PTX-3在医学检测中的新应用

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，更具体地，涉及PTX-3在医学检测中的新应用。

背景技术

卵巢癌是妇科中最主要的恶性肿瘤之一。由于早期缺乏典型症状和有效的生物标志物，临床诊断时约有70％的患者处于晚期。上皮性卵巢肿瘤是主要的病理类型，占卵巢癌的80-95％。上皮性卵巢癌患者对化疗药物敏感，大多数晚期患者在接受标准治疗后通常可达到临床缓解，但由于复发和耐药性，很多患者的预后并不好。因此探索卵巢癌的早期诊断和预后生物标志物具有重要的临床意义。

随着基因芯片和高通量测序技术的发展，基因表达谱的生物信息学分析已广泛用于探索潜在的诊断标记或治疗靶标。加权基因共表达网络分析(WGCNA)是一个功能强大的工具，可用于描述基因之间的相关模式以及探索与某些性状相关的中心基因。WGCNA(加权基因共表达网络分析)通过在基因之间构建共表达网络，将基因分为几个共表达模块。最后，将模块与临床特征相关联，以进一步分析与疾病高度相关的模块，并确定对于疾病进展至关重要的核心基因。

PTX3(Pentraxin-3)最初是在1992年发现的，是邻戊二甲酸酯家族的成员，是典型的急性期蛋白，是先天免疫系统体液免疫的重要组成部分。近年来，许多研究表明，PTX3在实体瘤如肝癌，结肠癌和神经胶质瘤中过表达。PTX3还参与调节恶性生物学行为，例如增殖，转移和血管生成。PTX3被我们首先确认为卵巢癌的生物学标记，可能会成为未来卵巢癌新的诊断和预后指标。

发明内容

本发明需要解决的技术问题在于提供PTX-3在医学检测的新应用。

本发明的第一个目的是提供PTX-3基因和/或PTX-3蛋白作为诊断卵巢癌标记物的应用。

本发明的第二个目的是提供PTX-3基因和/或PTX-3蛋白作为检测卵巢癌标记物的应用。

本发明的第三个目的是提供PTX-3基因和/或PTX-3蛋白作为监测卵巢癌远处转移标记物的应用。

本发明的第四个目的是提供PTX-3基因和/或PTX-3蛋白作为监测或评估卵巢癌预后标记物的应用，优选地，作为卵巢癌复发转移监测标志物。

本发明的第五个目的是提供PTX-3基因和/或PTX-3蛋白作为鉴别或者区分卵巢癌肿瘤与交界性肿瘤标记物的应用。

本发明的第六个目的是提供PTX-3基因和/或PTX-3蛋白作为评估卵巢癌治疗方案的标记物的应用。

本发明的七个目的是提供一种检测或诊断卵巢癌的试剂盒。

一种检测或诊断卵巢癌的试剂盒，包括有检测PTX-3基因的表达的试剂，和/或包括有检测PTX-3蛋白表达量的试剂。

本发明的第八个目的是提供一种监测卵巢癌远处转移的试剂盒。

一种监测卵巢癌远处转移的试剂盒，包括有检测PTX-3基因的表达的试剂，和/或包括有检测PTX-3蛋白表达量的试剂。

本发明的第九个目的是提供一种监测或评估卵巢癌预后的试剂盒。

一种监测或评估卵巢癌预后的试剂盒，包括有检测PTX-3基因的表达的试剂，和/或包括有检测PTX-3蛋白表达量的试剂。

本发明的第十个目的是提供一种鉴别或者区分卵巢癌肿瘤与交界性肿瘤标记物的试剂盒。

一种鉴别或者区分卵巢癌肿瘤与交界性肿瘤标记物的试剂盒，包括有检测PTX-3基因的表达的试剂，和/或包括有检测PTX-3蛋白表达量的试剂。

所述试剂盒可以采用常规的免疫学检测或者基因检测方法，免疫学检测方法的原理基于抗原抗体结合反应，例如免疫检测方法中的酶联免疫检测方法(ELISA)或免疫层析技术，免疫组化法，或蛋白质印迹法(western blot)、免疫渗滤法、蛋白芯片法等等。

