一种海马齿种籽无菌播种和培养的方法

技术领域

本发明涉及一种海马齿种籽消毒培养的方法，属于植物培养领域。

背景技术

海马齿（

海马齿的研究工作中大多使用野外采样的海马齿，野外环境复杂，导致海马齿具有各不相同的遗传背景，造成实验误差。以根、茎、叶为外植体诱导愈伤组织的组培方法复杂，周期长。因此目前缺乏海马齿快速高效的繁殖方法。

发明内容

为了解决上述技术问题。本发明提供一种海马齿种籽消毒培养的方法，为高效获得海马齿无菌植株提供技术支撑。

为实现上述目的，本发明采用了以下的技术方案：

一种海马齿种籽消毒种植的方法，该方法包括以下几个步骤：

1）海马齿种籽的采集：海马齿种籽采自莆田后海围垦浮床养殖的海马齿，待种籽成熟种荚开裂后，采集黑色种籽，于37℃恒温培养箱中干燥后，收集在离心管中，放置于4℃冰箱保存待用；

2） 培养基准备：配制固体培养基，121℃灭菌20-25分钟后分装于培养皿或组培瓶中冷却待用，每皿25ml；

3）种籽消毒：将种籽分装在2 ml离心管中，每管25-35粒，加入1 ml 75%酒精，上下颠倒10次，清洗种籽，用移液枪吸除液体。随后加入1 ml灭菌水，上下颠倒10次，清洗种籽，用移液枪吸除液体，此步骤反复2-3次。加入1ml商品化84消毒液（有效氯含量3.92%-5.30%），消毒30分钟，每6分钟更换一次消毒液，消毒1-5次，消毒过程中不断上下颠倒离心管，让种籽表面充分接触消毒液。然后用无菌水进行清洗3~5次，将表面消毒后的海马齿种籽置于无菌的9 cm培养皿中待播种；

4）播种及培养：用灭菌且冷却后的镊子，轻轻夹取种籽，置于固体培养基上，每皿5颗。播种后的种籽在人工气候光照培养箱中培养，温度为23-26℃，16 h光照8 h黑暗，光照强度80 lmol.m

上述步骤（2）中所述固体培养基的组成为：1/2 MS培养基+15 g/L蔗糖+8 g/L琼脂，pH调节至5.6-6.0。

上述 1/2 MS培养基的配方为配方为：硝酸铵 825 mg/L，硝酸钾 950 mg/L，二水合氯化钙 220 mg/L，七水合硫酸镁 185 mg/L，磷酸二氢钾 350 mg/L，碘化钾 0.83 mg/L，硼酸 6.2 mg/L，四水合硫酸锰 22.3 mg/L，七水合硫酸锌8.6 mg/L，二水和锰酸钠0.25mg/L，五水合硫酸铜0.025 mg/L，六水合氯化钴0.025 mg/L，七水合硫酸铁27.8 mg/L，乙二胺四乙酸二钠 37.3 mg/L，肌醇100 mg/L，盐酸0.5 mg/L，维生素B6 0.5 mg/L，维生素B10.5 mg/L。

本发明的有益效果是：

1．本发明提高了海马齿种籽的发芽率、缩短了种籽发芽时间，种籽污染率可控制在4%以下，发芽率可达到90%以上，培养的海马齿根系发达，长势良好，可快速获得大量生长健壮的海马齿无菌苗。

2．建立了有效的海马齿种籽表面消毒方法，为后续海马齿再生体系和转化体系的建立提供了材料保障，为从分子水平改良海马齿的抗性和生态修复功能奠定了基础。

附图说明

图1是本发明中海马齿播种80天后生长情况。次氯酸钠处理5次共30分钟的处理组生长情况。

具体实施方式

实施例1一种海马齿种籽无菌播种和培养方法，该方法包括以下几个步骤：

1）海马齿种籽的采集：海马齿种籽成熟变黑后，直接收集黑色种籽，保存于干燥阴凉处，尽快使用。

2）培养基准备：准备培养基，121℃灭菌20分钟后分装于培养皿中冷却待用，每皿25 ml，共准备30皿。

3）种籽消毒：准备150颗种籽，将种籽分装在2 ml离心管中，共5管，每管30颗。分别加入1 ml 75%酒精，上下颠倒10次，清洗种籽后，用移液枪吸除液体。随后分别加入约1 ml灭菌水，上下颠倒10次，清洗种籽，用移液枪吸除液体，此步骤反复3次。加入1 ml 84消毒液（有效率含量4.5%）每次消毒6分钟并上下颠倒离心管10次，用移液枪吸除液体，重复消毒5次；再次用灭菌水进行清洗后，将枪头剪去尖端，加入灭菌水，将海马齿种籽吸出，置于无菌的9 cm培养皿中，皿中保留部分水，运用水的张力方便后面夹取种籽。

4）播种：用灭菌且冷却后的镊子，轻轻夹取种籽，置于培养基表面，每瓶5颗，周边4颗中间1颗，每个处理6皿，用透气封口膜封口。

5）培养：于人工气候关照培养箱中培养，温度为24℃，16 h光照8 h黑暗，光照强度80 lmol.m

上述步骤2）中所述培养基的组成为：1/2 MS培养基+15 g/L的蔗糖+8 g/L的琼脂，pH为5.6。培养基配好后经过121℃高压灭菌20分钟，在超净工作台中分装于培养皿和组培瓶中待用。

不同消毒次数对污染率和发芽率的影响如表1。

本实施例的污染率低至3.3%，发芽率最高达93.3%。

实施例2

一种海马齿种籽无菌播种和培养方法，该方法包括以下几个步骤：

1）海马齿种籽的采集：海马齿种籽成熟变黑后，直接收集黑色种籽，于37℃恒温培养箱中干燥后，收集在离心管中，放置于4℃冰箱保存待用。

2）培养基准备：准备播种用固体培养基，121℃高压灭菌25分钟后分装于培养皿和组培瓶中待用。

3）种籽消毒：准备150颗种籽，将种籽分装在2 ml离心管中，共5管，每管30颗。分别加入约1 ml 75%酒精，上下颠倒10次，清洗种籽后，用移液枪吸除液体。随后分别加入1 ml灭菌水，上下颠倒10次，清洗种籽，用移液枪吸除液体，此步骤反复3次。加入1 ml 84消毒液（有效率含量3.92%）每次消毒6分钟并上下颠倒离心管约10次，用移液枪吸除液体，重复消毒4次；再次用灭菌水进行清洗后，将枪头剪去尖端，加入灭菌水，将海马齿种籽吸出，置于无菌的9 cm培养皿中，皿中保留部分水，运用水的张力方便后面夹取种籽。

4）播种：用灭菌且冷却后的镊子，轻轻夹取种籽，置于培养基表面，每瓶约5颗，周边4颗中间1颗，每个处理6皿，用透气封口膜封口。

5）培养：于人工气候关照培养箱中培养，温度为24℃，16 h光照8 h黑暗，光照强度80 lmol.m

上述步骤2）中所述播种培养基的组成为：1/2 MS培养基+15 g/L的蔗糖+8 g/L的琼脂，pH为5.8。

本实施例的海马齿发芽率为90.0%。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。