导航：首页> 工程元件或部件；为产生和保持机器或设备的有效运行的一般措施；一般绝热>CD73基因人源化的非人动物的构建方法及应用

CD73基因人源化的非人动物的构建方法及应用

文献发布时间：2023-06-19 13:48:08

技术领域

本发明属于动物基因工程和基因遗传修饰领域，具体地说，涉及一种CD73基因人源化的非人动物及其构建方法和在生物医药领域的应用。

背景技术

免疫疗法通过激活免疫系统攻击并杀死癌细胞，是近年来肿瘤研究的一个重要领域。目前和肿瘤免疫治疗相关的一些药物已经用于治疗癌症，已有药品上市并应用在多个适应症，如靶向T细胞共刺激分子CTLA-4、PD-1及其配体的单克隆抗体已经取得确切疗效，但病人的平均应答率较低。考虑到肿瘤的发生是多环节多因素的共同作用结果，单一的免疫治疗策略治疗效果有限，并且大量患者会对治疗产生耐药性，在临床中结合两种或多种免疫治疗手段进行是肿瘤治疗的一个趋势。开发更多可以用于提高免疫系统对肿瘤识别及杀伤能力的药物一直是免疫学研究的热点之一。

CD73是由NT5E基因(又名CD73基因)编码的胞外-5'-核苷酸酶，蛋白分子量70KD，广泛表达于人体内皮细胞、淋巴细胞，如Tregs(抑制性T细胞)等细胞表面，由葡糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定在细胞表面形成同源二聚体，但也可被切割并游离于循环系统。CD73上游的CD37将具有免疫激活作用的ATP转化腺苷单磷酸(AMP)，所产生的AMP被CD73转化为腺苷，腺苷会结合下游的腺苷受体，继而通过腺苷信号抑制免疫反应，抑制LCK、MAPK、PKC等一系列与免疫激活相关的信号通路，从而发挥免疫抑制作用，是人体的一种自我保护机制。

肿瘤微环境(Tumor micro-environment，TME)由多种细胞、胞间质、酶、细胞因子、代谢产物等构成，有显著的低氧、低pH以及高压的特点，与正常组织差异巨大。CD73是一种典型的缺氧诱导因子(HIF)靶基因，肿瘤低氧环境诱导HIF-1上调，进而导致CD73在肿瘤微环境中表达显著增加，进一步催化产生腺苷，从而抑制免疫系统，促进肿瘤的发生和发展。研究发现CD73在多种肿瘤中表达升高，CD73高表达的非小细胞肺癌患者预后不良，表明肿瘤细胞可能利用了CD73机制发生免疫逃逸。临床前研究表明，靶向CD73能够产生良好的抗肿瘤作用(Stagg J,et al.Anti-CD73 antibody therapy inhibits breast tumorgrowth and metastasis.Proc Natl Acad Sci U S A(2010)107:1547–52.)。另外，PD-1/PD-L1单抗、放化疗等治疗方案可能引起肿瘤微环境CD73表达升高，继而通过腺苷信号抑制免疫反应(即，出现获得性耐药)，将CD73阻断治疗与其它免疫分子调节剂联合(如CTLA-4抗体、PD-1抗体)有助于获得更好的疗效，是一种极具吸引力的选择(Beavis PA,etal.Oncoimmunology.2015；4(11):e1046675.)。

由于靶点机理明确，且临床前研究结果显著，目前全球已有十多家企业在开发CD73抗体药物，已有多个项目已进入临床早期阶段，如BMS的CD73抑制型单抗BMS-986179处于I期临床研究，适应症是晚期实体瘤；AZ/MedImmune公司开发的CD73抑制型单抗oleclumab在复发性卵巢癌上已进入II期临床研究。此外，还有一些针对该靶点的小分子化合物，如谷歌2017年11月斥资1.07亿美元领投的一家名为Arcus Biosciences的生物技术创新公司，这家公司主打产品之一就是靶向CD73的小分子药物AB680，目前已完成前期临床研究、等待临床审批。考虑到目前尚未有针对该靶点的药物上市，现有药物远不能满足临床需求，预计随着研究的深入，未来会有更多的公司投入到该靶点的药物研发中。

实验动物疾病模型对于研究人类疾病发生的病因、发病机制、开发防治技术和开发药物是不可缺少的研究工具。目前已有的与CD73相关的动物模型主要是基因敲除小鼠，主要是用于CD73、腺苷生物学功能(基因型、功能、调控)及相关疾病机制研究。例如，HayoCastrop等人(2004)为了研究确定腺苷的形成是否依赖于细胞外核苷酸水解，通过破坏CD73基因的2号和3号外显子制备了CD73缺失小鼠，与野生型小鼠相比，该小鼠在行为和生育方面正常，但在Henle灌注时肾小球小动脉收缩能力显著降低，得出结论认为在肾小球上产生腺苷很大程度上取决于CD73介导的AMP的去磷酸化；Patrycja Koszalka等人(2004)为了研究细胞外在血管稳态中形成的腺苷的作用，制备了缺失2号外显子的CD73敲除小鼠，证实了CD73细胞外形成的腺苷可以调节冠状血管张力，抑制血小板活化。Linda F.Thompson等人(2004年)为了研究CD73在基础条件或缺氧期间是否可功能性的调节血管渗透，制备了CD73基因3号外显子缺失的小鼠，确认了CD73是体内心血管渗透的关键调节因子。(HayoCastrop,et al.J Clin Invest.2004Sep；114(5):634-42.；Koszalka P,etal.Circulation Research.2004；95:814–821；Cornelia Blume,et al.PLoS One.2012；7(5):e37100.)(Thompson LF,et al.JExp Med 2004:1395–1405)尽管后续还有人利用这些小鼠进行了更多研究，例如Cornelia Blume等人(2012年)发现Patrycja Koszalka等人制备的CD73缺失小鼠肾功能降低，且不经诱导即会出现自身免疫性炎症。综上可见，现有模型主要是用于CD73、腺苷生物学功能(基因型、功能、调控)及相关疾病机制研究。

CD73通过形成同源二聚体发挥作用，每个单体包含N-末端结构域和C-末端结构域的结合位点，两个功能域通过短螺旋连接，两个单体通过非共价键连接并通过C-末端丝氨酸残基与GPI连接后锚定在质膜上。在成熟形式中，N-末端结构域中的26个氨基酸的信号肽协调催化二价锌、钴等金属离子，而C-末端结构域主要是AMP的结合位点。在CD73靶点相关药物研发过程中，由于人和鼠存在种属差异，抗体与靶点蛋白结合时的精确度有时达到蛋白中的单一氨基酸的变化(Joseph Conlon J,et al.Immunol.2013May 15；190(10):5216–5225)，因此，无法用普通小鼠来筛选和评价靶向人源CD73药物的药效。目前研究抗体药物药效广泛使用的体内模型是人源肿瘤异体移植小鼠模型，但该类模型在特定靶点研究中的靶向性和特异性不强，因此这类模型研究药效的结果准确性不高。

基因人源化动物模型，即，利用基因编辑技术，用人源正常或突变基因替换动物基因组的同源基因，可建立更接近人类生理或疾病特征的正常或突变基因动物模型。基因人源化动物不但本身具有重要应用价值，如通过基因人源化可改进和提升细胞或组织移植人源化动物模型，更重要的是，由于人类基因片段的插入，动物体内可表达或部分表达人源蛋白，可作为仅能识别人蛋白氨基酸序列的药物的靶点，为在动物水平进行抗人抗体及其它药物的筛选提供了可能。然而，由于动物与人类在生理学及病理学方面存在差异，加上基因(即遗传因子)的复杂性，如何能构建出“有效”的人源化动物模型用于新药研发仍是最大的挑战(Scheer N,Snaith M,Wolf CR,Seibler J.Generation and utility ofgenetically humanized mouse models,Drug Discov Today；18(23-24):1200-11,2013)。

发明内容

本发明的第一方面，提供了一种CD73基因人源化的非人动物的构建方法，所述的非人动物体内表达人或人源化CD73蛋白。

优选的，所述的非人动物的内源CD73蛋白表达降低或缺失。

优选的，所述的人源化CD73蛋白包含人CD73蛋白的全部或部分。进一步优选包含人CD73基因的1号至9号外显子编码的氨基酸序列的全部或部分。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化CD73蛋白的氨基酸序列包含下列组中的一种：

a)SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的全部或部分；

b)与SEQ ID NO：4所示氨基酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；

c)与SEQ ID NO：4所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或，

d)与SEQ ID NO：4所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。

优选的，所述的非人动物基因组包含人或人源化CD73基因。

优选的，所述的非人动物基因组包含人CD73基因的1号至9号外显子的全部或部分。进一步优选的，包含人CD73基因的1号至9号外显子中的一种或两种以上外显子的组合。

在本发明的一个具体实施方式中，包含人CD73基因的1号外显子、2号外显子、3号外显子、4号外显子、5号外显子、6号外显子、7号外显子、8号外显子和9号外显子。

优选的，包含1号外显子的全部或部分、2号至8号外显子的全部和9号外显子的全部或部分，优选还包含1-2号内含子和/或8-9号内含子，其中，1号外显子的部分至少包含100bp的核苷酸序列，例如至少包含100、150、200、250、300、310、330、335、336、337、338、339、340、350、370、390、396bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含339或396bp的核苷酸序列；1号外显子的部分包含从1号外显子的起始密码子至1号外显子的最后一个核苷酸，9号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，例如至少包含50、100、150、160、161、162、163、164、165、170、190、200、500、700、900、1000、1500、1700、1900、1944bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含164或1944bp的核苷酸序列；9号外显子的部分包含从9号外显子的第一个核苷酸至终止密码子。

在本发明的一个具体实施方式中，包含人CD73基因的CDS序列的全部或部分或人CD73的全长核苷酸序列的全部或部分。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的非人动物包含SEQ ID NO：9或17。

优选的，所述的非人动物包含编码人CD73蛋白的全部或部分核苷酸序列。进一步优选包含编码SEQ ID NO：4的核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化CD73基因包含下列组中的一种：

A)SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：17所示核苷酸序列的全部或部分；

B)与SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：17所示核苷酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；

C)与SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：17所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或，

D)与SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：17所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸残基的核苷酸序列。

优选的，所述的人源化CD73基因还包含编码2A肽的核苷酸序列，优选为编码P2A或T2A的核苷酸序列。进一步优选包含SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列。

优选的，所述的人源化CD73基因还包含编码SEQ ID NO：11的核苷酸序列。

优选的，所述的人源化CD73基因还包含转录终止序列。进一步优选为3’UTR、polyA、WPRE、STOP或lox2中的一种或两种以上的组合。更进一步优选包含STOP序列如SEQID NO：20所示和/或3’UTR序列如SEQ ID NO：22所示核苷酸序列。

优选的，所述的人源化CD73基因还包含Neo盒。

优选的，所述的人源化CD73基因还包括内源调控序列。更优选包括内源启动子核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化CD73基因按照从5’至3’的顺序，包含下列组中的一种：

A)编码SEQ ID NO：11的核苷酸序列、编码2A肽的核苷酸序列、人CD73基因的CDS序列和转录终止序列；

B)编码SEQ ID NO：11的核苷酸序列、编码2A肽的核苷酸序列、人CD73基因的CDS序列、转录终止序列和Neo盒；

C)人CD73基因的CDS序列和/或人CD73的全长核苷酸序列的部分和转录终止序列；

D)人CD73基因的CDS序列和/或人CD73的全长核苷酸序列的部分、转录终止序列和Neo盒；

E)内源调控序列、编码SEQ ID NO：11的核苷酸序列、编码2A肽的核苷酸序列、人CD73基因的CDS序列和转录终止序列；

F)内源调控序列、编码SEQ ID NO：11的核苷酸序列、编码2A肽的核苷酸序列、人CD73基因的CDS序列、转录终止序列和Neo盒；

G)内源调控序列、人CD73基因的CDS序列和/或人CD73的全长核苷酸序列的部分和转录终止序列；

H)内源调控序列、人CD73基因的CDS序列和/或人CD73的全长核苷酸序列的部分、转录终止序列和Neo盒；或，

I)编码2A肽的核苷酸序列和人CD73的全长核苷酸序列的部分。

优选的，所述的人源化CD73基因包含SEQ ID NO：23。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化CD73基因包含下列组中的一种：

(i)包含SEQ ID NO：12、13或18所示核苷酸序列的全部或部分；

(ii)包含与SEQ ID NO：12、13或18所示核苷酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；

(iii)包含与SEQ ID NO：12、13或18所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或，

(iv)包含与SEQ ID NO：12、13或18所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化CD73基因转录的mRNA包含下列组中的一种：

(i)包含SEQ ID NO：19所示核苷酸序列的全部或部分；

(ii)包含与SEQ ID NO：19所示核苷酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；

(iii)包含与SEQ ID NO：19所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或，

(iv)包含与SEQ ID NO：19所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

优选的，所述的非人动物基因组中还包含其他基因修饰，进一步优选的，所述的其他基因包含PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG-3、BTLA、CD27、CD28、CD47、CD137、CD154、OX40、SIRPα、TIGIT、TIM-3、CD40和GITR基因中的至少一种。

优选的，所述的构建方法包括用包含人或人源化CD73基因的核苷酸序列导入非人动物CD73基因座。进一步优选用包含人CD73基因的1号至9号外显子的全部或部分导入非人动物CD73基因座。

在本发明的一个具体实施方式中，用包含人CD73基因的1号外显子、2号外显子、3号外显子、4号外显子、5号外显子、6号外显子、7号外显子、8号外显子和9号外显子导入至非人动物CD73基因座。

优选用包含1号外显子的全部或部分、2号至8号外显子的全部和9号外显子的全部或部分，优选还包含1-2号内含子和/或8-9号内含子，导入非人动物CD73基因座，其中，1号外显子的部分至少包含100bp的核苷酸序列，例如至少包含100、150、200、250、300、310、330、335、336、337、338、339、340、350、370、390、396bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含339或396bp的核苷酸序列；1号外显子的部分包含从1号外显子的起始密码子至1号外显子的最后一个核苷酸，9号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，例如至少包含50、100、150、160、161、162、163、164、165、170、190、200、500、700、900、1000、1500、1700、1900、1944bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含164或1944bp的核苷酸序列；9号外显子的部分包含从9号外显子的第一个核苷酸至终止密码子。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括用包含人CD73基因的CDS序列的全部或部分或人CD73的全长核苷酸序列的全部或部分导入非人动物CD73基因座。

优选的，所述的构建方法包括用包含人CD73基因的cDNA序列导入非人动物CD73基因座。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括用包含SEQ ID NO：9、12、13、17或18的核苷酸序列导入非人动物CD73基因座。

优选的，所述的构建方法包括用包含编码人CD73蛋白的全部或部分核苷酸序列导入非人动物CD73基因座。进一步优选用包含编码SEQ ID NO：4的核苷酸序列导入非人动物CD73基因座。

优选的，人或人源化CD73基因的核苷酸序列可操作的连接至非人动物内源调控元件。进一步优选连接至非人动物启动子。

优选的，所述的导入的位置位于CD73基因的内源调控元件之后。优选的，所述的内源调控元件为内源启动子。

优选的，导入的位置位于非人动物CD73基因的1号至9号外显子上。进一步优选位于CD73基因的起始密码子至终止密码子上或者非人动物CD73基因的的全长核苷酸序列。

优选的，导入的位置位于非人动物CD73基因的2号至9号外显子上。进一步优选位于2号外显子和/或2-3号内含子上。

优选的，本申请中所述的导入包括但不限于插入、替换或转基因。

优选的，所述的非人动物是纯合或者杂合的。

优选的，所述非人动物的基因组中至少一个染色体上包含人源化CD73基因。

优选的，所述的非人动物中至少一个细胞表达人或人源化CD73蛋白。

优选的，使用基因编辑技术进行非人动物的构建，所述的基因编辑技术包括利用胚胎干细胞的基因打靶技术、规律成簇间隔短回文重复(CRISPR/Cas9)技术、锌指核酸酶(ZFN)技术、转录激活子样效应因子核酸酶(TALEN)技术、归巢核酸内切酶(兆碱基大范围核酶)或其他分子生物学技术。

优选的，使用靶向载体进行非人动物的构建，其中，所述的靶向载体包含人CD73基因的部分。进一步优选包含人CD73基因的1号至9号外显子的全部或部分。更进一步优选包含人CD73基因的1号至9号外显子中的一种或两种以上外显子的组合。