在其中一些实施例中，所述试剂盒包括采用免疫组织化学方法检测PTX-3蛋白表达量的试剂。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提出以一系列科学的生物信息学分析方法作为卵巢癌与正常卵巢组织差异蛋白的筛选方法，首次提出PTX-3基因或者PTX-3蛋白作为卵巢癌检测或者诊断的标记物，以及作为卵巢癌肿瘤与交界性肿瘤以及正常卵巢上皮的鉴别指标，并首次提出PTX-3基因或者PTX-3蛋白作为卵巢癌复发转移监测标志物的新应用。弥补了卵巢癌复发转移监测指标缺失的不足，具有良好的临床应用价值。

附图说明

图1差异表达基因和富集分析结果之间的表达值：

(A)从GSE18520和GSE26712鉴定出的卵巢癌和正常组织，红色表示上调，蓝色表示下调；(B)前50个差异基因热图；(C)对差异表达基因进行GO富集分析；(D)差异表达基因的KEGG富集分析。

图2加权基因共表达网络分析(WGCNA)结果示意图：

(A)分析1-20软阈值功效(β)的拟合指数和平均连通性；(B)基因通过层次聚类分为不同的模块，不同的颜色代表不同的模块；(C)热图显示模块特征基因与特征的相关性；(D)紫色模块中基因的散点图；(E)GO富集分析紫色模块中的基因；(F)紫色模块中基因的KEGG富集分析。

图3Hub基因的生存分析：

(A)up_差异表达基因s和模块基因维恩图；(B)卵巢肿瘤中25个基因的预后价值(Kaplan–Meier绘图仪中的OS)；(C)卵巢肿瘤中25个基因的预后价值(Kaplan–Meier绘图仪中的PFS)；(D)基因在OS和PFS中均具有显着差异。

图4卵巢肿瘤组织中PTX3蛋白表达过高：

(A)人正常卵巢组织，交界组织和恶性卵巢肿瘤中PTX3染色的代表性图像；

(B)恶性肿瘤中PTX-3的IHC评分显着高于正常卵巢和交界组织；(C)高度恶性肿瘤中PTX-3的IHC评分显着高于低度恶性肿瘤；(D)网膜转移IHC评分；(E)肠转移IHC评分；(F)淋巴结转移IHC评分。

图5 PTX3在卵巢癌中的诊断和生存价值：(A)ROC分析在卵巢癌中对PTX3的诊断价值；(B)Kaplan-Meier分析在卵巢癌患者中的总体生存率；(C)Kaplan-Meier分析用于低度卵巢癌患者的总体生存率；(D)Kaplan-Meier分析用于高级卵巢癌患者的总体生存率；(E)ER(-)卵巢癌患者总体生存的Kaplan-Meier分析；(F)ER(+)卵巢癌患者总体生存的Kaplan-Meier分析；(G)Kaplan-Meier分析用于P53(-)卵巢癌患者的总体生存率；(H)Kaplan-Meier分析用于P53(+)卵巢癌患者的总体生存率。

图6 PTX3表达与卵巢癌预后的关系：

(A)基于对卵巢癌患者OS的单变量Cox回归分析的森林图；(B)基于卵巢癌患者OS的多变量Cox回归分析的森林图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。

除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。

本发明的术语"包括”和“具有”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。例如包含了一系列步骤的过程、方法、装置、产品或设备没有限定于已列出的步骤或组分，而是可选地还包括没有列出的步骤，或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或组分。

在本发明中提及的“多个”是指两个或两个以上。“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B这三种情况。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。

除非特别说明或另有定义，本文所使用的“第一、第二…”仅仅是用于对名称的区分，不代表具体的数量或顺序。

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。

定义：

交界性肿瘤：在良性和恶性之间的肿瘤，是指组织形态和生物学行为介于良性与恶性之间的肿瘤，也称为中间性(或中间型)肿瘤。是一种低度潜在恶性肿瘤，它同时具有良性肿瘤和恶性肿瘤的一些特征，如生长缓慢，复发迟类似良性肿瘤，但又可以发生转移，只不过转移率较低，鉴于这种肿瘤的特征处于良性和恶性的肿瘤。

肿瘤分化程度：是指肿瘤细胞接近于正常细胞的程度，其中高分化癌及肿瘤组织与正常组织相似，成熟度高，恶性度低。低分化癌与未分化癌肿瘤组织与正常组织相差很大，成熟度差，恶性度高。

