改变，传感器的悬垂丝在这种粘滞力的作用下发生扭转形变，这种扭转形变被检测单元检测到并转化为电信号反馈给控制系统，控制系统接收到变化的信号后进行运算，并将运算结果以曲线图形和实时数据的形式显示在计算机屏幕上。

血栓弹力图(TEG)使用经抗凝处理的全血，从内外源性凝血途径激活凝血、纤溶系统系统，从而更全面、更真实地反映人体凝血因子、血小板、纤维蛋白及纤维蛋白溶解的整个过程。

血小板的主要功能是凝血、止血、修补破损的血管。血小板表面与凝血功能相关的受体ADP受体、α及β-肾上腺受体、凝血酶(原)受体、胶原受体(GPⅠa/Ⅱa、GPⅣ、GP-Ⅵ)、TXA

血栓弹力图普通杯检测试剂盒可以检测人体总的血凝块强度，血凝块强度由全部纤维蛋白与全部血小板活化共同决定。鉴于此，为了更进一步有针对性的灵敏检测患者全部交联纤维蛋白和患者自身实际状况条件下血小板聚合共同产生的血块强度，提供一种有较好灵敏度和特异性的试剂。

发明内容

针对目前的血小板聚集功能普通检测试剂针对性、灵敏性和特异性较弱的缺陷和问题，本发明提供一种灵敏度高、特异性强的血小板聚集功能巴曲酶杯检测试剂及其制备方法。

本发明解决其技术问题所采用的方案是：一种血小板聚集功能巴曲酶杯检测试剂，包括以下试剂：巴曲酶、活化凝血因子和冻干保护剂。

上述的血小板聚集功能巴曲酶杯检测试剂，所述活化凝血因子为活化的人十三因子。

上述的血小板聚集功能巴曲酶杯检测试剂，所述巴曲酶的添加量为0.5-3.5BU/瓶，所述活化凝血因子的添加量为4-12BU/瓶。

上述的血小板聚集功能巴曲酶杯检测试剂，所述巴曲酶的添加量为2BU/瓶，所述活化凝血因子的添加量为8BU/瓶.

上述的血小板聚集功能巴曲酶杯检测试剂，所述冻干保护剂包括糖类冻干保护剂和聚合物类冻干保护剂。

上述的血小板聚集功能巴曲酶杯检测试剂，所述糖类冻干保护剂为海藻糖、蔗糖、葡聚糖、葡萄糖中的一种或几种。

上述的血小板聚集功能巴曲酶杯检测试剂，所述聚合物类冻干保护剂为牛血清白蛋白、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇中的一种或几种。

上述的血小板聚集功能巴曲酶杯检测试剂，还包括pH稳定剂，所述pH稳定剂为乙二胺四乙酸、氯化钠、醋酸钠中的一种或几种。

上述的血小板聚集功能巴曲酶杯检测试剂的制备方法，包括以下步骤：

(1)按配方量量取冻干保护剂，加入纯净水充分溶解得到冻干保护剂溶液；

(2)按配方量称取巴曲酶和活化凝血因子，将其加到冻干保护剂溶液中，混合均匀得到巴曲酶检测试剂母液；

(3)将巴曲酶检测试剂母液按照每瓶20-60微升分装到西林瓶中得到成品巴曲酶检测试剂；

(4)将巴曲酶检测试剂真空冷冻干燥得到巴曲酶检测试剂冻干品。

本发明的有益效果：本发明的巴曲酶检测试剂，能够在冻干过程中保护血浆中蛋白质不受损伤，保护血小板和一些凝血因子在冻干中避免低温和脱水对其活性的影响，能够提高冻干活性和试剂稳定性；可以有效检测患者交联纤维蛋白和自身血小板聚集引起的血块强度，能够更精准的评价对临床服用AA类或ADP类抗血小板药物后因为的血块强度的变化。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进一步说明。以下实例仅为示例性实例。

实施例1：本实施例提供一种血小板聚集功能巴曲酶杯检测试剂，该检测试剂包括巴曲酶2BU/瓶、活化的人十三因子8BU/瓶、葡萄糖0.3％(体积)、牛血清白蛋白2.0％、乙二胺四乙酸0.08％，氯化钠0.6％，余量为纯化水。