优选包含1号外显子的全部或部分、2号至8号外显子的全部和9号外显子的全部或部分，更优选还包含1-2号内含子和/或8-9号内含子，其中，1号外显子的部分至少包含100bp的核苷酸序列，例如至少包含100、150、200、250、300、310、330、335、336、337、338、339、340、350、370、390、396bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含339或396bp的核苷酸序列；1号外显子的部分包含从1号外显子的起始密码子至1号外显子的最后一个核苷酸，9号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，例如至少包含50、100、150、160、161、162、163、164、165、170、190、200、500、700、900、1000、1500、1700、1900、1944bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含164或1944bp的核苷酸序列；9号外显子的部分包含从9号外显子的第一个核苷酸至终止密码子。

在本发明的一个具体实施方式中，包含人CD73基因的CDS序列的全部或部分或人CD73的全长核苷酸序列的全部或部分。

在本发明的一个具体实施方式中，包含编码SEQ ID NO：4的核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，包含SEQ ID NO：9、12、13、17或18。

优选的，所述的靶向载体还包含5’臂(5’同源臂)和/或3’臂(3’同源臂)。所述5’臂选自非人动物CD73基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸。优选的，所述的5’臂与NCBI登录号为NC_000075.6至少具有90％同源性的核苷酸。进一步优选的，所述5’臂序列与SEQ ID NO：5、7或15至少具有90％同源性。所述3’臂选自非人动物CD73基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸。优选的，所述的3’臂与NCBI登录号为NC_000075.6至少具有90％同源性的核苷酸。进一步优选的，所述3’臂序列与SEQ ID NO：6、8或16至少具有90％同源性。

优选的，所述5’臂为与待改变的转换区5’端同源的DNA片段。

优选的，所述3’臂为与待改变的转换区3’端同源的DNA片段。

优选的，所述的待改变的转换区位于非人动物CD73基因的1号至9号外显子上。

在本发明的一个具体实施方式中，位于非人动物CD73基因的2号外显子和/或2-3号内含子上。

在本发明的一个具体实施方式中，位于非人动物CD73基因的起始密码子至终止密码子上。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括将上述靶向载体导入非人动物细胞中，培养该细胞(优选为胚胎干细胞)，然后将培养后的细胞移植至雌性非人动物输卵管内，允许其发育，鉴定筛选获得CD73基因人源化的非人动物。

优选的，为提高重组效率，还可以使用靶向CD73基因的sgRNA与上述靶向载体一起进行非人动物的构建。其中，所述的sgRNA靶向非人动物CD73基因，同时所述sgRNA的序列在待改变的CD73基因上的靶序列上。

优选的，所述sgRNA的靶位点位于CD73基因的1号外显子至9号外显子序列上。进一步优选的，所述sgRNA的靶位点位于CD73基因的2号外显子、2-3号内含子和/或3号外显子序列上。

在本发明的一个具体实施方式中，所述sgRNA的靶位点位于CD73基因的2号外显子和2-3号内含子上。

优选的，所述的sgRNA的靶位点序列如SEQ ID NO：26-41任一项所示。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括将上述靶向载体、靶向CD73基因的sgRNA及Cas9导入非人动物细胞中，培养该细胞(优选为胚胎干细胞)，然后将培养后的细胞移植至雌性非人动物输卵管内，允许其发育，鉴定筛选获得CD73基因人源化的非人动物。

优选的，所述的非人动物可以选自啮齿类动物、猪、鸡、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。

优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物。进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物。更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。

优选的，所述的非人动物是免疫缺陷的非人哺乳动物。进一步优选的，所述的免疫缺陷的非人哺乳动物为免疫缺陷的啮齿类动物、免疫缺陷的猪、免疫缺陷的兔子或免疫缺陷的猴子。更进一步优选的，所述的免疫缺陷的啮齿类动物为免疫缺陷的小鼠或大鼠。最为优选的，所述免疫缺陷鼠是NOD-Prkdc

本发明的第二方面，提供了一种CD73基因人源化的非人动物，所述的非人动物基因组包含人或人源化CD73基因。

优选的，包含1号外显子的全部或部分、2号至8号外显子的全部和9号外显子的全部或部分，优选还包含1-2号内含子和/或8-9号内含子，其中，1号外显子的部分包含从1号外显子的起始密码子至1号外显子的最后一个核苷酸，9号外显子的部分包含从9号外显子的第一个核苷酸至终止密码子。

在本发明的一个具体实施方式中，包含人CD73基因的CDS序列的全部或部分或人CD73的全长核苷酸序列的全部或部分。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的非人动物包含SEQ ID NO：9或17。

优选的，所述的非人动物包含编码人CD73蛋白的全部或部分核苷酸序列。进一步优选包含编码SEQ ID NO：4的核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化CD73基因包含下列组中的一种：

A)SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：17所示核苷酸序列的全部或部分；

C)与SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：17所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或，

D)与SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：17所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸残基的核苷酸序列。

优选的，所述的人源化CD73基因还包含2A肽，优选为P2A或T2A。进一步优选包含SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列。

优选的，所述的人源化CD73基因还包含编码SEQ ID NO：11的核苷酸序列。

优选的，所述的人源化CD73基因还包含转录终止序列。进一步优选为3’UTR、polyA、WPRE或lox2中的一种或两种以上的组合。更进一步优选包含SEQ ID NO：20和/或SEQID NO：22所示核苷酸序列。

优选的，所述的人源化CD73基因还包含Neo盒。

优选的，所述的人源化CD73基因还包括内源调控序列。更优选包括内源启动子核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化CD73基因按照从5’至3’的顺序，包含下列组中的一种：

A)编码SEQ ID NO：11的核苷酸序列、编码2A肽的核苷酸序列、人CD73基因的CDS序列和转录终止序列；

B)编码SEQ ID NO：11的核苷酸序列、编码2A肽的核苷酸序列、人CD73基因的CDS序列、转录终止序列和Neo盒；

C)人CD73基因的CDS序列和/或人CD73的全长核苷酸序列的部分和转录终止序列；

D)人CD73基因的CDS序列和/或人CD73的全长核苷酸序列的部分、转录终止序列和Neo盒；

E)内源调控序列、编码SEQ ID NO：11的核苷酸序列、编码2A肽的核苷酸序列、人CD73基因的CDS序列和转录终止序列；

F)内源调控序列、编码SEQ ID NO：11的核苷酸序列、编码2A肽的核苷酸序列、人CD73基因的CDS序列、转录终止序列和Neo盒；

G)内源调控序列、人CD73基因的CDS序列和/或人CD73的全长核苷酸序列的部分和转录终止序列；

H)内源调控序列、人CD73基因的CDS序列和/或人CD73的全长核苷酸序列的部分、转录终止序列和Neo盒；或，

I)编码2A肽的核苷酸序列和人CD73的全长核苷酸序列的部分。

优选的，所述的人源化CD73基因包含SEQ ID NO：23。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化CD73基因包含下列组中的一种：

(i)包含SEQ ID NO：12、13或18所示核苷酸序列的全部或部分；

(iii)包含与SEQ ID NO：12、13或18所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或，

(iv)包含与SEQ ID NO：12、13或18所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化CD73基因转录的mRNA包含下列组中的一种：

(i)包含SEQ ID NO：19所示核苷酸序列的全部或部分；

(iii)包含与SEQ ID NO：19所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或，

(iv)包含与SEQ ID NO：19所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

优选的，所述的非人动物体内表达人或人源化CD73蛋白。

优选的，所述的非人动物的内源CD73蛋白表达降低或缺失。

优选的，所述的人源化CD73蛋白包含人CD73蛋白的全部或部分。进一步优选包含人CD73基因的1号至9号外显子编码的氨基酸序列的全部或部分。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化CD73蛋白的氨基酸序列包含下列组中的一种：

a)SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的全部或部分；

b)与SEQ ID NO：4所示氨基酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；

c)与SEQ ID NO：4所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或，

d)与SEQ ID NO：4所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。

优选的，所述的非人动物可以选自啮齿类动物、猪、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。

优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物。进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物。更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。

本发明第三方面，提供了一种靶向载体，所述的靶向载体包含人CD73基因的部分。

优选的，所述的靶向载体包含人CD73基因的1号至9号外显子的全部或部分。进一步优选包含人CD73基因的1号至9号外显子中的一种或两种以上外显子的组合。

在本发明的一个具体实施方式中，包含人CD73基因的CDS序列的全部或部分或人CD73的全长核苷酸序列的全部或部分。

在本发明的一个具体实施方式中，包含编码SEQ ID NO：4的核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，包含SEQ ID NO：9、12、13、17或18。

优选的，所述的靶向载体还包含标记基因。进一步优选的，所述标记基因为负筛选标记的编码基因。更进一步优选的，所述负筛选标记的编码基因为白喉毒素A亚基的编码基因(DTA)。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的靶向载体中还包括阳性克隆筛选的抗性基因。进一步优选的，所述阳性克隆筛选的抗性基因为新霉素磷酸转移酶编码序列Neo。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的靶向载体中还包括特异性重组系统。进一步优选的，所述特异性重组系统为Frt重组位点(也可选择常规的LoxP重组系统)。所述的特异性重组系统为具有两个Frt重组位点，分别连接在抗性基因的两侧。

优选的，所述的非人动物可以选自啮齿类动物、猪、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。

优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物。进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物。更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。

本发明的第四方面，提供了一种sgRNA，所述的sgRNA靶向非人动物CD73基因，同时所述sgRNA的序列在待改变的CD73基因上的靶序列上。

在本发明的一个具体实施方式中，所述sgRNA的靶位点位于CD73基因的2号外显子和2-3号内含子上。

优选的，所述的sgRNA的靶位点序列如SEQ ID NO：26-41任一项所示。

本发明的第五方面，提供了一种编码上述sgRNA的DNA分子。优选的，所述的DNA分子双链分别为上述sgRNA的上下游序列，或者加入酶切位点后的正反向寡核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的DNA分子双链分别为SEQ ID NO：32和SEQID NO：42。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的DNA分子双链分别为SEQ ID NO：39和SEQID NO：45。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的DNA分子双链分别为SEQ ID NO：43和SEQID NO：44。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的DNA分子双链分别为SEQ ID NO：46和SEQID NO：47。

本发明的第六方面，提供了一种sgRNA载体，所述的sgRNA载体包含上述sgRNA。

本发明的第七方面，提供了一种包含上述靶向载体、上述sgRNA、上述DNA分子或上述sgRNA载体的细胞。

本发明的第八方面，提供了一种上述靶向载体、上述sgRNA、上述DNA分子、上述sgRNA载体或上述的细胞在CD73基因修饰中的应用。优选包含在敲除、插入或替换CD73基因中的应用。

本发明的第九方面，提供了一种人源化CD73基因，所述的人源化CD73基因包含人CD73基因的部分。

优选的，所述的人源化CD73基因包含人CD73基因的1号至9号外显子的全部或部分。进一步优选的，包含人CD73基因的1号至9号外显子中的一种或两种以上外显子的组合。

优选的，包含1号外显子的全部或部分、2号至8号外显子的全部和9号外显子的全部或部分，更优选还包含1-2号内含子和/或8-9号内含子，其中，1号外显子的部分至少包含100bp的核苷酸序列，例如至少包含100、150、200、250、300、310、330、335、336、337、338、339、340、350、370、390、396bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含339或396bp的核苷酸序列；1号外显子的部分包含从1号外显子的起始密码子至1号外显子的最后一个核苷酸，9号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，例如至少包含50、100、150、160、161、162、163、164、165、170、190、200、500、700、900、1000、1500、1700、1900、1944bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含164或1944bp的核苷酸序列；9号外显子的部分包含从9号外显子的第一个核苷酸至终止密码子。

在本发明的一个具体实施方式中，包含人CD73基因的CDS序列的全部或部分或人CD73的全长核苷酸序列的全部或部分。

优选的，所述的人源化CD73基因包含编码人CD73蛋白的全部或部分核苷酸序列。进一步优选包含编码SEQ ID NO：4的核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化CD73基因包含下列组中的一种：

A)SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：17所示核苷酸序列的全部或部分；

C)与SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：17所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或，

D)与SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：17所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸残基的核苷酸序列。

优选的，所述的人源化CD73基因还包含编码2A肽的核苷酸序列，优选为编码P2A或T2A的核苷酸序列。进一步优选包含SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列。

优选的，所述的人源化CD73基因还包含编码SEQ ID NO：11的核苷酸序列。

优选的，所述的人源化CD73基因还包含转录终止序列，优选为3’UTR、polyA、WPRE、STOP或lox2中的一种或两种以上的组合。进一步优选包含STOP序列如SEQ ID NO：20和/或3’UTR序列如SEQ ID NO：22所示核苷酸序列。

优选的，所述的人源化CD73基因还包含Neo盒。

优选的，所述的人源化CD73基因还包括内源调控序列。进一步优选包括内源启动子核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化CD73基因按照从5’至3’的顺序，包含下列组中的一种：

A)编码SEQ ID NO：11的核苷酸序列、编码2A肽的核苷酸序列、人CD73基因的CDS序列和转录终止序列；

B)编码SEQ ID NO：11的核苷酸序列、编码2A肽的核苷酸序列、人CD73基因的CDS序列、转录终止序列和Neo盒；

C)人CD73基因的CDS序列和/或人CD73的全长核苷酸序列的部分和转录终止序列；

D)人CD73基因的CDS序列和/或人CD73的全长核苷酸序列的部分、转录终止序列和Neo盒；

E)内源调控序列、编码SEQ ID NO：11的核苷酸序列、2A肽、人CD73基因的CDS序列和转录终止序列；

F)内源调控序列、编码SEQ ID NO：11的核苷酸序列、2A肽、人CD73基因的CDS序列、转录终止序列和Neo盒；

G)内源调控序列、人CD73基因的CDS序列和/或人CD73的全长核苷酸序列的部分和转录终止序列；

H)内源调控序列、人CD73基因的CDS序列和/或人CD73的全长核苷酸序列的部分、转录终止序列和Neo盒；或，

I)编码2A肽的核苷酸序列和人CD73的全长核苷酸序列的部分。

优选的，所述的人源化CD73基因包含SEQ ID NO：23。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化CD73基因包含下列组中的一种：

(i)包含SEQ ID NO：12、13或18所示核苷酸序列的全部或部分；

(iii)包含与SEQ ID NO：12、13或18所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或，

(iv)包含与SEQ ID NO：12、13或18所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化CD73基因转录的mRNA包含下列组中的一种：

(i)包含SEQ ID NO：19所示核苷酸序列的全部或部分；

(iii)包含与SEQ ID NO：19所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或，

(iv)包含与SEQ ID NO：19所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

本发明的第十方面，提供了一种人源化CD73蛋白，所述的人源化CD73蛋白包含人CD73蛋白的部分。

优选的，所述的人源化CD73蛋白包含人CD73基因的1号至9号外显子编码的氨基酸序列的全部或部分。进一步优选的，所述的人源化CD73蛋白由上述的人源化CD73基因编码。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化CD73蛋白的氨基酸序列包含下列组中的一种：

a)SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的全部或部分；

b)与SEQ ID NO：4所示氨基酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；

c)与SEQ ID NO：4所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或，

d)与SEQ ID NO：4所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。

本发明的第十一方面，提供了一种多基因修饰的非人动物，所述的非人动物为上述的非人动物或上述的构建方法获得的非人动物，且所述的非人动物基因组中包含基因PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG-3、BTLA、CD27、CD28、CD47、CD137、CD154、OX40、SIRPα、TIGIT、TIM-3、CD40和GITR中的至少一种的修饰。

本发明的第十二方面，提供了一种多基因修饰的非人动物的构建方法，包括如下步骤：

(一)提供上述的非人动物或上述的构建方法获得的非人动物；

(二)将步骤(一)提供的非人动物与其他基因修饰的非人动物交配、体外受精或直接进行基因编辑，并进行筛选，得到多基因修饰的非人动物。

优选的，所述的其他基因修饰的非人动物包括基因PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG-3、BTLA、CD27、CD28、CD47、CD137、CD154、OX40、SIRPα、TIGIT、TIM-3、CD40和GITR中的至少一种的人源化的非人动物。