高级别与低级别卵巢癌：卵巢癌中浆液性肿瘤最常见，高级别肿瘤指的是由高度异型性的肿瘤细胞构成，多形成实性区域，仅形成少量粗大乳头，高级别肿瘤细胞形态上细胞核染色质浓聚，可见非典型核分裂象。低级别肿瘤指的是常形成丰富乳头的肿瘤，微乳头可见，低级别肿瘤细胞形态上细胞异型性比高级别肿瘤小，砂粒体常见。

FIGO分期：国际妇产科联盟(FIGO)根据卵巢癌在盆腹腔的侵犯程度以及是否远处转移进行分期,具体为卵巢肿局限在卵巢为I期，当扩散到盆腔脏器时为II期，当侵犯腹腔脏器时为III期，当出现远端转移如肺、胸腔、肝、骨转移时为IV期。

无进展生存期(Progression freesurvival，PFS)：从初次手术至疾病复发或进展的时间。

总生存期(Overallsurvival，OS)：从初次手术后至患者死亡或终止随访的时间。

肿瘤复发：影像学发现肿瘤进展和/或连续2次血清CA125达到或超过正常上限的2倍。

本发明中，首先使用生物信息学方法整合GSE18520和GSE26712两个数据集。使用R软件包“limma”对进行比较分析获得328个差异表达基因(图1A和图1B的火山图和热图)。定义|logFC|>1.5，并且p值<0.05定义为差异表达基因。其中100个基因被上调，而228个基因被下调。使用R软件包“cluster profiler”，富集分析328个差异表达基因。

其次，使用R软件包“WGCNA”筛选方差图中前25％的基因，以构建共表达网络。为了构建无标度网络，我们选择β＝5作为软阈值(图2A)，总共获得了15个基因模块(图2B)。在15个基因模块中，紫色基因模块与癌症高度相关(R2＝0.57，P＝5e-24)。因此将紫色基因模块作为集线器模块。紫色基因模块中基因的散点图如图2D所示。富集分析结果如图2E和图2F所示，基于差异表达基因的最丰富的是“核分裂”，在CC中是“纺锤形”，在MF中是“微管蛋白结合”。KEGG途径的富集分析结果包括“细胞周期”和“p53信号传导途径”，它们都是众所周知的途径。

然后选择被识别为上调的差异表达基因s和紫色模块基因的25个基因，并将其指定为中心基因(图3A)。从KM-PLOTTER数据库中探索这些基因在卵巢中的预后价值。这些基因的OS(总体存活)森林图如图3B所示，而这些基因的无进展生存(PFS)森林图也如图3C所示。13个基因(BUB1B，KIF20A，MCM2，CEP55，MTHFD2，FOXM1，PBK，CDKN2A，PTX3，RACGAP1，MEOX1，UBE2C，IDH2)与卵巢癌患者的OS和PFS相关(图3D)。

本发明还通过免疫组织化学检测了正常卵巢组织，交界性卵巢肿瘤样品和恶性卵巢癌样品中PTX3的蛋白表达水平。结果表明PTX3在卵巢癌组织中高表达(图4,图5A)。进一步的分析表明，PTX3的表达水平与肿瘤分化程度显着相关。通过检测PTX3的蛋白表达水平，我们可以将卵巢癌与交界性肿瘤和正常卵巢组织区分开来。

本发明还通过免疫组织化学检测卵巢癌组织中PTX3的蛋白表达水平。Kaplan–Meier分析的结果表明，PTX3阳性患者的OS显着低于PTX3阴性患者(p＝0.009，图5B)。进一步的亚组分析显示，较高的PTX3表达与高级别卵巢癌患者的不良预后相关，但与低级别卵巢癌患者的预后无关(图5C-D)。进一步的结果表明，PTX3的表达与ER(+)和P53(+)卵巢癌患者的预后有关(图5E-H)。通过cox进行回归模型分析。单因素分析结果显示，分级、网膜转移、肠转移、PTX3表达与总生存率显着相关(图6A)。进一步的多变量分析显示，肠转移和PTX3表达水平是独立的危险因素(图6B)。