巴曲酶：DSM；

活化人十三因子：Zedira；

乙二胺四乙酸：北京索莱宝科技有限公司；

氯化钠：上海麦克林生化科技有限公司；

牛血清白蛋生产厂家：BioRuler；

葡萄糖生产厂家：天津市致远化学试剂有限公司；

制备方法：

(1)按配方量量取葡萄糖、牛血清白蛋白、氯化钠和乙二胺四乙酸，加入纯净水或纯化水充分溶解得到冻干保护剂溶液；

(2)量取巴曲酶和活化的人十三因子加入到冻干保护剂溶液中混合均匀得到巴曲酶检测试剂母液；

(3)将巴曲酶检测试剂母液按照每瓶40微升分装到西林瓶中得到成品巴曲酶检测试剂；

(4)将巴曲酶检测试剂真空冷冻干燥得到巴曲酶检测试剂冻干品。

实施例2：本实施例提供一种血小板聚集功能巴曲酶杯检测试剂，该检测试剂包括巴曲酶1BU/瓶、活化的人十三因子6BU/瓶、海藻糖0.6％(体积)、牛血清白蛋白3.0％、乙二胺四乙酸0.06％，氯化钠0.9％，余量为纯化水。

制备方法：

(1)按配方量量取海藻糖、牛血清白蛋白、氯化钠和乙二胺四乙酸，加入纯净水或纯化水充分溶解得到冻干保护剂溶液；

(2)量取巴曲酶和活化的人十三因子加入到冻干保护剂溶液中混合均匀得到巴曲酶检测试剂母液；

(3)将巴曲酶检测试剂母液按照每瓶40微升分装到西林瓶中得到成品巴曲酶检测试剂；

(4)将巴曲酶检测试剂真空冷冻干燥得到巴曲酶检测试剂冻干品。

实施例3：本实施例提供一种血小板聚集功能巴曲酶杯检测试剂，该检测试剂包括巴曲酶3BU/瓶、活化的人十三因子9BU/瓶、葡萄糖0.9％(体积)、牛血清白蛋白1.0％、乙二胺四乙酸0.12％，氯化钠0.3％，余量为纯化水。

制备方法：

(1)按配方量量取葡萄糖、牛血清白蛋白、氯化钠和乙二胺四乙酸，加入纯净水或纯化水充分溶解得到冻干保护剂溶液；

(2)量取巴曲酶和活化的人十三因子加入到冻干保护剂溶液中混合均匀得到巴曲酶检测试剂母液；

(3)将巴曲酶检测试剂母液按照每瓶60微升分装到西林瓶中得到成品巴曲酶检测试剂；

(4)将巴曲酶检测试剂真空冷冻干燥得到巴曲酶检测试剂冻干品。

试验例：本试验例的一种血小板聚集功能巴曲酶杯检测试剂可以很好的检测纤维蛋白原的功能，使用该试剂可以更直观的反映患者全部交联纤维蛋白和患者自身实际状况条件下血小板聚合产生的作用。该试剂中含冻干保护剂、活化的人十三因子和巴曲酶。

巴曲酶检测试剂中巴曲酶添加量为0.5-3.5BU/瓶，活化人十三因子添加量为4.0-12U/瓶。巴曲酶用量取1.0BU/瓶、2.0BU/瓶和3.0BU/瓶三个水平，活化人十三因子用量取6.0U/瓶、8.0U/瓶和10.0U/瓶三个水平。实验分组如下表1，用各组试剂对血栓弹力图各指标进行测量判断不同用量对血栓弹力图各指标的影响，结果见表2。

表1巴曲酶杯主要原料添加量优化分组

表2巴曲酶杯不同用量主要原料对血栓弹力图各指标的影响

注：

从表2中各数据可以看出，编号5实验组中R、K、Angle和MA与参比试剂测量结果的相对偏差最小，所以本发明试剂中巴曲酶用量优选2.0BU、人活化十三因子用量优选8.0U。

在主要原料的基础上，为了进一步提高巴曲酶试剂的性能，向巴曲酶杯试剂中加入冻干保护剂和pH稳定剂，冻干保护剂包括糖类冻干保护剂和聚合物冻干保护剂。

其中糖类冻干保护剂为海藻糖、蔗糖、葡聚糖和葡萄糖中的一种或几种，实验结果显示加入试剂质量体积0.1-3.0％的葡萄糖时冻干效果最好，且对巴曲酶杯检测试剂各指标无明显影响。葡萄糖作为一种蛋白质类非特异性的稳定剂，可在冻干全过程保护血浆中一些蛋白质(如：纤维蛋白原等)，且负载有糖类的血小板在冻干后其活性可保存90％。

聚合物类冻干保护剂为牛血清白蛋白、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇中的一种或几种，实验结果显示加入试剂质量体积0.1-3.0％的牛血清白蛋白时冻干效果最好，且对巴曲酶杯检测试剂各指标无明显影响。加入牛血清白蛋白可以保护血小板和一些凝血因子等在冻干中避免低温和脱水对其活性的影响。

pH稳定剂为乙二胺四乙酸、氯化钠、醋酸钠中的一种或几种，实验结果显示加入试剂质量体积0.01-0.3％的乙二胺四乙酸和0.1-3.0％的氯化钠时冻干效果最好，且对巴曲酶杯检测试剂各指标无明显影响。通过加入乙二胺四乙酸和氯化钠可以稳定溶液的pH，保持溶液的pH不变，提高试剂的稳定性。