优选的，所述的多基因修饰的非人动物的基因组中人源化的多个基因中的每一个基因均可以是纯合或杂合的。

本发明的第十三方面，提供了一种上述构建方法获得的非人动物或其子代。

本发明的第十四方面，提供了一种动物的荷瘤或炎症模型，所述的荷瘤或炎症模型来源于上述的非人动物或上述的构建方法获得的非人动物。

本发明的第十五方面，提供了一种动物的荷瘤或炎症模型的构建方法，所述的构建方法包括采用上述构建方法获得CD73基因人源化的非人动物或多基因修饰的非人动物的步骤。

本发明的第十六方面，提供了一种上述的非人动物或上述的构建方法获得的非人动物在制备荷瘤或炎症动物模型中的应用。

本发明的第十七方面，提供了一种细胞或细胞系或原代细胞培养物，所述细胞或细胞系或原代细胞培养物来源于上述的非人动物或上述的构建方法获得的非人动物，或上述的荷瘤或炎症模型。优选的，所述的细胞或细胞系或原代细胞培养物不能发育为动物个体。

本发明的第十八方面，提供了一种组织或器官或其培养物，所述组织或器官或其培养物来源于上述的非人动物或上述的构建方法获得的非人动物，或上述的荷瘤或炎症模型。优选的，所述的组织或器官或其培养物不能发育为动物个体。

本发明的第十九方面，提供了一种荷瘤后的瘤组织，所述的瘤组织来源于上述的非人动物或上述的构建方法获得的非人动物，或上述的荷瘤或炎症模型。优选的，所述的荷瘤后的瘤组织不能发育为动物个体。

本发明的第二十方面，提供了一种CD73基因人源化的细胞，所述的细胞包含人或人源化CD73基因。优选包含上述的人源化CD73基因。

优选的，所述的细胞表达人或人源化CD73蛋白。进一步优选为本发明上述的人源化CD73蛋白。优选的，所述的细胞不能发育为动物个体。

本发明的第二十一方面，提供了一种CD73基因缺失的细胞，所述的细胞缺失CD73基因的1号至9号外显子的全部或部分。优选的，缺失2号外显子的全部或部分。

在本发明的一个具体实施方式中，缺失编码SEQ ID NO：2第180-189位的核苷酸序列。

在本发明的另一个具体实施方式中，缺失CD73基因的从起始密码子开始至终止密码子为止的核苷酸序列。

优选的，所述的细胞不能发育为动物个体。

本发明的第二十二方面，提供了一种CD73基因缺失的非人动物，所述的非人动物缺失CD73基因的1号至9号外显子的全部或部分。优选的，缺失2号外显子的全部或部分。

在本发明的一个具体实施方式中，缺失编码SEQ ID NO：2第180-189位的核苷酸序列。

在本发明的另一个具体实施方式中，缺失CD73基因的从起始密码子开始至终止密码子为止的核苷酸序列。

本发明的第二十三方面，提供一种CD73基因缺失的非人动物或者细胞的构建方法，所述的构建方法采用上述sgRNA。

本发明的第二十四方面，提供了一种包含上述的人源化CD73基因的构建体。

优选的，所述的构建体表达人或人源化CD73蛋白，所述的人源化CD73蛋白如上述的人源化CD73蛋白。

本发明的第二十五方面，提供了一种包含上述构建体的细胞。

优选的，所述的细胞不能发育为动物个体。

本发明的第二十六方面，提供了一种包含上述细胞的组织。

优选的，所述的组织不能发育为动物个体。

本发明的第二十七方面，提供了来源于上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物、上述的人源化CD73基因、上述的人源化CD73蛋白、上述的荷瘤或炎症模型、上述的细胞或细胞系或原代细胞培养物、上述的组织或器官或其培养物、上述的荷瘤后的瘤组织、上述的细胞、上述的构建体、上述的细胞或上述的组织在涉及人类细胞的免疫过程的产品开发，制造抗体，或者作为药理学、免疫学、微生物学、医学研究的模型系统中的应用；或者在生产和利用动物实验疾病模型，用于开发新的诊断策略和/或治疗策略中的应用；或者在筛选、验证、评价或研究CD73通路功能、人CD73通路信号机理、靶向人的抗体、靶向人的药物、药效，免疫相关疾病药物以及抗肿瘤药物，筛选和评估人用药及药效研究方面的应用。

优选的，所述应用不是疾病的治疗和/或诊断方法。

本发明的第二十八方面，提供了一种人CD73特异性调节剂的筛选方法，所述的筛选方法包括向个体施加调节剂；其中，所述的个体选自上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物或者上述的荷瘤或炎症模型。

优选的，所述的筛选方法还包括向个体植入肿瘤细胞。

优选的，所述的调节剂选自CAR-T、药物；优选的，所述的药物为抗体。

优选的，所述的筛选方法还包括检测肿瘤抑制性。

优选的，所述的调节剂为单抗或双特异性抗体或两种及两种以上药物的联合使用。

优选的，所述检测包括测定肿瘤细胞的大小和/或增殖速率。

优选的，所述检测的方法包括游标卡尺测量、流式细胞检测和/或动物活体成像检测。

优选的，所述的检测包括评估个体体重、脂肪量、活化途径、神经保护活性或代谢变化，所述的代谢变化包括食物消耗或水消耗的变化。

优选的，所述的肿瘤细胞来源于人或非人动物。

优选的，所述的筛选方法不是治疗方法。该方法用来筛选或评价药物，对候选药物的药效进行检测和比较，以确定哪些候选药物可以作为药物，哪些不能作为药物，或者，比较不同药物的药效敏感程度，即治疗效果不是必然的，只是一种可能性。

本发明的第二十九方面，提供了一种干预方案的评价方法，所述的评价方法包括向个体植入肿瘤细胞，向植入肿瘤细胞的个体施加干预方案，对施加干预方案后的个体进行肿瘤抑制效果检测和评价；其中，所述的个体选自上述的非人动物，上述的构建方法获得的非人动物，上述的非人动物或其子代，或者上述的荷瘤或炎症模型。

优选的，所述的干预方案选自CAR-T、药物治疗。进一步优选的，所述的药物为抗原结合蛋白。所述的抗体结合蛋白为抗体。

优选的，所述的肿瘤细胞来源于人或非人动物。

优选的，所述干预方案的评价方法不是治疗方法。该评价方法对干预方案的效果进行检测和评价，以确定该干预方案是否有治疗效果，即治疗效果不是必然的，只是一种可能性。

本发明的第三十方面，提供了一种来源于上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物、上述的非人动物或其子代、上述的荷瘤或炎症模型在制备人CD73特异性调节剂中的用途。

本发明的第三十一方面，提供了一种来源于上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物、上述的非人动物或其子代、上述的荷瘤或炎症模型在制备治疗肿瘤或自身免疫疾病的药物中的用途。

本发明所述的CD73基因人源化的非人动物，其体内可正常表达人或人源化CD73蛋白，可用于针对人CD73通路靶位点的药物筛选、药效评估、自身免疫疾病和肿瘤治疗，可以加快新药研发过程、节约时间和成本。

本发明所述的“免疫相关疾病”包括但不限于过敏、哮喘、皮炎、心肌炎、肾炎、肝炎、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、硬皮病、甲状腺功能亢进、原发性血小板减少性紫癜、自身免疫性溶血性贫血、溃疡性结肠炎、自身免疫性肝病、糖尿病、疼痛或神经障碍等。

本发明所述的“肿瘤”包括但不限于淋巴瘤、脑癌、非小细胞肺癌、宫颈癌、食道癌、白血病、卵巢癌、鼻咽癌、乳癌、子宫内膜癌、结肠癌、直肠癌、胃癌、膀胱癌、肺癌、支气管癌、骨癌、前列腺癌、胰腺癌、肝和胆管癌、食管癌、肾癌、甲状腺癌、头颈部癌、睾丸癌、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、黑色素瘤、骨髓增生异常综合征、以及肉瘤。其中，所述的白血病选自急性淋巴细胞性(成淋巴细胞性)白血病、急性骨髓性白血病、髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤、浆细胞白血病、以及慢性骨髓性白血病；所述淋巴瘤选自霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤，包括B细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症；所述肉瘤选自骨肉瘤、尤文肉瘤、平滑肌肉瘤、滑膜肉瘤、软组织肉瘤、血管肉瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、以及软骨肉瘤。

本发明所述的“全部或部分”，“全部”为整体，“部分”为整体中的局部，或者组成整体的个体。

本发明所述的“人源化CD73蛋白”，包含来源于人CD73蛋白的部分和非人CD73蛋白的部分。其中，所述的“人源化CD73蛋白”包含连续或间隔的5-574个氨基酸序列与人CD73蛋白的氨基酸序列一致。

本发明所述的“人源化CD73基因”，包含来源于人CD73基因的部分和非人CD73基因的部分。其中，所述的“人源化CD73基因”包含连续或间隔的20-46000bp个核苷酸序列与人CD73基因的核苷酸序列一致，优选为连续或间隔的20-1725、20-45928bp个，更优选为20、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1725、1800、1900、2000、2500、3000、5000、10000、20000、30000、40000、45000或45928bp个核苷酸序列与人CD73基因的核苷酸序列一致。

本发明所述的“1号至9号外显子”或“1号至9号外显子的全部”包含外显子及其期间的内含子的核苷酸序列，即1号外显子、1-2号内含子、2号外显子、2-3号内含子、3号外显子、3-4号内含子、4号外显子、4-5号内含子、5号外显子、5-6号内含子、6号外显子、6-7号内含子、7号外显子、7-8号内含子、8号外显子、8-9号内含子和9号外显子。

本发明所述的“1-2号内含子”表示1号外显子与2号外显子之间的内含子。

本发明所述的“基因座”广义上讲代表基因在染色体上所占的位置，狭义上讲代表某一基因上的一段DNA片段，即可以是一个基因也可以是一个基因的一部分。例如所述的“CD73基因座”表示CD73基因1号至9号外显子上的任选一段的DNA片段。在本发明的一个具体实施方式中，被导入的CD73基因座可以是CD73基因1号至9号外显子上的任选一段的DNA片段。

本发明所述的“核苷酸序列”包含天然的或经过修饰的核糖核苷酸序列、脱氧核糖核苷酸序列。优选为DNA、cDNA、pre-mRNA、mRNA、rRNA、hnRNA、miRNAs、scRNA、snRNA、siRNA、sgRNA、tRNA。

本发明所述“治疗(treating)”(或“治疗(treat)”或“治疗(treatment)”)表示减缓、中断、阻止、控制、停止、减轻、或逆转一种体征、症状、失调、病症、或疾病的进展或严重性，但不一定涉及所有疾病相关体征、症状、病症、或失调的完全消除。术语“治疗(treating)”等是指在疾病已开始发展后改善疾病或病理状态的体征、症状等等的治疗干预。

本发明所述“同源性”，是指在使用氨基酸序列或核苷酸序列的方面，本领域技术人员在保证与已知序列相似结构或功能的前提下，可以根据实际工作需要对序列进行调整，使使用序列与现有技术获得的序列相比，具有(包括但不限于)1％，2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％，10％，11％，12％，13％，14％，15％，16％，17％，18％，19％，20％，21％，22％，23％，24％，25％，26％，27％，28％，29％，30％，31％，32％，33％，34％，35％，36％，37％，38％，39％，40％，41％，42％，43％，44％，45％，46％，47％，48％，49％，50％，51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％，58％，59％，60％，70％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.1％，99.2％，99.3％，99.4％，99.5％，99.6％，99.7％，99.8％，99.9％的同一性。

本领域的技术人员能够确定并比较序列元件或同一性程度，以区分另外的小鼠和人序列。

在一个方面，所述非人动物是哺乳动物。在一个方面，所述非人动物是小型哺乳动物，例如跳鼠科。在一个实施方式中，所述基因人源化的非人动物是啮齿动物。在一个实施方式中，所述啮齿动物选自小鼠、大鼠和仓鼠。在一个实施方式中，所述啮齿动物选自鼠家族。在一个实施方式中，所述基因修饰的动物来自丽仓鼠科(例如小鼠样仓鼠)、仓鼠科(例如仓鼠、新世界大鼠和小鼠、田鼠)、鼠总科(真小鼠和大鼠、沙鼠、刺毛鼠、冠毛大鼠)、马岛鼠科(登山小鼠、岩小鼠、有尾大鼠、马达加斯加大鼠和小鼠)、刺睡鼠科(例如多刺睡鼠)和鼹形鼠科(例如摩尔大鼠、竹大鼠和鼢鼠)家族。在一个特定实施方式中，所述基因修饰的啮齿动物选自真小鼠或大鼠(鼠总科)、沙鼠、刺毛鼠和冠毛大鼠。在一个实施方式中，所述基因修饰的小鼠来自鼠科家族成员。在一个实施方式中，所述动物是啮齿动物。在一个特定实施方式中，所述啮齿动物选自小鼠和大鼠。在一个实施方式中，所述非人动物是小鼠。

在一个特定实施方式中，所述非人动物是啮齿动物，其为选自BALB/c、A、A/He、A/J、A/WySN、AKR、AKR/A、AKR/J、AKR/N、TA1、TA2、RF、SWR、C3H、C57BR、SJL、C57L、DBA/2、KM、NIH、ICR、CFW、FACA、C57BL/A、C57BL/An、C57BL/GrFa、C57BL/KaLwN、C57BL/6、C57BL/6J、C57BL/6ByJ、C57BL/6NJ、C57BL/10、C57BL/10ScSn、C57BL/10Cr和C57BL/Ola的C57BL、C58、CBA/Br、CBA/Ca、CBA/J、CBA/st、CBA/H品系的小鼠。

除非特别说明，本发明的实践将采取细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的传统技术。这些技术在以下文献中进行了详细的解释。例如：Molecular Cloning A Laboratory Manual，2ndEd.，ed.By Sambrook，FritschandManiatis(Cold Spring Harbor Laboratory Press：1989)；DNA Cloning，Volumes I and II(D.N.Glovered.，1985)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gaited.，1984)；Mullisetal.U.S.Pat.No.4，683，195；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames&S.J.Higginseds.1984)；Transcription And Translation(B.D.Hames&S.J.Higginseds.1984)；Culture Of Animal Cells(R.I.Freshney，AlanR.Liss，Inc.，1987)；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press，1986)；B.Perbal，A PracticalGuide To Molecular Cloning(1984)；the series，Methods In ENZYMOLOGY(J.Abelsonand M.Simon，eds.inchief，Academic Press，Inc.，New York)，specifically，Vols.154and 155(Wuetal.eds.)and Vol.185，″Gene Expression Technology″(D.Goeddel，ed.)；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells(J.H.Miller andM.P.Caloseds.，1987，Cold Spring Harbor Laboratory)；Immunochemical Methods InCell And Molecular Biology(Mayer and Walker，eds.，Academic Press，London，1987)；Handbook Of Experimental Immunology，Volumes V(D.M.Weir and C.C.Blackwell，eds.，1986)；and Manipulating the Mouse Embryo，(Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，N.Y.，1986)。

本说明书提到的所有专利和出版物都是通过参考文献作为整体而引入本发明的。本领域的技术人员应认识到，对本发明可作某些改变并不偏离本发明的构思或范围。下面的实施例进一步详细说明本发明，不能认为是限制本发明或本发明所说明的具体方法的范围。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：