以下通过具体实施例，对本发明做进一步的阐述，但是不用于限制本发明的保护范围。

实施例1：卵巢癌差异表达基因的初步筛选

采用GEO数据库中选择了两个卵巢癌数据集：GSE18520和GSE26712。GSE18520数据集基于GPL570平台(HG-U133_Plus_2；Affymetrix人类基因组U133 Plus 2.0阵列)，包含53个高级浆液性乳头状癌样品和10个癌旁癌样品。GSE26712数据集基于GPL96平台(HG-U133A；Affymetrix人类基因组U133A阵列)，包含10个正常卵巢上皮样本和185个原发性卵巢癌样本。通过使用R包“limma”，分析了20个正常卵巢样本和238个卵巢癌样本的差异。|logFC|>1.5，并且p值<0.05定义为差异表达基因。通过使用R包“cluster profiler”，通过基因本体论(GO)富集和《京都基因与基因组百科全书》(KEGG)途径分析了总共100个上调基因和228个下调基因。P值<0.05被定义为有意义的富集分析结果。GO和KEGG途径分析用于预测潜在功能，差异表达基因中最丰富的GO术语是“对营养水平的响应”，在细胞成分(CC)中是“含胶原的细胞外基质”，而在分子功能(MF)中则是“酶抑制剂活性”。KEGG途径富集分析结果表明，最集中的是“补体和凝血级联”和“视黄醇代谢”。

结论：结果表明卵巢癌细胞与正常卵巢癌细胞相比，可以初步发现100个上调基因和228个下调基因，这些差异基因可能通过“对营养水平的响应”、“含胶原的细胞外基质”、“酶抑制剂活性”、“补体和凝血级联”和“视黄醇代谢”等多种途径调节卵巢癌的发生和发展。参见图1c和图1d。

实施例2：加权共表达网络的构建进一步筛选卵巢癌差异表达基因

采用WGCNA软件包用于构建基因共表达网络。选择方差图中基因的前25％，以构建加权共表达网络。使用动态剪切树算法将网络模块细分。为了测试每个已识别模块的稳定性，使用WGCNA软件包中的保存功能模块稳定性来随机生成训练和测试集。通过与Pearson相关的测试评估模块与临床特征之间的相关性来搜索关键模块。样本的临床特征包括正常组织和卵巢癌，计算模块和特征之间的相关性。与卵巢癌正相关的模块被认为在该疾病的发病机理中起作用。另一方面，与正常性状正相关的模块中的基因对于维持正常的生物学功能至关重要。通过WGCNA将所有基因分为15个共表达模块。在将模块与临床特征相关联后，我们可以得出与卵巢癌的相关性最高的模块，适合于挖掘核心基因。GO和KEGG的富集表明，该模块基因主要集中在“核分裂”，“纺锤体”，“微管蛋白结合”，“细胞周期”，“p53信号传导途径”等途径中。这表明在卵巢癌的发展过程中，肿瘤细胞周期发生了异常变化。将该模块中的基因与上调的差异表达基因s相交以获得25个核心基因。

结论：加权共表达网络可以将拟研究的目标基因数量大幅度压缩，最后筛选出25个核心基因，该基因群可能通过参与细胞周期相关途径参与卵巢癌恶性生物学行为的调控。

实施例3：卵巢癌差异表达基因的生存分析

结合差异表达基因和模块化基因后，我们选择重叠的基因作为中心基因(图3A)。Kaplan Meier-Plotter数据库(http://kmplot.com/analysis/)中的卵巢癌数据用于中心基因的生存分析。这些基因的OS(总体存活)森林图如图3B所示，而这些基因的无进展生存(PFS)森林图也如图3C所示，而这些基因的无进展生存(PFS)森林图也如图3C所示。总共鉴定出13个基因，包括BUB1B，KIF20A，MCM2，CEP55，MTHFD2，FOXM1，PBK，CDKN2A，PTX3，RACGAP1，MEOX1，UBE2C和IDH2，其与卵巢癌患者的OS和PFS相关(图3D)。

结论：BUB1B，KIF20A，MCM2，CEP55，MTHFD2，FOXM1，PBK，CDKN2A，PTX3，RACGAP1，MEOX1，UBE2C和IDH2 13个差异表达基因与卵巢癌预后密切相关。