用牛血清白蛋白、葡萄糖、乙二胺四乙酸和氯化钠做冻干保护剂，巴曲酶和人活化十三因子活性保持的效果最为理想。经初步预实验后，将各冻干保护剂用量暂定为：葡萄糖选择0.3％、0.6％和0.9％三个水平；氯化钠选择0.3％、0.6％和0.9％三个水平；牛血清白蛋白选择1.0％、2.0％和3.0％三个水平；乙二胺四乙酸选择0.04％、0.08％和0.12％三个水平；。

采用L

表3巴曲酶杯检测试剂配方优化试验设计方案

以某进口试剂作为参比试剂，每个样本分别用本发明试剂和参比试剂平行做三次，检测结果如下表4所示。

表4巴曲酶杯检测试剂优化试验结果

注：

从表4结果可以看出，，编号6实验组中R、K、Angle和MA与参比试剂测量结果的相对偏差最小，所以本发明试剂中葡萄糖用量优选0.3％、氯化钠用量优选0.6％、牛血清白蛋白用量优选1.0％，乙二胺四乙酸用量优选0.08％。

应用例：

血栓弹力图(TEG)检测特征量说明如下：

血凝时间R：凝血酶等凝血因子被充分激活，纤维蛋白凝血块形成开始，到血栓弹力图仪描计振幅达到2mm所需时间。R值延长，说明某些凝血因子缺乏；R值缩短，说明血液呈高凝状态。

血块成形时间K：从R值时间终点开始到血栓弹力图仪描计振幅达到20mm所需时间，反映纤维蛋白和血小板在凝血开始形成时的相互作用。K值的长短反映纤维蛋白原水平的高低。

血凝速率Angle：血栓弹力图仪描计振幅曲线弧度最大点的切线与水平线的夹角，反映血凝块形成的速率。当血液处于重度低凝状态时，描计振幅达不到20mm，此时K值无法确定。

血块强度MA：血栓弹力图仪最大描计振幅，是纤维蛋白和血小板GPⅡb/Ⅲa受体结合，表现纤维蛋白/血小板凝块的最大强度。

本发明所述巴曲酶杯检测试剂直接检测经过肝素钠处理的抗凝全血，采集的抗凝全血室温放置不得超过24小时，最好在2小时内使用。

将上述血小板聚集功能检测试剂盒用于全血检测方法如下。

1)打开应用软件，在患者信息界面输入患者姓名，选择测试类型，巴曲酶杯“A-Activated”；

2)在血栓弹力图仪通道上装巴曲酶杯；

3)取出巴曲酶杯检测试剂和纯化水，分别移取40μl纯化水加入巴曲酶杯检测试剂瓶中，盖上瓶盖，充分摇匀；

4)巴曲酶杯检测：从步骤3)复溶试剂中移取10μl液体加入巴曲酶杯中，再加入360μl肝素化血样，于杯中抽吸三次混匀，将巴曲酶杯推至顶端，测试杆拨至“测试”位，选中“A-Activated”通道，点击软件界面“开始”或键盘F10，开始测试；

8)凝血过程约20分钟结束；

9)测试完成后，在软件界面点击“停止”，卸去测试杯，按实验室管理规定处置；

10)数据：在软件界面双击巴曲酶杯检测通道的测试结果图，即可查看患者交联纤维蛋白和自身血小板聚集引起的血块强度的信息。

11)检测完毕，关闭仪器电源开关。

随机选取3例健康人对其进行抗凝全血检测，其MA值结果如表5所示(其中血块强度MA的参考区间巴曲酶MA/mm 5-30)。

表5随机3例健康人抗凝全血检测结果

可见随机3例健康人抗凝全血检测结果均在规定范围内，本发明试剂盒检测结果和患者实际情况相一致。

用本发明试剂盒对新鲜枸橼酸钠和肝素钠抗凝全血进行批内精密度和批间精密度进行测定，结果见表6和表7。

表6批内精密度

从表6可以看出，本发明巴曲酶试剂对新鲜枸橼酸钠和肝素钠抗凝全血批内精密度检测结果的变异系数均小于10％，批内精密度较高。

表7批间精密度

从表7结果可知，各特征量批间精密度的检测结果相对极差均小于10％，批间精密度较高。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不限制本发明，凡在本发明的精神和原则范围内所做的任何修改、等同替换和改进，均应包含在本发明的保护范围之内。