图1：小鼠和人CD73基因对比示意图(非按比例)。

图2：CD73基因人源化小鼠的CD73基因示意图一(非按比例)。

图3：制备CD73基因人源化小鼠所采用的打靶策略示意图一(非按比例)。

图4：Southern Blot结果，其中，ZL001至ZL018为小鼠编号，M为Marker、WT为野生型对照，H

图5：F1代小鼠鼠尾PCR鉴定体细胞基因型，其中，1F1001至1F1011为鼠尾编号，WT为野生型对照，M为Marker，H

图6：CD73基因人源化的小鼠FRT重组过程示意图(非按比例)；

图7：制备CD73基因人源化小鼠所采用的打靶策略示意图二(非按比例)。

图8：sgRNA活性检测结果，其中Con为阴性对照，PC为阳性对照。

图9：F0代小鼠体细胞的基因型鉴定结果，其中，F0-01至F0-14为小鼠编号，WT为野生型对照，M为Marker，H

图10：F1代小鼠体细胞的基因型鉴定结果，其中，2F1-01至2F1-11为小鼠编号，PC为阳性对照，WT为野生型对照，M为Marker，H

图11：Southern blot检测结果，其中，2F1-01至2F1-11为小鼠编号，WT为野生型对照。

图12：CD73基因人源化小鼠的CD73基因示意图二(非按比例)。

图13：制备CD73基因人源化小鼠所采用的打靶策略示意图三(非按比例)。

图14：F1代小鼠体细胞的基因型鉴定结果，其中，3F1-01至3F1-11为小鼠编号，M为Marker，H

图15：RT-PCR检测结果示意图，其中，+/+为野生型对照，H/H为CD73基因人源化纯合小鼠，H

图16：脾脏中白细胞亚群占比的流式检测结果；

图17：脾脏中T细胞亚群占比的流式检测结果；

图18：淋巴结中白细胞亚群占比的流式检测结果；

图19：淋巴结中T细胞亚群占比的流式检测结果；

图20：外周血中白细胞亚群占比的流式检测结果；

图21：外周血中T细胞亚群占比的流式检测结果；

图22：血常规检测结果；

图23：血生化检测结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

在下述每一实施例中，设备和材料是从以下所指出的几家公司获得：

C57BL/6小鼠和Flp工具鼠均购自中国食品药品检定研究院国家啮齿类实验动物种子中心；

AIO试剂盒来源北京百奥赛图基因生物技术有限公司，货号BCG-DX-004；

APC anti-mouse CD73 Antibody(mCD73 APC)购自Biolegend，货号为127209；

PerCP/Cy55 Anti-mouse TCR Beta Chain Antibody(mTcRβPerCP)购自Biolegend，货号为109228；

PE anti-human CD73(Ecto-5'-nucleotidase)Antibody(hCD73 PE)购自Biolegend，货号为344003；

FITC anti-mouse CD19 Antibody(hCD19 FITC)购自Biolegend，货号为115506；

PE anti-human CD73 Antibody(hCD73 PE)购自Biolegend，货号为344003；

PE/Cy

Brilliant Violet 510

APC anti-mouse CD73 Antibody(mCD73 APC)购自Biolegend，货号为127209。

本发明计划对非人动物(如小鼠)进行改造，使该非人动物体内包含编码人CD73蛋白的基因序列的全部或部分，以使其体内表达人或人源化CD73蛋白。可通过各种基因编辑系统和制备方法得到表达人CD73蛋白的非人哺乳动物，包括但不限于利用胚胎干细胞(embryonic stem cell，ES)的基因打靶技术、锌指核酸酶(ZFN)技术、转录激活子样效应因子核酸酶(TALEN)技术、归巢核酸内切酶(兆碱基大范围核酶)、规律成簇间隔短回文重复(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，CRISPR)技术或其他分子生物学技术。本发明实施例主要以ES细胞的基因同源重组技术为例，阐述如何通过构建特异靶向小鼠CD73基因靶向载体实现序列替换得到所述人源化小鼠。

实施例1CD73基因人源化小鼠

小鼠CD73基因(NCBI Gene ID：23959，Primary source：MGI:99782，UniProt ID：Q61503，基于转录本NM_011851.4(SEQ ID NO:1)及其编码蛋白NP_035981.1(SEQ ID NO:2)和人CD73基因(NCBI Gene ID：4907，Primary source：HGNC:8021，UniProt ID：P21589，基于转录本NM_002526.4(SEQ ID NO:3)及其编码蛋白NP_002517.1(SEQ ID NO:4))对比示意图如图1所示。

鉴于人或小鼠CD73具有多种亚型或转录本，本文所述的方法可应用于其它亚型或转录本。

为了达到本发明的目的，可在内源小鼠CD73基因座引入编码人CD73蛋白的基因序列，使得该小鼠表达人或人源化CD73蛋白。用基因编辑技术对小鼠细胞进行修饰，例如，在内源小鼠CD73基因座2号外显子上插入可编码人CD73蛋白的序列。为了让人CD73蛋白在小鼠体内可以更稳定、更好的表达，保留小鼠promoter(启动子)，在人CD73编码序列前插入P2A(如SEQ ID NO:10所示)。最终得到的改造后的人源化小鼠CD73基因示意图如图2，该小鼠通过内源性启动子调控人源CD73序列的表达，体内表达的CD73蛋白为人CD73蛋白；并进一步的设计了如图3所示的打靶策略。由于所插入的重组序列后存在终止密码子等转录终止序列，同时删除了小鼠的编码区部分序列，使人源化鼠CD73基因上的鼠编码区不能正常转录和翻译。

如图3所示的打靶策略示意图中，显示了靶向载体上含有小鼠CD73上游同源臂和下游同源臂序列，以及包含P2A、人CD73序列、小鼠3`UTR和STOP序列的A-1片段(SEQ ID NO:13)。其中，上述上游同源臂序列(5’同源臂，SEQ ID NO:7)与NCBI登录号为NC_000075.6的第88348101-88352454位核苷酸序列相同，下游同源臂序列(3’同源臂，SEQ ID NO:8)与NCBI登录号为NC_000075.6的第88354132-88358698位核苷酸序列相同；人CD73序列(SEQID NO:9)与NCBI登录号为NM_002526.4的第58-1782位核苷酸序列相同；STOP序列如SEQ IDNO：20所示，小鼠3’UTR序列如SEQ ID NO：22所示。A-1片段上还包括用于阳性克隆筛选的抗性基因，即新霉素磷酸转移酶编码序列Neo，并在抗性基因的两侧装上两个同向排列的位点特异性重组系统Frt重组位点，组成Neo盒(Neo cassette)。其中，P2A、人CD73序列、小鼠3`UTR和STOP序列和Neo盒序列在A-1片段上以5’到3’方向顺序排列，含有人CD73基因的序列和上游同源臂序列直接相连；Neo盒下游和鼠基因座的连接设计为5’-GCGGAACCCTTCGAAGTTCCTATTCTCTAGAAAGTATAGGAA

此外，还在靶向载体3’同源臂下游构建了具有负筛选标记的编码基因(白喉毒素A亚基的编码基因(DTA))。

靶向载体构建可采用常规方法进行，如酶切连接等。构建好的靶向载体可通过酶切进行初步验证，再送测序公司进行测序验证。将测序验证正确的靶向载体电穿孔转染入C57BL/6小鼠的胚胎干细胞中，利用阳性克隆筛选标记基因对得到的细胞进行筛选，并利用PCR和Southern Blot技术进行检测确认外源基因的整合情况，筛选出正确的阳性克隆细胞，经PCR鉴定为阳性的克隆再进行Southern Blot检测，PCR检测结果见图4，结果显示有18个克隆为阳性克隆，经测序确定ZL004、ZL007、ZL009、ZL010、ZL011、ZL012、ZL013、ZL014、ZL016及ZL018为阳性克隆且无随机插入。

PCR测定包括下述引物：

Mut F1：5’-GAGTGGTATGTGCAGCTCAGGGAAG-3’(SEQ ID NO:24)，

Mut R1：5’-GCTCCAAGAAACGAAAAGGCCGAGA-3’(SEQ ID NO:25)；

将筛选出的正确阳性克隆按照本领域已知的技术将阳性克隆细胞(黑色鼠)导入已分离好的囊胚中(白色鼠)，得到的嵌合囊胚转移至培养液中短暂培养后移植至受体母鼠(白色鼠)的输卵管，可生产F0代嵌合体鼠(黑白相间)。将F0代嵌合鼠与野生型鼠回交获得F1代鼠，使用Mut F1引物及Mut R1引物检测，检测结果见图5，结果11只F1代小鼠全部为阳性小鼠，获得阳性得F1小鼠，再将F1代杂合小鼠互相交配即可获得F2代纯合子鼠。还可将阳性鼠与Flp工具鼠交配去除阳性克隆筛选标记基因(该过程示意图见图6)后，再通过互相交配即可得到表达人CD73蛋白的CD73基因人源化纯合子小鼠(V1)。

还可以使用其他基因编辑方法获得人源化小鼠，如利用CRISPR/Cas系统进行基因编辑，设计如图7所示的打靶策略，图7中显示了靶向载体上含有小鼠CD73基因上游和下游的同源臂序列，以及包含人CD73核苷酸序列的A-2片段，其中，上游同源臂序列(5’同源臂，SEQ ID NO：5)与NCBI登录号为NC_000075.6第88350685-88352454位核苷酸序列相同，下游同源臂序列(3’同源臂，SEQ ID NO：6)与NCBI登录号为NC_000075.6第88353811-88354943位核苷酸序列相同；其中，A-2片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示，人CD73核苷酸序列为SEQ ID NO:9，与图3中A-1片段人CD73核苷酸序列相同。改造后的人源化小鼠的蛋白序列分别为SEQ ID NO:4。

靶向载体构建可采用常规方法进行，如酶切连接等。构建好的靶向载体通过酶切进行初步验证后，再送测序公司进行测序验证。将测序验证正确的靶向载体用于后续实验。

靶序列决定了sgRNA的靶向特异性和诱导Cas9切割目的基因的效率。因此，高效特异的靶序列选择和设计是构建sgRNA表达载体的前提。设计并合成识别靶位点的sgRNA序列。靶位点位于CD73基因2号外显子和2-3号内含子上，各sgRNA在CD73上的靶位点序列如下：

SgRNA1靶位点序列(SEQ ID NO:26)：5’-AGCGCAAACATTAAGGCACGGGG-3’；

SgRNA2靶位点序列(SEQ ID NO:27)：5’-TTAATGTTTGCGCTCAGAATTGG-3’；

SgRNA3靶位点序列(SEQ ID NO:28)：5’-GAGCGCAAACATTAAGGCACGGG-3’；

SgRNA4靶位点序列(SEQ ID NO:29)：5’-AATTCTGAGCGCAAACATTAAGG-3’；

SgRNA5靶位点序列(SEQ ID NO:30)：5’-CCTCTAGCACATCAGATATCTGG-3’；

SgRNA6靶位点序列(SEQ ID NO:31)：5’-TGAGCGCAAACATTAAGGCACGG-3’；

SgRNA7靶位点序列(SEQ ID NO:32)：5’-GATTGTTGGATATACTTCAAAGG-3’；

SgRNA8靶位点序列(SEQ ID NO:33)：5’-TTGGAAATTTAACGTTTCTGAGG-3’；

SgRNA9靶位点序列(SEQ ID NO:34)：5’-CATCACTTGCGGGGAAGTCCTGG-3’；

SgRNA10靶位点序列(SEQ ID NO:35)：5’-TGCTGAGTCCATCACTTGCGGGG-3’；

SgRNA11靶位点序列(SEQ ID NO:36)：5’-CAGGACTTCCCCGCAAGTGATGG-3’；

SgRNA12靶位点序列(SEQ ID NO:37)：5’-GTCTGTAACCCCGATAAGCTTGG-3’；

SgRNA13靶位点序列(SEQ ID NO:38)：5’-TTGCATCTGCGGAGTTAGCATGG-3’；

SgRNA14靶位点序列(SEQ ID NO:39)：5’-GCCATCGACCATTCGTGCACAGG-3’；

SgRNA15靶位点序列(SEQ ID NO:40)：5’-CCCTGTGCACGAATGGTCGATGG-3’；

SgRNA16靶位点序列(SEQ ID NO:41)：5’-AGTGGAGCCCTGTGCACGAATGG-3’；

利用UCA试剂盒检测多个sgRNA的活性，从结果可见sgRNA具有不同活性，检测结果见表1和图8。

表1：sgRNA相对活性检测结果

其中，虽然sgRNA2、sgRNA4、sgRNA8活性相对较低，这可能由于靶位点序列的特殊性导致，但根据我们的实验，sgRNA2、sgRNA4、sgRNA8的数值仍显著高于对照组数值，仍可判断sgRNA2、sgRNA4、sgRNA8是具有活性的，活性满足基因打靶实验要求，从中选择sgRNA7和sgRNA14进行后续实验。在其5’端及互补链上分别加上酶切位点得到正向寡核苷酸和反向寡核苷酸(见表2)，退火后将退火产物分别连接至pT7-sgRNA质粒(质粒先用BbsI线性化)，获得表达载体pT7-CD73-7和pT7-CD73-14。

表2 sgRNA7和sgRNA14正反向寡核苷酸序列

pT7-sgRNA载体由质粒合成公司合成含有T7启动子及sgRNA scaffold的片段DNA(SEQ ID NO：21)并依次通过酶切(EcoRI及BamHI)连接至骨架载体(来源Takara，货号3299)上，经专业测序公司测序验证，结果表明获得了目的质粒。

取野生型C57BL/6小鼠受精卵，利用显微注射仪将pT7-CD73-7和pT7-CD73-14质粒的体外转录产物(使用Ambion体外转录试剂盒，按照说明书方法进行转录)、靶向载体与Cas9 mRNA预混好后注射至小鼠受精卵细胞质或细胞核中。按照《小鼠胚胎操作实验手册(第三版)》(安德拉斯·纳吉，化学工业出版社，2006)中的方法进行受精卵的显微注射，注射后的受精卵转移至培养液中短暂培养，然后移植至受体母鼠的输卵管中发育，将获得的小鼠(F0代)通过杂交和自交，扩大种群数量，建立稳定的CD73人源化小鼠。

可通过与本实施例前述相同的PCR方法鉴定F0代小鼠体细胞的基因型(引物序列相同)，部分F0代小鼠的鉴定结果见图9，图中编号为F0-01、F0-02、F0-04、F0-11和F0-13的5只小鼠为阳性小鼠，经测序进一步验证这8只小鼠为阳性小鼠且无随机插入。

WT-F：5’-TTTGATAACGGTGTGGAAGGACTGAT-3’(SEQ ID NO：48)

WT-R：5’-AGACAGCGATGCCCTTCAGAGGATA-3’(SEQ ID NO：49)

WT-F：5’-TTTGATAACGGTGTGGAAGGACTGAT-3’(SEQ ID NO：48)

Mut-R：5’-TACACGGTGAACCAGATAGTGCCC-3’(SEQ ID NO：50)

GT-F：5’-GTGGGCGGAATCCATGTGGTGTATG-3’(SEQ ID NO：51)

GT-R：5’-GCCCCAGGGCGATGATCTTATTCAC-3’(SEQ ID NO：52)

将F0鉴定为阳性的CD73人源化小鼠与C57BL/6野生型小鼠交配得到F1代小鼠。可使用同样的PCR方法对F1代小鼠进行基因型鉴定，结果见图10，图中显示编号为2F1-01到2F1-11的11只小鼠均为阳性小鼠。对这11只F1代PCR鉴定为阳性的小鼠进行Southern blot检测，确认是否存在随机插入。剪取鼠尾提取基因组DNA，选用BglII酶或NcoI酶消化基因组，转膜，杂交。探针5’Probe、3’Probe分别位于5’同源臂左侧及3’同源臂上，具体探针及目的片段的长度见表3。

表3具体探针及目的片段的长度

探针合成引物如下：

5’Probe-F(SEQ ID NO：53)：5’-AGAGACCCTTTAGACCTGGATCAGC-3’

5’Probe-R(SEQ ID NO：54)：5’-ACCTAGAAAACTTTGGTGGGACATGA-3’

lox2 Stop Probe(3’)-F(SEQ ID NO：55)：5’-AACTGATGAATGGGAGCAGTGGTGG-3’

lox2 Stop Probe(3’)-R(SEQ ID NO：56)：5’-GCAGACACTCTATGCCTGTGTGGAG-3’

Southern blot检测结果见图11。综合5’Probe和STOP probe的结果，并进一步经测序验证，编号为2F1-01至2F1-11的11只小鼠均无随机插入，证实这11只小鼠为阳性杂合小鼠且不存在随机插入。这表明使用本方法能构建出可稳定传代，且无随机插入的CD73人源化基因工程小鼠(V1)。

可采用RT-PCR检测CD73基因人源化小鼠体内人源化CD73 mRNA的表达情况。分别选取7周龄野生型C57BL/6小鼠和人源化CD73纯合子小鼠各1只，脱颈安乐死后取膀胱组织，提取细胞总RNA，利用逆转录试剂盒逆转录成cDNA后进行PCR扩增，引物序列如表4所示。

表4 RT-PCR检测引物序列及目的片段长度

检测结果显示(见图15)，在野生型C57BL/6小鼠细胞中可检测到鼠CD73 mRNA表达，未检测出人源化CD73 mRNA表达；在人源化CD73纯合子小鼠细胞中检测到人源化CD73mRNA表达，未检测出鼠CD73 mRNA表达。