实施例4：免疫组织化学染色鉴别卵巢癌与正常卵巢组织及交界性肿瘤

通过对中国医科大学附属盛京医院妇产科168例恶性上皮性卵巢癌样本、37份临界上皮性卵巢癌样本和10份正常上皮性卵巢样本进行免疫组织化学染色。兔抗人PTX3抗体购自Abcam。免疫组织化学试剂盒和DAB染色试剂购自Solarbio。在10％福尔马林固定后，将石蜡包埋的卵巢组织切成4μm切片。将切片用梯度乙醇脱蜡，用内源性过氧化物酶封闭，然后通过在微波中加热并自然冷却至室温进行抗原热修复处理。将切片在37℃的山羊血清中孵育并封闭，然后在4℃的兔抗人PTX3抗体(1：200稀释度，ab90806，Abcam)中孵育过夜。接下来，将切片在辣根标记的山羊抗兔二抗中于37℃孵育，并用3,3'-二氨基联苯胺染色。苏木精将细胞核染成蓝色。然后将切片脱水，用二甲苯洗涤并固定。使用磷酸盐缓冲盐水代替抗体作为阴性对照。每个部分均由两名病理学家独立评估和评分。在该测量中使用半定量评分系统。染色强度分为“0”(阴性)，“1”(弱)，“2”(中度)和“3”(强)。计算每个切片中阳性染色的肿瘤细胞的比例。最后，通过将比例分数与染色强度分数相乘，得出最终的IHC(免疫组化)分数。IHC分数从0(最低)到300(最高)不等。PTX3的阳性表达定义为IHC得分>10。

通过IHC检测了正常卵巢组织，交界性卵巢肿瘤样品和恶性卵巢癌样品中PTX3的蛋白表达水平(图4A)，可知恶性卵巢癌样品PTX3蛋白表达水平高于交界性卵巢肿瘤样品，在正常卵巢组织的上皮细胞中PTX3蛋白表达水平远低于卵巢肿瘤样品(图4B)。基于PTX3的表达水平，我们可以将恶性肿瘤与交界性肿瘤和正常卵巢组织区分开来(AUC＝0.919，p<0.001)。进一步的分析表明，PTX3的蛋白表达水平与肿瘤分化程度显着相关，在高级别卵巢癌患者样品中PTX3蛋白表达水平高于低级别卵巢癌患者样品(图4C)。PTX3的蛋白表达水平与大网膜转移、肠转移以及淋巴结转移均没有相关性(图4D-F)。

结论：PTX3在卵巢癌组织中高表达，通过免疫组织化学染色方法检测PTX3蛋白表达情况有助于病理诊断判断卵巢肿瘤中浆液性癌与交界性肿瘤以及正常卵巢组织。

实施例5：PTX3在卵巢癌中的诊断和生存价值

我们通过对中国医科大学附属盛京医院妇产科168例恶性上皮性卵巢癌样本进行免疫组化染色分析。所有肿瘤样品均为原发性上皮性卵巢肿瘤。提供所有患者的完整临床和病理信息。没有患者在手术前接受过化学疗法或激素疗法。

我们利用ROC曲线分析PTX-3表达水平在卵巢癌远处转移患者中的监测作用，发现PTX-3表达水平对卵巢癌远处转移监测的敏感性和特异性分别为75％和90％,95％置信区间为0.702-0.968，具有特异性好,灵敏度高的特点(图5A)。生存分析Kaplan–Meier分析的结果表明，PTX3阳性患者的OS(总生存期)显著低于PTX3阴性患者(p＝0.009，图5B)。进一步的亚组分析显示，较高的PTX3蛋白表达与高级别卵巢癌患者的不良预后相关，但与低级别卵巢癌患者的预后无关(图5C-5D)。进一步的结果表明，PTX3的表达与ER(+)和P53(+)卵巢癌患者的预后有关(图5E-H)。说明PTX3在恶性程度更高的高级别癌里面，对预后的预测作用更好。

通过cox回归模型分析了卵巢癌患者的年龄，等级，大网膜转移，肠转移，淋巴结转移，ER，P53，PTX3表达水平与生存时间之间的关系。单因素分析结果显示，分级(HR＝2.419，95％HR＝1.128-4.802，p＝0.012)，网膜转移(HR＝2.889，95％HR＝1.894-4.407，p<0.001)，肠转移(HR＝5.045，95％HR＝3.020-8.429，p<0.001)，PTX3表达(HR＝1.782，95％HR＝1.143-2.778，p＝0.011)与总生存率显着相关(图6A)。进一步的多变量分析显示，肠转移(HR＝5.053，95％HR＝2.560-9.975，p<0.001)和PTX3表达水平(HR＝1.922，95％HR＝1.211-3.050，p＝0.006)是独立的危险因素(图6B)。

结论：PTX3是卵巢癌患者的独立不良预后因素，具有良好的预后诊断价值。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。