为了获得上述CD73人源化小鼠，还可以选择将人CD73基因组序列替换到小鼠基因座上，以下通过BAC转基因方法实现对小鼠CD73基因的改造，最终得到的人源化小鼠CD73基因示意图如图12所示，并设计了如图13所示的打靶策略图。图中显示了靶向载体上含有小鼠CD73上游同源臂和下游同源臂序列，以及包含人CD73基因序列的A-3片段。其中，上述上游同源臂序列(5’同源臂，SEQ ID NO:15)与NCBI登录号为NC_000075.6的第88323954-88327685位核苷酸序列相同，下游同源臂序列(3’同源臂，SEQ ID NO:16)与NCBI登录号为NC_000075.6的第88372532-88377482位核苷酸序列相同；人CD73序列(SEQ ID NO:17)与NCBI登录号为NC_000006.12的第85450140-85496067位核苷酸序列相同；A-3片段(如SEQID NO:18所示)上还包括用于阳性克隆筛选的抗性基因，即新霉素磷酸转移酶编码序列Neo，并在抗性基因的两侧装上两个同向排列的位点特异性重组系统LOXP重组位点。

此外，还在靶向载体3’同源臂下游构建了具有负筛选标记的编码基因(白喉毒素A亚基的编码基因(DTA))。

靶向载体构建可采用常规方法进行，如酶切连接等。构建好的靶向载体可通过酶切进行初步验证，再送测序公司进行测序验证。将测序验证正确的靶向载体电穿孔转染入C57BL/6小鼠的胚胎干细胞中，利用阳性克隆筛选标记基因对得到的细胞进行筛选，并利用PCR和Southern Blot技术进行检测确认外源基因的整合情况，筛选出正确的阳性克隆细胞，经PCR鉴定为阳性的克隆再进行Southern Blot检测，PCR检测结果见，结果显示为阳性克隆，送测序确认，并选择阳性克隆且无随机插入克隆进行下一步。

PCR测定包括下述引物：

L-GT-F：5’-AAGATGTTTCTTGTCCCGGGTTTCG-3’(SEQ ID NO：57)

L-GT-R：5’-GCAGTAAATGAGAGCTGCGTGAGGG-3’(SEQ ID NO：14)

将筛选出的正确阳性克隆按照本领域已知的技术将阳性克隆细胞(黑色鼠)导入已分离好的囊胚中(白色鼠)，得到的嵌合囊胚转移至培养液中短暂培养后移植至受体母鼠(白色鼠)的输卵管，可生产F0代嵌合体鼠(黑白相间)。将F0代嵌合鼠与野生型鼠回交获得F1代鼠，使用L-GT-F及L-GT-R引物检测，检测结果见图14，结果显示11只小鼠全部为阳性小鼠。再将F1代杂合小鼠互相交配即可获得F2代纯合子鼠。还可将阳性鼠与Cre工具鼠交配去除阳性克隆筛选标记基因后，再通过互相交配即可得到表达人CD73蛋白的CD73基因人源化纯合子小鼠(V2)。改造后的人源化小鼠的mRNA序列的编码区和蛋白序列分别为SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:4。

实施例2CD73基因人源化小鼠体内人源化蛋白表达

通过常规检测方法可确认小鼠体内人源化CD73蛋白的表达情况，本实施例中，对实施例1获得的两种CD73基因人源化小鼠，采用流式细胞术进行蛋白表达检测。

选取8周龄野生型C57BL/6小鼠，以及V1版和V2版CD73基因人源化纯合子小鼠各1只，安乐死后取脾脏细胞，分别用抗鼠TCRβ抗体PerCP/Cy5.5 anti-mouse TCRβchainAntibody(mTcRβPerCP)、抗鼠CD19抗体FITC anti-mouse CD19 Antibody(hCD19 FITC)、抗人CD73抗体PE anti-human CD73 Antibody(hCD73 PE)、抗鼠Foxp3抗体PE/CyTM7anti-mouse/rat Foxp3 Antibody(mFoxp3 PE)、抗鼠CD4抗体Brilliant Violet 510

表5流式检测结果

上述结果表明，在C57BL/6小鼠体内检测到鼠CD73蛋白，未检测出人CD73蛋白；在V1版和V2版CD73基因人源化纯合子小鼠体内检测到人CD73蛋白，未检测到鼠CD73蛋白。

进一步对野生型C57BL/6小鼠和V1版CD73人源化纯合子小鼠的脾脏、淋巴结和外周血中的白细胞和T细胞免疫分型情况进行流式检测。脾脏中白细胞亚型和T细胞亚型检测结果分别如图16和图17所示，从图中可以看出，CD73基因人源化纯合子小鼠脾脏样本中B细胞、T细胞、NK细胞、CD4+T细胞、CD8+ T细胞、粒细胞(Granulocyte)、DC细胞、巨噬细胞(Macrophage)和单核细胞(Monocyte)等白细胞亚型与C57BL/6野生型小鼠基本一致(图16)，CD4+ T细胞、CD8+ T细胞和Tregs细胞等T细胞亚型百分比与C57BL/6野生型小鼠一致(图17)。

淋巴结中白细胞亚型和T细胞亚型检测结果分别如图18和图19所示，从图中可以看出，CD73基因人源化纯合子小鼠淋巴结样本中B细胞、T细胞、NK细胞、CD4+T细胞、CD8+ T细胞等白细胞亚型与C57BL/6野生型小鼠一致(图18)，CD4+ T细胞、CD8+ T细胞和Tregs细胞等T细胞亚型百分比与C57BL/6野生型小鼠基本一致(图19)。

外周血中白细胞亚型和T细胞亚型检测结果分别如图20和图21所示，从图中可以看出，CD73基因人源化纯合子小鼠外周血样本中B细胞、T细胞、NK细胞、CD4+T细胞、CD8+ T细胞、、粒细胞(Granulocyte)、DC细胞、巨噬细胞(Macrophage)和单核细胞(Monocyte)等白细胞亚型与C57BL/6野生型小鼠基本一致(图20)，CD4+ T细胞、CD8+ T细胞和Tregs细胞等T细胞亚型百分比与C57BL/6野生型小鼠基本一致(图21)。

上述结果表明CD73基因的人源化改造没有影响小鼠体内白细胞和T细胞的分化、发育和在脾脏、淋巴组织和外周血中的分布。

更进一步分别对野生型C57BL/6小鼠和CD73人源化纯合子小鼠采血，进行血常规和血生化检测，血常规结果如图22所示，CD73基因人源化纯合子小鼠外周血样本中白细胞计数(WBC)、红细胞计数(RBC)、血红蛋白浓度(HB)、红细胞压积(HCT)、平均红细胞体积(MCV)、平均红细胞血红蛋白含量(MCH)、平均红细胞血红蛋白浓度(MCHC)、红细胞分布宽度(RDW)、血小板计数(PLT)、平均血小板体积(MPV)、中性粒细胞计数(NE)、淋巴细胞计数(LY)和单核细胞计数(MO)结果与C57BL/6野生型小鼠基本一致；血生化检测结果如图23所示，CD73基因人源化纯合子小鼠外周血样本中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、血清总胆固醇(TC)、肌酐(CR)、血糖(GLU)、甘油三脂(TRIG)、尿素(UREA)和血清白蛋白(ALB)结果与C57BL/6野生型小鼠基本一致。上述结果表明CD73基因的人源化改造没有影响血细胞的组成和形态，也没有改变AST和ALT水平及肝脏健康状态。

实施例3双重人源化或多基因人源化小鼠

利用前述制得的CD73基因人源化小鼠还可以制备包含人源化CD73基因的多人源化小鼠模型。如，显微注射及胚胎移植过程使用的受精卵细胞选择来源于其它基因修饰小鼠的受精卵细胞，如，对PD-1人源化小鼠的受精卵细胞进行基因编辑，可以得到PD-1和CD73双基因人源化小鼠模型。也可将CD73人源化小鼠纯合子或杂合子与其它基因修饰纯合或杂合小鼠交配，对其后代进行筛选，根据孟德尔遗传规律，可有一定几率得到CD73人源化小鼠与其它基因修饰的双基因或多基因修饰的杂合小鼠，再将杂合子相互交配可以得到双基因或多基因修饰的纯合子。

以双重人源化CTLA4/CD73小鼠为例，由于小鼠CTLA4与CD73基因分别均位于1号和9号染色体上，选择CTLA4人源化小鼠和CD73人源化小鼠交配，通过阳性子代小鼠的筛选，可得到双重人源化CTLA4/CD73基因小鼠。

实施例4评估药效

利用本方法制得的CD73基因人源化小鼠可以用于评估靶向人CD73的调节剂药效。取CD73人源化小鼠纯合子皮下接种小鼠结肠癌细胞MC38-hCD73(表达人CD73的MC38细胞)，待肿瘤体积生长到约100mm

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

序列表

<110> 百奥赛图（北京）医药科技股份有限公司

<120> CD73基因人源化的非人动物的构建方法及应用

<130> 1

<150> CN202010807504.X

<151> 2020-08-12

<160> 63

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3580

<212> DNA/RNA

<213> 小鼠(Mouse)

<400> 1

agtttagtag aggccccggt ggccggtgct cactgggctc agggccagtc cacccgctca 60

acgcgctcta gccagccatg cgtcccgcgg ccgctaaggt acccaagtgg ctgcttctcg 120

cactgagcgc tctactacca cagtggcccg cagccagtgc ctgggagctc acgatcctgc 180

acacaaacga cgtgcacagc cggctagagc agaccagcga tgactccacc aagtgcctca 240

acgccagcct gtgtgtgggc ggcgtggccc ggctctttac caaggtgcag cagatccgca 300

aggaagaacc caacgtgctg tttttggatg ccggagacca gtaccagggc accatctggt 360

tcaccgttta caaaggcctt gaagtggcac acttcatgaa catcctgggc tacgatgcta 420

tggcactggg aaatcatgaa tttgataacg gtgtggaagg actgattgat cccctcctca 480

gaaacgttaa atttccaatt ctgagcgcaa acattaaggc acgggggcct ctagcacatc 540

agatatctgg actttttctg ccatctaaag ttctctctgt tggcggtgag gttgtgggga 600

ttgttggata tacttcaaag gaaacccctt tcctctcaaa tccagggaca aatttagtct 660

ttgaagatga aatctctgca ttgcagcctg aagtagataa actaaagacg ctaaatgtga 720

ataagatcat cgccctgggg cactctggtt ttgagatgga caaacttatc gctcagaaag 780

ttcgaggtgt ggacatcgtg gtgggaggac actccaacac ctttctctac acaggaaatc 840

caccttccaa agaagtgcct gcggggaagt acccattcat agtcaccgca gatgatggac 900

ggcaggtgcc tgtggtccag gcctatgcct ttggcaaata cctgggctac ctgaaggttg 960

agtttgatga taaaggcaat gttatcactt cctatggaaa tcccattctt ctcaacagca 1020

gcattcctga agatgcgacc atcaaagcag acattaacca atggaggata aaattagata 1080

attattctac ccaggaactc gggagaacga tcgtctacct ggatggctcc actcagacgt 1140

gccgcttcag ggaatgcaac atgggaaacc tgatctgtga tgccatgatt aacaacaacc 1200

tcagacaccc agatgaaatg ttttggaacc acgtgtccat gtgcattgta aacggaggtg 1260

gcatccggtc ccccattgat gagaagaaca atggtaccat cacctgggag aacctggctg 1320

ctgtgctgcc ctttggaggg acatttgacc tcgtccaatt aaaagggtcc accctgaaga 1380

aggcttttga gcacagcgtg catcgctatg gccagtccac cggagagttc ctgcaagtgg 1440

gtggaatcca tgtggtgtac gatattaacc gaaagccctg gaacagagtg gtccaattag 1500

aagttctctg caccaagtgt cgagtgccca tctatgagcc tcttgaaatg gataaagtgt 1560

ataaagtgac cctcccaagc tatctggcca acggtggaga tggattccag atgataaaag 1620

atgaattact aaagcatgac tctggtgatc aagatatcag cgtggtttct gaatacatct 1680

caaaaatgaa agtagtttac ccagccgttg aagggcggat caagttctct gcagcaagtc 1740

attaccaggg aagctttcct ttagtaattc tttcattttg ggcaatgatc cttattttgt 1800

accaataaca gggagtctcc ttgtccttga tgtcaaacta catttttctt ccagtgatat 1860

tcatatctgc ctctggagac ctggctttgt aacagcactc atcatcctca aggttcctag 1920

cagatgttct tcacaaggaa gagactgtaa catcatttgt tggggccagc aactcagtga 1980

gcagatagaa agtcacagtg aaccaacagg gtccttctgg cagggagtgg gtaaggggaa 2040

acaactagat gtagcttgca tagccacata acacatctgg ttaccatttc cctttctatt 2100

catttctaat ccatcaaaca attgatgttt acatacaact tcatcatcgc cagctctggt 2160

ggcacatgcc tgtggtcacg gcacttggca gggaggagag gatggctgca agttctaggc 2220

cagcctgaca tatgtagagt ttcaggccag tcagctagat atcaagactc acacacacaa 2280

acaaacatta taatttacaa gtagattttt gtagacaagt cttatgataa gctaagcaga 2340

aagggtcgac ttgttcaagg tcagacatct ccaaataata catctaagat ctgtacctga 2400

gtctttttac ctcaagtcca acctctcgcc tactgtcaag tctcctctct tcctgcggtt 2460

ggtctcagac aacaaatctg tttctgcctt ccatagtacc ctttcttttg ggctcttgtt 2520

gtctctcagg tttgagagag tagctactgg acaggattct ttcctacaac accatgtgcc 2580

tttggtgagt catagacaaa ctgtatacag cagataatag attagtccag ggactgcaaa 2640

aggcagtcag ggacaggcag gaaagggaaa ggagaatatg accaggactt acagaagaga 2700

gtagatgggt tccataaaca ctagttaagg agcagaacat ggctccaaag cacaacactg 2760

gttcttatta actcctgtgc gactccaaaa gccctgcctc tctccttcct tcttcctcac 2820

atggaggtgc catgagagaa cttcctaaaa taaactgtaa ttctcaacct gcacctgtcc 2880

tgtccaagat gccaacacgg ctctcattca agtcacacat gtacaatcca atattctgga 2940

aggcaagagt gaatttaaga agtggtatac ataaatgttt gaagtcactg agactcaaat 3000

cccacacaac cactgtaagg catactcagg tcaagacatg agaagaccag caggacagtg 3060

agccctatgg gaggcccaag agatacccag actgatgaaa tgatctgtgc ccacagaaca 3120

ccagaccaag acagtcctgt gaccaagtga gcatagtcag cactgtacag tagttaagaa 3180

tccttaacta taaaccagca gctagatgtc tggacaggga acatgttggt ttcctagtgt 3240

ttacgaatat taaggactct tgacccaaac cgtttaaaat tccaatcctt ttatgaagtt 3300

tgttgcagtg aaacaatgcc ttcagttctt tttgaatgtg tagattagtt ataaacagaa 3360

atgtcagtaa gactgtaaaa aaaaatgaag aaaggtgcat atgaggtata tttttatgct 3420

tggcgagtaa ataaggagaa atcttatagc ataattttta aagaacattt gtataatttt 3480

tctaaatatg tgtatatgta tattttatgc agcagtattg agaaatgacc ttggactatc 3540

ttgtaattgt aaattccaaa aataaagctg aagatatagt 3580

<210> 2

<211> 576

<212> PRT

<213> 小鼠(Mouse)

<400> 2

Met Arg Pro Ala Ala Ala Lys Val Pro Lys Trp Leu Leu Leu Ala Leu

1 5 10 15

Ser Ala Leu Leu Pro Gln Trp Pro Ala Ala Ser Ala Trp Glu Leu Thr

20 25 30

Ile Leu His Thr Asn Asp Val His Ser Arg Leu Glu Gln Thr Ser Asp

35 40 45

Asp Ser Thr Lys Cys Leu Asn Ala Ser Leu Cys Val Gly Gly Val Ala

50 55 60

Arg Leu Phe Thr Lys Val Gln Gln Ile Arg Lys Glu Glu Pro Asn Val

65 70 75 80

Leu Phe Leu Asp Ala Gly Asp Gln Tyr Gln Gly Thr Ile Trp Phe Thr

85 90 95

Val Tyr Lys Gly Leu Glu Val Ala His Phe Met Asn Ile Leu Gly Tyr

100 105 110

Asp Ala Met Ala Leu Gly Asn His Glu Phe Asp Asn Gly Val Glu Gly

115 120 125

Leu Ile Asp Pro Leu Leu Arg Asn Val Lys Phe Pro Ile Leu Ser Ala

130 135 140

Asn Ile Lys Ala Arg Gly Pro Leu Ala His Gln Ile Ser Gly Leu Phe

145 150 155 160

Leu Pro Ser Lys Val Leu Ser Val Gly Gly Glu Val Val Gly Ile Val

165 170 175

Gly Tyr Thr Ser Lys Glu Thr Pro Phe Leu Ser Asn Pro Gly Thr Asn

180 185 190

Leu Val Phe Glu Asp Glu Ile Ser Ala Leu Gln Pro Glu Val Asp Lys

195 200 205

Leu Lys Thr Leu Asn Val Asn Lys Ile Ile Ala Leu Gly His Ser Gly

210 215 220

Phe Glu Met Asp Lys Leu Ile Ala Gln Lys Val Arg Gly Val Asp Ile

225 230 235 240

Val Val Gly Gly His Ser Asn Thr Phe Leu Tyr Thr Gly Asn Pro Pro

245 250 255

Ser Lys Glu Val Pro Ala Gly Lys Tyr Pro Phe Ile Val Thr Ala Asp

260 265 270

Asp Gly Arg Gln Val Pro Val Val Gln Ala Tyr Ala Phe Gly Lys Tyr

275 280 285

Leu Gly Tyr Leu Lys Val Glu Phe Asp Asp Lys Gly Asn Val Ile Thr

290 295 300

Ser Tyr Gly Asn Pro Ile Leu Leu Asn Ser Ser Ile Pro Glu Asp Ala

305 310 315 320

Thr Ile Lys Ala Asp Ile Asn Gln Trp Arg Ile Lys Leu Asp Asn Tyr

325 330 335

Ser Thr Gln Glu Leu Gly Arg Thr Ile Val Tyr Leu Asp Gly Ser Thr

340 345 350

Gln Thr Cys Arg Phe Arg Glu Cys Asn Met Gly Asn Leu Ile Cys Asp

355 360 365

Ala Met Ile Asn Asn Asn Leu Arg His Pro Asp Glu Met Phe Trp Asn

370 375 380

His Val Ser Met Cys Ile Val Asn Gly Gly Gly Ile Arg Ser Pro Ile

385 390 395 400

Asp Glu Lys Asn Asn Gly Thr Ile Thr Trp Glu Asn Leu Ala Ala Val

405 410 415

Leu Pro Phe Gly Gly Thr Phe Asp Leu Val Gln Leu Lys Gly Ser Thr

420 425 430

Leu Lys Lys Ala Phe Glu His Ser Val His Arg Tyr Gly Gln Ser Thr

435 440 445

Gly Glu Phe Leu Gln Val Gly Gly Ile His Val Val Tyr Asp Ile Asn

450 455 460

Arg Lys Pro Trp Asn Arg Val Val Gln Leu Glu Val Leu Cys Thr Lys

465 470 475 480

Cys Arg Val Pro Ile Tyr Glu Pro Leu Glu Met Asp Lys Val Tyr Lys

485 490 495

Val Thr Leu Pro Ser Tyr Leu Ala Asn Gly Gly Asp Gly Phe Gln Met

500 505 510

Ile Lys Asp Glu Leu Leu Lys His Asp Ser Gly Asp Gln Asp Ile Ser

515 520 525

Val Val Ser Glu Tyr Ile Ser Lys Met Lys Val Val Tyr Pro Ala Val

530 535 540

Glu Gly Arg Ile Lys Phe Ser Ala Ala Ser His Tyr Gln Gly Ser Phe

545 550 555 560

Pro Leu Val Ile Leu Ser Phe Trp Ala Met Ile Leu Ile Leu Tyr Gln

565 570 575

<210> 3

<211> 3562

<212> DNA/RNA

<213> 人(human)

<400> 3

actcgccggc actcgcccgg ctcgcccgct ttcgcaccca gttcacgcgc cacagctatg 60

tgtccccgag ccgcgcgggc gcccgcgacg ctactcctcg ccctgggcgc ggtgctgtgg 120

cctgcggctg gcgcctggga gcttacgatt ttgcacacca acgacgtgca cagccggctg 180

gagcagacca gcgaggactc cagcaagtgc gtcaacgcca gccgctgcat gggtggcgtg 240

gctcggctct tcaccaaggt tcagcagatc cgccgcgccg aacccaacgt gctgctgctg 300

gacgccggcg accagtacca gggcactatc tggttcaccg tgtacaaggg cgccgaggtg 360

gcgcacttca tgaacgccct gcgctacgat gccatggcac tgggaaatca tgaatttgat 420

aatggtgtgg aaggactgat cgagccactc ctcaaagagg ccaaatttcc aattctgagt 480

gcaaacatta aagcaaaggg gccactagca tctcaaatat caggacttta tttgccatat 540

aaagttcttc ctgttggtga tgaagttgtg ggaatcgttg gatacacttc caaagaaacc 600

ccttttctct caaatccagg gacaaattta gtgtttgaag atgaaatcac tgcattacaa 660

cctgaagtag ataagttaaa aactctaaat gtgaacaaaa ttattgcact gggacattcg 720

ggttttgaaa tggataaact catcgctcag aaagtgaggg gtgtggacgt cgtggtggga 780

ggacactcca acacatttct ttacacaggc aatccacctt ccaaagaggt gcctgctggg 840

aagtacccat tcatagtcac ttctgatgat gggcggaagg ttcctgtagt ccaggcctat 900

gcttttggca aatacctagg ctatctgaag atcgagtttg atgaaagagg aaacgtcatc 960

tcttcccatg gaaatcccat tcttctaaac agcagcattc ctgaagatcc aagcataaaa 1020

gcagacatta acaaatggag gataaaattg gataattatt ctacccagga attagggaaa 1080

acaattgtct atctggatgg ctcctctcaa tcatgccgct ttagagaatg caacatgggc 1140

aacctgattt gtgatgcaat gattaacaac aacctgagac acacggatga aatgttctgg 1200

aaccacgtat ccatgtgcat tttaaatgga ggtggtatcc ggtcgcccat tgatgaacgc 1260

aacaatggca caattacctg ggagaacctg gctgctgtat tgccctttgg aggcacattt 1320

gacctagtcc agttaaaagg ttccaccctg aagaaggcct ttgagcatag cgtgcaccgc 1380

tacggccagt ccactggaga gttcctgcag gtgggcggaa tccatgtggt gtatgatctt 1440

tcccgaaaac ctggagacag agtagtcaaa ttagatgttc tttgcaccaa gtgtcgagtg 1500

cccagttatg accctctcaa aatggacgag gtatataagg tgatcctccc aaacttcctg 1560

gccaatggtg gagatgggtt ccagatgata aaagatgaat tattaagaca tgactctggt 1620

gaccaagata tcaacgtggt ttctacatat atctccaaaa tgaaagtaat ttatccagca 1680

gttgaaggtc ggatcaagtt ttccacagga agtcactgcc atggaagctt ttctttaata 1740

tttctttcac tttgggcagt gatctttgtt ttataccaat agccaaaaat tctccttgcc 1800

tttaatgtgt gaaactgcat tttttcaagt gagattcaaa tctgcctttt aggacctggc 1860

tttgtgacag caaaaaccat ctttacaggc tcctagaagc tgaaggttag agcattataa 1920

aatgaagaga cagacatgat tactcagggt cagcaaccta gtgagttaga aaaaaaatta 1980

acatagggcc ctataaggag aaagccaact atgttaagtt tacgtgtcca aattttaatg 2040

aaattttact aacaatttta aaccatattt ttcttcttca tatccatttc taatccatca 2100

aacagcttat gtttacataa aattttatca ttcacaagga agttttaagc acactgtctc 2160

atttgatatc cacaacttat ttttggtagg aaagagagat gtttttccca cctgtcagat 2220

gaaaaaactg aagctcaaaa agggttgact tgaccataca gctaatgctg acagatccaa 2280

gacctagacc taggtctttt gaactcaagt ccagcattct caactatatc aagttactgt 2340

tcagaatact taatatctcc tctcttcata attatcaata gccccaagct catggatgac 2400

aaatctctgc tttatttctt gtctctattt tttcacttta tagctcctgt tataatagca 2460

agtttaatgg tataaacaca ggataccatc ctctcttgca acacccatgt gcctttgatg 2520

agtcaggtag caagctgtag tagataatga gaaaggccag aggctgcaaa agacagtcaa 2580

aggacacgag agaaaggaag gggaagaaca ggactccagg actgttttat attatagaaa 2640

agcaagagct aaagagcatt tacacatgtt aaacagatac ttgttaagca tagtgcctga 2700

cacacggcat tagctgttat tttatgagat tccatcagct ctgcctctgt cctctttctt 2760

ctaacatgaa ggtatcatga gaagagaacc ttctaacata agctgtaatt ctaaacctgc 2820

acttgtccct ctccagcaag aggctagcac tgaattcatt ctactcatac tacacaccca 2880

gttatggaat gtccagagtt ctcgaagaaa ataaatgact ttaggaagag gtatacattt 2940

tttaagtcgc tctgcctcca aatctgaaca gtcactgtaa atcattctta agcccagata 3000

tgagaacttc tgctggaaag tgggaccctc tgagtgggtg gtcagaaaat acccatgctg 3060

atgaaatgac ctatgcccaa agaacaaata cttaacgtgg gagtggaacc acatgagcct 3120

gctcagctct gcataagtaa ttcaagaaat gggaggcttc accttaaaaa cagtgtgcaa 3180

atggcagcta gaggttttga taggaagtat gtttgtttct tagtgtttac aaatattaag 3240

tactcttgat acaaaatata cttttaaact tcataacctt tttataaaag ttgttgcagc 3300

aaaataatag cctcggttct atgcatatat ggattagcta taaaaaatgt caataagatt 3360

gtacaaggaa aattagagaa agtcacattt agggtttatt ttttacactt ggccagtaaa 3420

atagggtaaa tcctattaga attttttaaa gaactttttt taagtttcct aaatctgtgt 3480

gtgtattgtg aagtggtata agaaatgact ttgaaccact ttgcaattgt agattcccaa 3540

caataaaatt gaagataagc tc 3562

<210> 4

<211> 574

<212> PRT

<213> 人(human)

<400> 4

Met Cys Pro Arg Ala Ala Arg Ala Pro Ala Thr Leu Leu Leu Ala Leu

1 5 10 15

Gly Ala Val Leu Trp Pro Ala Ala Gly Ala Trp Glu Leu Thr Ile Leu

20 25 30

His Thr Asn Asp Val His Ser Arg Leu Glu Gln Thr Ser Glu Asp Ser

35 40 45

Ser Lys Cys Val Asn Ala Ser Arg Cys Met Gly Gly Val Ala Arg Leu

50 55 60

Phe Thr Lys Val Gln Gln Ile Arg Arg Ala Glu Pro Asn Val Leu Leu

65 70 75 80

Leu Asp Ala Gly Asp Gln Tyr Gln Gly Thr Ile Trp Phe Thr Val Tyr

85 90 95

Lys Gly Ala Glu Val Ala His Phe Met Asn Ala Leu Arg Tyr Asp Ala

100 105 110

Met Ala Leu Gly Asn His Glu Phe Asp Asn Gly Val Glu Gly Leu Ile

115 120 125

Glu Pro Leu Leu Lys Glu Ala Lys Phe Pro Ile Leu Ser Ala Asn Ile

130 135 140

Lys Ala Lys Gly Pro Leu Ala Ser Gln Ile Ser Gly Leu Tyr Leu Pro

145 150 155 160

Tyr Lys Val Leu Pro Val Gly Asp Glu Val Val Gly Ile Val Gly Tyr

165 170 175

Thr Ser Lys Glu Thr Pro Phe Leu Ser Asn Pro Gly Thr Asn Leu Val

180 185 190

Phe Glu Asp Glu Ile Thr Ala Leu Gln Pro Glu Val Asp Lys Leu Lys

195 200 205

Thr Leu Asn Val Asn Lys Ile Ile Ala Leu Gly His Ser Gly Phe Glu

210 215 220

Met Asp Lys Leu Ile Ala Gln Lys Val Arg Gly Val Asp Val Val Val

225 230 235 240

Gly Gly His Ser Asn Thr Phe Leu Tyr Thr Gly Asn Pro Pro Ser Lys

245 250 255

Glu Val Pro Ala Gly Lys Tyr Pro Phe Ile Val Thr Ser Asp Asp Gly

260 265 270

Arg Lys Val Pro Val Val Gln Ala Tyr Ala Phe Gly Lys Tyr Leu Gly

275 280 285

Tyr Leu Lys Ile Glu Phe Asp Glu Arg Gly Asn Val Ile Ser Ser His

290 295 300

Gly Asn Pro Ile Leu Leu Asn Ser Ser Ile Pro Glu Asp Pro Ser Ile

305 310 315 320

Lys Ala Asp Ile Asn Lys Trp Arg Ile Lys Leu Asp Asn Tyr Ser Thr

325 330 335

Gln Glu Leu Gly Lys Thr Ile Val Tyr Leu Asp Gly Ser Ser Gln Ser

340 345 350

Cys Arg Phe Arg Glu Cys Asn Met Gly Asn Leu Ile Cys Asp Ala Met

355 360 365

Ile Asn Asn Asn Leu Arg His Thr Asp Glu Met Phe Trp Asn His Val

370 375 380

Ser Met Cys Ile Leu Asn Gly Gly Gly Ile Arg Ser Pro Ile Asp Glu

385 390 395 400

Arg Asn Asn Gly Thr Ile Thr Trp Glu Asn Leu Ala Ala Val Leu Pro

405 410 415

Phe Gly Gly Thr Phe Asp Leu Val Gln Leu Lys Gly Ser Thr Leu Lys

420 425 430

Lys Ala Phe Glu His Ser Val His Arg Tyr Gly Gln Ser Thr Gly Glu

435 440 445

Phe Leu Gln Val Gly Gly Ile His Val Val Tyr Asp Leu Ser Arg Lys

450 455 460

Pro Gly Asp Arg Val Val Lys Leu Asp Val Leu Cys Thr Lys Cys Arg

465 470 475 480

Val Pro Ser Tyr Asp Pro Leu Lys Met Asp Glu Val Tyr Lys Val Ile

485 490 495

Leu Pro Asn Phe Leu Ala Asn Gly Gly Asp Gly Phe Gln Met Ile Lys

500 505 510

Asp Glu Leu Leu Arg His Asp Ser Gly Asp Gln Asp Ile Asn Val Val

515 520 525

Ser Thr Tyr Ile Ser Lys Met Lys Val Ile Tyr Pro Ala Val Glu Gly

530 535 540

Arg Ile Lys Phe Ser Thr Gly Ser His Cys His Gly Ser Phe Ser Leu

545 550 555 560

Ile Phe Leu Ser Leu Trp Ala Val Ile Phe Val Leu Tyr Gln

565 570

<210> 5

<211> 1770

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cagatgagga aagtgaagga gactgaggtt gcactgataa cctcagtgga tttaggtacc 60

gaggaagtaa aatgacctta gcagccaaac caagtgggcg actgcccaga gctggggtta 120

tgcaggaggc cgcacgagga agggacagac agggctttct gaagaaatct gctgtgactc 180

tgagggtggg aatatcatac agatggtact caacgccacc cctgctctac ctgaagtcct 240

gtgcacagag taaatccaga acctgctgag gtatcttgtt cacctcacca gcaagtcctt 300

ccttagtcta agctgctgtg gatggggctg tctgagagct tccttttaaa gtcttcgact 360

tggagaacga caaaagaatt ctaggacaag gcaggtgtac agtgtacact ttacaagtgt 420

aaagcagggc tgtagtagat tagtttatga ggaagaaagt tccattaaaa tgtaagcatg 480

ggagagaaca agtgcttagg aggagggtac acactcttgg gttcgggctg ctcaaaataa 540

gagatgtcct tgtcattgca acagccacac atactggttt tggtggcttc tgaagctgca 600

gctccaaagg tagctaagga aacttttccc ttttttggta aatgagatca tagggtggtt 660

cttatgtgca ctggctagga ttacagctgg cacggtaaaa ctcgagatca caggagctat 720

aggggaacat taagctatct ttactgtaaa caaagtttta gttttagttg ggagacttcc 780

agaaaatacc taggaaagga taaaagcaag ccttaagcac agttcattgc tattttaaca 840

tttctatttg ataacaaaaa ttttcctata taaaaggcct attgtccctc tgtctgcaac 900

cttcacagcc aactttgttc attgggctga aattcttgat tctcagctgg cagaaggctt 960

cctccagacg ccaaagcaag tgacttcttt ctctttccac gtacctgtaa tgttctcatg 1020

gctttctatc ctgctcgggg tacaggggtg atcaatgccc agtctaacag agacttctgt 1080

caggcctgat tcgcctagat gaattggaga agtccttgag tatagcagtt gtgaggactt 1140

gagatgtgac ccaagggaag caatgaaagg gggttctggg ggtgtctgca ttctggtctg 1200

ggcctgacct gtgggctaac tcccgaaaac aatgaagatg agctgggtag gccctggtaa 1260

aggtggtctg tgagccatct ggctggaggg ggctgggaca gggagtccca aatgcacaca 1320

ttcacagcag cttcactgga tgaggcgccc agggcaacaa tgctgtacct acctgtgatc 1380

tacgtgtctc tgggctcagc ccaaggggcc cctttggagg taaggagaac actagaacat 1440

gtatgtggtc aggtgtcata gaggccagcc cattttggtg ccactgggct aacatgatat 1500

actttaaaat atgcttttat tggaaaattc cagatactta attctttttt tttctttttt 1560

cttttctgtt ttacttaggc actgggaaat catgaatttg ataacggtgt ggaaggactg 1620

attgatcccc tcctcagaaa cgttaaattt ccaattctga gcgcaaacat taaggcacgg 1680

gggcctctag cacatcagat atctggactt tttctgccat ctaaagttct ctctgttggc 1740

ggtgaggttg tggggattgt tggatatact 1770

<210> 6

<211> 1133

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cacgaatggt cgatggctgt gtctccctta gtctgctgtt tggagaaact ctttttacac 60

tgggctttgc agacttccct cttgaaacct ctttatgaga cttttgcatt tgggacactt 120

tcattttagt gccggttctt agaaactaac ctgagagcat ctaggtcaac tggaggactg 180

ccttgcaata gagtgctggg tgagacttca ggacgccatg tcggtggtcc cctcgtgacc 240

actgaagact tgctaagttt gggctccagg cttggaggcc ttgtttatgt ctcagcatag 300

gattcccagg gcctatgcta cccagagccc aaggcactca ttattagcac tgggtgagct 360

ccatgaggtt cgcgaccctt cctagggcag gccatgttta gatgaggcct ctatgatgca 420

atgcagcaat cagttctact ccaatggtgc cacaccctgc ctgcaagtaa gcagttgtca 480

tctaccatgc taaaattagt ttccaagggc cagcaagatg gctctggggt aatgaagggg 540

actttccacc tcacctgata cctggagttc aaaccctgga acctacatgg taggaggaga 600

gatctgaaat ccctaagtat aaataaataa aaaaaacaaa taaataaaat gtaaaaacct 660

ccttttgaaa ttggctttca aaacctacat gttgacattt taggtctgaa gacattttag 720

gtttccaggc aaagcaatga cactggcagc cgttgtaaag accatgcctt tgtgctcaga 780

catgtttttc atggttagtg tgaaggccta aatgtaaaag gagctggaaa caaaccatac 840

ctgaagtctc tttgtagtat gagattcagt ttgtgcaaat atatcatcta tggcccagtg 900

agatggttca acagaaaatg atgcttgctg catcgcctga tgtcctgagt ttgatcccca 960

ggacccacat ggtggacaaa gagaaccaat tcttgaaaat tgtcctctga cctccacgca 1020

tgtattgtag tatgtatgtg caaacaaaaa taaatgttac tgtgatggtt tgtacatgct 1080

tggcccaggg aatggcacca ttagaaggtg tgaccttgtt ggagtaggtg tgc 1133

<210> 7

<211> 4354

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cctttagtcc taataataag gtggcagaaa cagttggatc tctgtgttca aggctagcct 60

agtctgcata gagagttcct ggccggctaa ggtgcatagt aagatcctat tacaaaaata 120

aatgaatgag taaataaaag taaactacta ccgtagttgt gctggttagt tcttgccaac 180

ttaacacaaa cgagaatcac ctgagaagag gttcctcacg tgagcaggct ggactgtgcg 240

cacacatgtg ggacattttt ctgactggtg attgatgtga gagagcccag cccactgtag 300

gcggtgtcac ccatgggcag gtgggcctgg gtgacataag acaaacaagg cagtaaacag 360

cactcctctg tgtcctctcc atcagatttt ggtctggggt ttctgccctg actttgctca 420

gtgatacact gtcaactgga agaagcagca aatcctttcc tctccatgtt gtgctgtggt 480

cattgtgttt attacaataa atcaaaaaag agaaaaagac aagaaaacaa agtaaagcag 540

gctatgcttt tgccaagaaa acagccctcc caaaatgcac ttcacccaaa tactgccctc 600

tcccttctgt gtggtaattg cgacaatgcc tccctccttg cgcatggtat ttcagattct 660

aagggatggg gtaatgtgtc atacttttcc ttcctcaacg ctagtgttac caggcacgca 720

tgtggtcgct tcctcaacgg ctgactagct accctgagag ggcagaaaga aggccacagg 780

agtagggaag gcttatgcca gtgcttctgg cttggttgac tcaaattgtc cttctaggaa 840

gaacaatgtc cccagaactg ccattttggg gaaagggagc ctttggatct gacacttgag 900

gccacaggcc cagatgacaa gtctcagaga tagtttttcg ggtctggaaa gctagtggaa 960

aatggacaca tgacaactgt cacacagacc aaaagaaccc cacagatgtt tgaagtttgg 1020

agctgaagat gagggtgact aaagctattt ggtcctctat caagagcatt ggtgtccatg 1080

aacaggaatg ccctccccaa gggatacaaa atcaagatag tcacagcctg tactcaagtc 1140

agggtgggac ggaacaagat attgaagaag caacaaacaa aaacttgaac gttcaccata 1200

ccctaaggat agaacagaac tgatgagttg gttagtcttc cgtggaaaac tgtggatcca 1260

tgtgttgctg ttgtgcacgt ctgttcccag cattctagaa gctaatgcaa gactcagttc 1320

gaggccatcc tgagctacac agtgagaccc tgtctcaaaa aaaccccaaa acaagaaaca 1380

tccaccaaat acaaaactct gtacttaaga ttattacagg gctggagaga tggctcagtg 1440

gttaagagca ctgactgctc ttccagaggt cctgagttca attcccagca accacatggt 1500

ggctcataat catctgtggt gagatctgat gccctcttct ggagtgtctg aagatagcta 1560

caatgtactc ttataaataa aataaaaaaa tcttttttta aaaaattatt atataacaaa 1620

gggtaattta ttttaccata ggaagaaaac ttgatgtttt aagactagaa gaaagaaaaa 1680

caaatgtctg agactgagag accctttaga cctggatcag ctcttagaga agttaactag 1740

ctaggaggag gggagactgg gtatagcatc agaggtgggg aaaggtgtga gttcagcaac 1800

catgaacttt ccaggggaga cagggtggga ctgtggatag ctgcgtgctt cctagagagt 1860

tcactcagcc ctttgagtga caggtgctca gtcagcgcca gtgtgccaaa tgaggaaaca 1920

aggtgaacag gacaaaaagg ccaacataac ttgagagcac tcagtttagc ccggagacag 1980

acaacaaatg accccacaat atagttctgg aatgttctgg tgttacatga ctggtggtca 2040

tgtcccacca aagttttcta ggtttttgtc ttcttattaa aacgttctaa taaaggaact 2100

cagggataat aaaggaacaa caaggaaata gcattcagat ttctccctaa aagttcactt 2160

acgggacagt ttgccctatt caacatgtgc cccaaactag ctcaggccag attgcctccc 2220

taccctcata cctagacata actggagtat gactgaatag aaattgtttg atggttgttc 2280

aggagagaag gaacttaact ccattgtctg gagagagtgg tatgtgcagc tcagggaagg 2340

tggggtccta ggttgtcaag tgcattgttt ggagggtggt gtgtgcacat agtatgtgca 2400

gtaccaggct gccaagtgca gtgttagaag aggtgtatgt gcattgcaca agccaggttc 2460

attactaaac tatttgttgt gcttacttac ctgcctcact gggaagagga aacgaggtgg 2520

aggagaatgt accatggccc ttgttagcat caaggaccta gagccagtgc tgccaggcct 2580

ctctcagatg aggaaagtga aggagactga ggttgcactg ataacctcag tggatttagg 2640

taccgaggaa gtaaaatgac cttagcagcc aaaccaagtg ggcgactgcc cagagctggg 2700

gttatgcagg aggccgcacg aggaagggac agacagggct ttctgaagaa atctgctgtg 2760

actctgaggg tgggaatatc atacagatgg tactcaacgc cacccctgct ctacctgaag 2820

tcctgtgcac agagtaaatc cagaacctgc tgaggtatct tgttcacctc accagcaagt 2880

ccttccttag tctaagctgc tgtggatggg gctgtctgag agcttccttt taaagtcttc 2940

gacttggaga acgacaaaag aattctagga caaggcaggt gtacagtgta cactttacaa 3000

gtgtaaagca gggctgtagt agattagttt atgaggaaga aagttccatt aaaatgtaag 3060

catgggagag aacaagtgct taggaggagg gtacacactc ttgggttcgg gctgctcaaa 3120

ataagagatg tccttgtcat tgcaacagcc acacatactg gttttggtgg cttctgaagc 3180

tgcagctcca aaggtagcta aggaaacttt tccctttttt ggtaaatgag atcatagggt 3240

ggttcttatg tgcactggct aggattacag ctggcacggt aaaactcgag atcacaggag 3300

ctatagggga acattaagct atctttactg taaacaaagt tttagtttta gttgggagac 3360

ttccagaaaa tacctaggaa aggataaaag caagccttaa gcacagttca ttgctatttt 3420

aacatttcta tttgataaca aaaattttcc tatataaaag gcctattgtc cctctgtctg 3480

caaccttcac agccaacttt gttcattggg ctgaaattct tgattctcag ctggcagaag 3540

gcttcctcca gacgccaaag caagtgactt ctttctcttt ccacgtacct gtaatgttct 3600

catggctttc tatcctgctc ggggtacagg ggtgatcaat gcccagtcta acagagactt 3660

ctgtcaggcc tgattcgcct agatgaattg gagaagtcct tgagtatagc agttgtgagg 3720

acttgagatg tgacccaagg gaagcaatga aagggggttc tgggggtgtc tgcattctgg 3780

tctgggcctg acctgtgggc taactcccga aaacaatgaa gatgagctgg gtaggccctg 3840

gtaaaggtgg tctgtgagcc atctggctgg agggggctgg gacagggagt cccaaatgca 3900

cacattcaca gcagcttcac tggatgaggc gcccagggca acaatgctgt acctacctgt 3960

gatctacgtg tctctgggct cagcccaagg ggcccctttg gaggtaagga gaacactaga 4020

acatgtatgt ggtcaggtgt catagaggcc agcccatttt ggtgccactg ggctaacatg 4080

atatacttta aaatatgctt ttattggaaa attccagata cttaattctt tttttttctt 4140

ttttcttttc tgttttactt aggcactggg aaatcatgaa tttgataacg gtgtggaagg 4200

actgattgat cccctcctca gaaacgttaa atttccaatt ctgagcgcaa acattaaggc 4260

acgggggcct ctagcacatc agatatctgg actttttctg ccatctaaag ttctctctgt 4320

tggcggtgag gttgtgggga ttgttggata tact 4354

<210> 8

<211> 4567

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ccagagccca aggcactcat tattagcact gggtgagctc catgaggttc gcgacccttc 60

ctagggcagg ccatgtttag atgaggcctc tatgatgcaa tgcagcaatc agttctactc 120

caatggtgcc acaccctgcc tgcaagtaag cagttgtcat ctaccatgct aaaattagtt 180

tccaagggcc agcaagatgg ctctggggta atgaagggga ctttccacct cacctgatac 240

ctggagttca aaccctggaa cctacatggt aggaggagag atctgaaatc cctaagtata 300

aataaataaa aaaaacaaat aaataaaatg taaaaacctc cttttgaaat tggctttcaa 360

aacctacatg ttgacatttt aggtctgaag acattttagg tttccaggca aagcaatgac 420

actggcagcc gttgtaaaga ccatgccttt gtgctcagac atgtttttca tggttagtgt 480

gaaggcctaa atgtaaaagg agctggaaac aaaccatacc tgaagtctct ttgtagtatg 540

agattcagtt tgtgcaaata tatcatctat ggcccagtga gatggttcaa cagaaaatga 600

tgcttgctgc atcgcctgat gtcctgagtt tgatccccag gacccacatg gtggacaaag 660

agaaccaatt cttgaaaatt gtcctctgac ctccacgcat gtattgtagt atgtatgtgc 720

aaacaaaaat aaatgttact gtgatggttt gtacatgctt ggcccaggga atggcaccat 780

tagaaggtgt gaccttgttg gagtaggtgt gccattgtgg atgtgggttt aagaccctca 840

ccctagctac ctgaaagtca gttttctgct agcagccttc agaagaagat gtagaactct 900

cagctctgcc tgcatcatgc atgcctagat gctgccaagt tcccaccttg atgataatgg 960

cctgaacctc tgaacctctg aacctgtagc cagccctaat taaatgttgt cctttataag 1020

acttgccatg gtcatagtat ctgtgcacag cagtaaaacc ctaagacagt tacatatata 1080

tatatattgg ttatatatgt gtatgtatat atacatatat atatgtatat gtgtatgtat 1140

atatacatat atatatatgt atatgtatat gtatatgtat atgtatatgt atatgtatat 1200

gtatatgtat atgtatatgt atatgtatag tttgtatgta ccatctacag ccttaaccca 1260

atgcaatatt aggtgaatgc aaccaagaac attgatttaa atttttcatg accactcaag 1320

cttttgtaca aaatgtattc atacattttg ctgttagtaa gtgaagagag ctttaacaag 1380

agattgtatt agtgtgttgg tatataaata gtacaatgaa attcttttaa tatccatttc 1440

attaatattc tttagggaca aatttagtct ttgaagatga aatctctgca ttgcagcctg 1500

aagtagataa actaaagacg ctaaatgtga ataagatcat cgccctgggg cactctggtt 1560

ttgagatgga caaacttatc gctcagaaag ttcgaggtgt ggacatcgtg gtgggaggac 1620

actccaacac ctttctctac acaggtaatt gttttgatgc gttctgcaag ctaggatgtt 1680

cattcagtgt gcagtatatg atgtattagc tgtaatatgc aggattatgt gttatacttt 1740

gcattagatg aggacaggta atcctgctgg gagacgttcc aagaattcat tcatgtcatg 1800

attaaaagtc tacactacaa gcacatagca cacataatga aactaaaaaa attattgatc 1860

tccagacaaa ggtcagccaa cggtagaatt tttaaaagat gaaatttttt tttagatatt 1920

ttcagtggtt cttggacctg aatccagacc tttctgtatt ttaaacacct atattcccag 1980

cttttggttt tctaagacag agtttcacta tctagccctg attggcccca ttctcccacc 2040

tctcaggaga atggtaggac tataagcata cacctctgta tctggtttgg aaagtttcat 2100

catcatcatc attttcatag aacttcttag aatttttaaa tgctgaatat atattacatt 2160

tggaatcagg aagtgagata cagtacaaat tatagaaaga aaagaaacac gatattgagt 2220

caaagtcctc attcctaact cacttgaatg accttgaaca ggcaagtcac ctgaccctct 2280

gggcactttg gctttctaat aagaagtctg tcaccgtttt gaagattaag agtctgggaa 2340

cagttgactt cactggtttg gccttgggtg aatgtccccc tggctcttca tcatatcaca 2400

acatgggaga gaatcaggaa gggacatgta cagggagccc aggtgtgtgt ggtggccctc 2460

ctgttacaac cactccctca catagaacta actgtggtct caaaagaact actctcctct 2520

gagggtgcta gctccagtga ccttgtcacc tcacattaga cactccttga aggtttcacc 2580

gtccctcagt gtcaccacag tgaggactaa taagctgcta acacatgaac acacactaga 2640

caaaccacat ccaagacaca acagtttcag gtgagtcttc atacttgcct ggtcttatta 2700

caattctaca gcaatcctgt ggatatgacc tattcaaact ctgggggctt tgtagctctt 2760

ccccaaggga gttttagaag gctacaacac acagcagaaa ccagttgatg ctcctgccac 2820

ttcacccttt atgttggctt gagccacagt tagcatgaca ttttacaaga ggatctaaca 2880

ggtatacgtg tacagacttg tgcactctca gagatatgta taaagtaaac cgaaaatccc 2940

caaagcaccc agactatcct gcttgtattg ttgttgttct tcagtttctt ttcttgttat 3000

tttgtttctt tttaccttga gacaggatct tatattgttt gtttcatttt tatggagaca 3060

gagtctcact ttgctttgta gtcctggctg acaacgttat atgttgactt aaccttgact 3120

gtaaggtccc ccttctactg gtatgacagg aagcactaat gtcacaagaa taccatcaca 3180

cacacacaca cacacacaca cacacacaca gagccacccc ttactccaga tgatgcaatc 3240

acccccccct ttgtcacttt gatgtttctt taccatctgt gccactttgt ggcatcattt 3300

gggcacccac agtctgctgc accgtgtggc tactgattac ggcaccctgc tagcccaaga 3360

agctggaggg aatggtgatt atccttttgc tcttacaact attgccccag ccagcaagtc 3420

ctgcaacatg agagatctga gggtgagctg tagcttgctc atctcctgaa tccagtctct 3480

taaacgctga cccgagtcta agtcatttgt ttcacatttc ataatagatt accaagatta 3540

aacttgctcc catgaaaatg tgttttggct ctcttttgag gactaaatat agcaattaaa 3600

ggacatgata tgaaatgaga cctactcatg tatttaaaca aatttttgcc agccttaaaa 3660

aaaaaatttt ttttcagaca ggctgacaag aaaactcagc agataaaggt acttgctgta 3720

ctagcctaga gacctgagtc tgaacccata taagggcaga aggagagaaa ctaaagccca 3780

aaagttagtt gtcctctgac ctcatgtgta ccacagcata tcctcatatt tattctgtct 3840

ctctctctct cacttactca ctctctctct ctctctcact tactcactct ctctttctct 3900

ctcacataca cacacaaaca cacacacacc acacacactg aaaaaaactt aagcaatctt 3960

ttactaaacc attttatgaa attaccaaga agcaacaaga gagagagaga gagagagaga 4020

gagagagaga gagagagaga gagagagaga gaagaaagga aaggaaagga agaaaagaga 4080

agagaagaga agagaagaga agaaaagaaa agaaaagaaa agaaaagaaa agaaaagaaa 4140

agaaaagaaa agaaattacc aagaagctaa attaagtctg ttaaacatta catagtaaat 4200

gtagtaaaaa gaacacagct tgtggaagca tacatccttt tgtgttttaa gtccagatct 4260

tattgtctga tctggaattt actctgtagc ccaggctaga ctcaaatcat ggcagtcttt 4320

ctatgtaagc ctctgtagag ctgggaatag tggcatgagc catcatgctc agctagaaat 4380

ttaaagttta agaaatgtct cagcatgtga catgcacaca gcccaaagga aaacgtccct 4440

gaagcacctg aatagcacct gatagactct ggtcttttat ttagtctttt gtgtgtatta 4500

ctgcccacta aattagttcc cttcttgtct tgtttgttgt ttatttgtaa cccacattct 4560

aaaaacc 4567

<210> 9

<211> 1725

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

atgtgtcccc gagccgcgcg ggcgcccgcg acgctactcc tcgccctggg cgcggtgctg 60

tggcctgcgg ctggcgcctg ggagcttacg attttgcaca ccaacgacgt gcacagccgg 120

ctggagcaga ccagcgagga ctccagcaag tgcgtcaacg ccagccgctg catgggtggc 180

gtggctcggc tcttcaccaa ggttcagcag atccgccgcg ccgaacccaa cgtgctgctg 240

ctggacgccg gcgaccagta ccagggcact atctggttca ccgtgtacaa gggcgccgag 300

gtggcgcact tcatgaacgc cctgcgctac gatgccatgg cactgggaaa tcatgaattt 360

gataatggtg tggaaggact gatcgagcca ctcctcaaag aggccaaatt tccaattctg 420

agtgcaaaca ttaaagcaaa ggggccacta gcatctcaaa tatcaggact ttatttgcca 480

tataaagttc ttcctgttgg tgatgaagtt gtgggaatcg ttggatacac ttccaaagaa 540

accccttttc tctcaaatcc agggacaaat ttagtgtttg aagatgaaat cactgcatta 600

caacctgaag tagataagtt aaaaactcta aatgtgaaca aaattattgc actgggacat 660

tcgggttttg aaatggataa actcatcgct cagaaagtga ggggtgtgga cgtcgtggtg 720

ggaggacact ccaacacatt tctttacaca ggcaatccac cttccaaaga ggtgcctgct 780

gggaagtacc cattcatagt cacttctgat gatgggcgga aggttcctgt agtccaggcc 840

tatgcttttg gcaaatacct aggctatctg aagatcgagt ttgatgaaag aggaaacgtc 900

atctcttccc atggaaatcc cattcttcta aacagcagca ttcctgaaga tccaagcata 960

aaagcagaca ttaacaaatg gaggataaaa ttggataatt attctaccca ggaattaggg 1020

aaaacaattg tctatctgga tggctcctct caatcatgcc gctttagaga atgcaacatg 1080

ggcaacctga tttgtgatgc aatgattaac aacaacctga gacacacgga tgaaatgttc 1140

tggaaccacg tatccatgtg cattttaaat ggaggtggta tccggtcgcc cattgatgaa 1200

cgcaacaatg gcacaattac ctgggagaac ctggctgctg tattgccctt tggaggcaca 1260

tttgacctag tccagttaaa aggttccacc ctgaagaagg cctttgagca tagcgtgcac 1320

cgctacggcc agtccactgg agagttcctg caggtgggcg gaatccatgt ggtgtatgat 1380

ctttcccgaa aacctggaga cagagtagtc aaattagatg ttctttgcac caagtgtcga 1440

gtgcccagtt atgaccctct caaaatggac gaggtatata aggtgatcct cccaaacttc 1500

ctggccaatg gtggagatgg gttccagatg ataaaagatg aattattaag acatgactct 1560

ggtgaccaag atatcaacgt ggtttctaca tatatctcca aaatgaaagt aatttatcca 1620

gcagttgaag gtcggatcaa gttttccaca ggaagtcact gccatggaag cttttcttta 1680

atatttcttt cactttgggc agtgatcttt gttttatacc aatag 1725

<210> 10

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gctactaact tcagcctgct gaagcaggct ggagacgtgg aggagaaccc tggacct 57

<210> 11

<211> 9

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ggaagcgga 9

<210> 12

<211> 5025

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ggaagcggag ctactaactt cagcctgctg aagcaggctg gagacgtgga ggagaaccct 60

ggacctatgt gtccccgagc cgcgcgggcg cccgcgacgc tactcctcgc cctgggcgcg 120

gtgctgtggc ctgcggctgg cgcctgggag cttacgattt tgcacaccaa cgacgtgcac 180

agccggctgg agcagaccag cgaggactcc agcaagtgcg tcaacgccag ccgctgcatg 240

ggtggcgtgg ctcggctctt caccaaggtt cagcagatcc gccgcgccga acccaacgtg 300

ctgctgctgg acgccggcga ccagtaccag ggcactatct ggttcaccgt gtacaagggc 360

gccgaggtgg cgcacttcat gaacgccctg cgctacgatg ccatggcact gggaaatcat 420

gaatttgata atggtgtgga aggactgatc gagccactcc tcaaagaggc caaatttcca 480

attctgagtg caaacattaa agcaaagggg ccactagcat ctcaaatatc aggactttat 540

ttgccatata aagttcttcc tgttggtgat gaagttgtgg gaatcgttgg atacacttcc 600

aaagaaaccc cttttctctc aaatccaggg acaaatttag tgtttgaaga tgaaatcact 660

gcattacaac ctgaagtaga taagttaaaa actctaaatg tgaacaaaat tattgcactg 720

ggacattcgg gttttgaaat ggataaactc atcgctcaga aagtgagggg tgtggacgtc 780

gtggtgggag gacactccaa cacatttctt tacacaggca atccaccttc caaagaggtg 840

cctgctggga agtacccatt catagtcact tctgatgatg ggcggaaggt tcctgtagtc 900

caggcctatg cttttggcaa atacctaggc tatctgaaga tcgagtttga tgaaagagga 960

aacgtcatct cttcccatgg aaatcccatt cttctaaaca gcagcattcc tgaagatcca 1020

agcataaaag cagacattaa caaatggagg ataaaattgg ataattattc tacccaggaa 1080

ttagggaaaa caattgtcta tctggatggc tcctctcaat catgccgctt tagagaatgc 1140

aacatgggca acctgatttg tgatgcaatg attaacaaca acctgagaca cacggatgaa 1200

atgttctgga accacgtatc catgtgcatt ttaaatggag gtggtatccg gtcgcccatt 1260

gatgaacgca acaatggcac aattacctgg gagaacctgg ctgctgtatt gccctttgga 1320

ggcacatttg acctagtcca gttaaaaggt tccaccctga agaaggcctt tgagcatagc 1380

gtgcaccgct acggccagtc cactggagag ttcctgcagg tgggcggaat ccatgtggtg 1440

tatgatcttt cccgaaaacc tggagacaga gtagtcaaat tagatgttct ttgcaccaag 1500

tgtcgagtgc ccagttatga ccctctcaaa atggacgagg tatataaggt gatcctccca 1560

aacttcctgg ccaatggtgg agatgggttc cagatgataa aagatgaatt attaagacat 1620

gactctggtg accaagatat caacgtggtt tctacatata tctccaaaat gaaagtaatt 1680

tatccagcag ttgaaggtcg gatcaagttt tccacaggaa gtcactgcca tggaagcttt 1740

tctttaatat ttctttcact ttgggcagtg atctttgttt tataccaata gggcgcgccc 1800

agggagtctc cttgtccttg atgtcaaact acatttttct tccagtgata ttcatatctg 1860

cctctggaga cctggctttg taacagcact catcatcctc aaggttccta gcagatgttc 1920

ttcacaagga agagactgta acatcatttg ttggggccag caactcagtg agcagataga 1980

aagtcacagt gaaccaacag ggtccttctg gcagggagtg ggtaagggga aacaactaga 2040

tgtagcttgc atagccacat aacacatctg gttaccattt ccctttctat tcatttctaa 2100

tccatcaaac aattgatgtt tacatacaac ttcatcatcg ccagctctgg tggcacatgc 2160

ctgtggtcac ggcacttggc agggaggaga ggatggctgc aagttctagg ccagcctgac 2220

atatgtagag tttcaggcca gtcagctaga tatcaagact cacacacaca aacaaacatt 2280

ataatttaca agtagatttt tgtagacaag tcttatgata agctaagcag aaagggtcga 2340

cttgttcaag gtcagacatc tccaaataat acatctaaga tctgtacctg agtcttttta 2400

cctcaagtcc aacctctcgc ctactgtcaa gtctcctctc ttcctgcggt tggtctcaga 2460

caacaaatct gtttctgcct tccatagtac cctttctttt gggctcttgt tgtctctcag 2520

gtttgagaga gtagctactg gacaggattc tttcctacaa caccatgtgc ctttggtgag 2580

tcatagacaa actgtataca gcagataata gattagtcca gggactgcaa aaggcagtca 2640

gggacaggca ggaaagggaa aggagaatat gaccaggact tacagaagag agtagatggg 2700

ttccataaac actagttaag gagcagaaca tggctccaaa gcacaacact ggttcttatt 2760

aactcctgtg cgactccaaa agccctgcct ctctccttcc ttcttcctca catggaggtg 2820

ccatgagaga acttcctaaa ataaactgta attctcaacc tgcacctgtc ctgtccaaga 2880

tgccaacacg gctctcattc aagtcacaca tgtacaatcc aatattctgg aaggcaagag 2940

tgaatttaag aagtggtata cataaatgtt tgaagtcact gagactcaaa tcccacacaa 3000

ccactgtaag gcatactcag gtcaagacat gagaagacca gcaggacagt gagccctatg 3060

ggaggcccaa gagataccca gactgatgaa atgatctgtg cccacagaac accagaccaa 3120

gacagtcctg tgaccaagtg agcatagtca gcactgtaca gtagttaaga atccttaact 3180

ataaaccagc agctagatgt ctggacaggg aacatgttgg tttcctagtg tttacgaata 3240

ttaaggactc ttgacccaaa ccgtttaaaa ttccaatcct tttatgaagt ttgttgcagt 3300

gaaacaatgc cttcagttct ttttgaatgt gtagattagt tataaacaga aatgtcagta 3360

agactgtaaa aaaaaatgaa gaaaggtgca tatgaggtat atttttatgc ttggcgagta 3420

aataaggaga aatcttatag cataattttt aaagaacatt tgtataattt ttctaaatat 3480

gtgtatatgt atattttatg cagcagtatt gagaaatgac cttggactat cttgtaattg 3540

taaattccaa aaataaagct gaagatatag tcctttgtct ttggtcttac ttcttctctt 3600

aacacttgta ccctcaggga tgcagcaaag acaatgttca cttcaaaact gagacgaaca 3660

atgctctaga attaagggtt ccggatcctc ggggacacca aatatggcga tctcggcctt 3720

ttcgtttctt ggagctggga catgtttgcc atcgatccat ctaccaccag aacggccgtt 3780

agatctgctg ccaccgttgt ttccaccgaa gaaaccaccg ttgccgtaac caccacgacg 3840

gttgttgcta aagaagctgc caccgccacg gccaccgttg tagccgccgt tgttgttatt 3900

gtagttgctc atgttatttc tggcacttct tggttttcct cttaagtgag gaggaacata 3960

accattctcg ttgttgtcgt tgatgcttaa attttgcact tgttcgctca gttcagccat 4020

aatatgaaat gcttttcttg ttgttcttac ggaataccac ttgccaccta tcaccacaac 4080

taactttttc ccgttcctcc atctctttta tatttttttt ctcgagggat ctttgtgaag 4140

gaaccttact tctgtggtgt gacataattg gacaaactac ctacagagat ttaaagctct 4200

aaggtaaata taaaattttt aagtgtataa tgtgttaaac tactgattct aattgtttgt 4260

gtattttaga ttccaaccta tggaactgat gaatgggagc agtggtggaa tgcctttaat 4320

gaggaaaacc tgttttgctc agaagaaatg ccatctagtg atgatgaggc tactgctgac 4380

tctcaacatt ctactcctcc aaaaaagaag agaaaggtag aagaccccaa ggactttcct 4440

tcagaattgc taagtttttt gagtcatgct gtgtttagta atagaactct tgcttgcttt 4500

gctatttaca ccacaaagga aaaagctgca ctgctataca agaaaattat ggaaaaatat 4560

tctgtaacct ttataagtag gcataacagt tataatcata acatactgtt ttttcttact 4620

ccacacaggc atagagtgtc tgctattaat aactatgctc aaaaattgtg tacctttagc 4680

tttttaattt gtaaaggggt taataaggaa tatttgatgt atagtgcctt gactagagat 4740

cataatcagc cataccacat ttgtagaggt tttacttgct ttaaaaaacc tcccacacct 4800

ccccctgaac ctgaaacata aaatgaatgc aattgttgtt gttaacttgt ttattgcagc 4860

ttataatggt tacaaataaa gcaatagcat cacaaatttc acaaataaag catttttttc 4920

actgcattct agttgtggtt tgtccaaact catcaatgta tcttatcatg tctggatctg 4980

acatggtaag taagcttggg ctgcaggtcg agggacctaa cgcgt 5025

<210> 13

<211> 7174

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13