一种三化汤基准样品冻干粉及其制备方法和质量检测方法

技术领域

本发明属于中药领域，涉及一种中药经典名方三化汤的制备以及一套质量控制方法，具体涉及一种三化汤基准样品冻干粉及其制备方法和质量检测方法。

背景技术

经典名方是中华民族医药宝库中的明珠，是历经时间验证的有效方剂，通过继承、筛选、挖掘、创新，使经典名方的理论得到阐释，进而明确其临床疗效、安全性和经济性，使经典名方的学术价值和临床价值得到进一步彰显和提升。

三化汤始载于《素问病机气宜保命集·中风论第十》，现为国家公布的《古代经典名方目录(第一批)》的第55首，为金元医家刘完素所创，由小承气汤加羌活而成，是开通玄府治疗中风病的经典名方。原文为：中风外有六经之形证，先以加减续命汤，随证治之，内有便溺之阻隔，复以三化汤下之。组成：厚朴、枳实、大黄、羌活各等分。锉如麻豆大，每服三两，水三升，煎至一升半，终日服之，以微利为度。方中，大黄为君，有清热解毒、活血、攻下和泻火等功效；枳实为臣，有破气消积和消痰除痞等功效；厚朴为佐，有主治中风、头痛和寒热等功效；羌活为使，有治疗手足不遂、口眼歪斜等功效。该方剂上能宣通脑之玄府，下能开通肠胃玄府，通过上下相因、升降兼施和内外结合，开通一身上下表里之玄府，使气血调和、津液畅通、神机通达，因此有着较高的临床使用价值。

专利文献CN108956845B公开了一种三化汤冻干粉一板四药材多信息薄层鉴别方法，但是其处方剂量及加水量错误(需要折合古方朝代，非现代)，药材没有进行炮制处理，即药材使用错误，制备方法中完全没有数值，工艺过于粗糙，数据和图片的真实性难以验证。其虽然是一板多测，但药味还是要逐一显色或检测条件不一样，且如其附图所示由于多味药同检使得斑点过多，观察时并不直观、反而易产生干扰。

发明内容

为解决上述现有技术存在的问题，本发明提供了一种三化汤基准样品冻干粉及其制备方法和质量检测方法，所述制备方法能制备得到有效成分含量高的三化汤基准样品冻干粉，所述质量检测方法能准确的检测产品质量，有利于推进经典名方三化汤的现代化研究进程。

本发明通过以下技术方案实现：

1.一种三化汤基准样品冻干粉的制备方法，包括以下步骤：

S1、依次称取酒大黄、姜厚朴、麸炒枳实和去芦羌活25～35g，捣碎，过5目筛而不过10目筛，置煎药锅中，加水1000～2000ml浸泡15～60min；即酒大黄、姜厚朴、麸炒枳实、去芦羌活、水的比例为(25～35)g：(25～35)g：(25～35)g：(25～35)g：(1000～2000)ml。

优选地，饮片均称取31.0g，加水1500ml，浸泡45min。

S2、一煎先使用武火(150℃～180℃)煎煮15～20min，后用文火(80℃～120℃)煎煮85～100min，放冷，滤过；二煎先使用武火(150℃～180℃)煎煮5～10min煮沸，后用文火(80℃～120℃)煎煮15～30min，趁热过滤；合并两次煎液，采用2～4层纱布进行过滤，将滤液于40～70℃条件下进行减压浓缩，以-100～0℃为冻结温度进行喷雾冷冻干燥，即得。

优选地，一煎加水1500ml，武火20min煮沸，文火90min煎煮至750ml，趁热过滤；另加温水600ml，二煎武火10min煮沸，文火20min煎煮至300ml，趁热过滤。优选地，合并两次煎液，采用2层纱布进行过滤，滤液于60℃条件下进行减压浓缩，以-50℃为冻结温度进行喷雾冷冻干燥。

所述方法制备三化汤基准样品冻干粉出膏率为26.553～33.721％，三化汤基准样品冻干粉中厚朴酚及和厚朴酚的总含量为0.656～1.608％。

2.一系列采用薄层色谱法控制三化汤基准样品冻干粉质量的方法，包括以下步骤：

S1、大黄中蒽醌类物质的鉴别

(1)对照品溶液的制备：取芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚对照品，加入甲醇，即得混合对照品溶液；

(2)供试品溶液的制备：称取不同批次的所述三化汤基准样品冻干粉4.0～6.0g，置于250ml具塞锥形瓶中，加入甲醇-盐酸(10：0.3)混合溶液10～50ml，置80℃水浴中加热回流30～60min，冷却过滤，即得供试品溶液；

(3)阴性样品溶液的制备：取除大黄外的三种饮片，按照上述方法制备冻干粉，取适量，置于250ml具塞锥形瓶中，加入甲醇-盐酸(10：0.3)混合溶液，在水浴中加热回流，冷却过滤，即得阴性样品溶液；

(4)薄层鉴别方法：取混合对照品溶液、供试品溶液、阴性样品溶液各5～10μl分别点于薄层板上，加入展开剂，展开，取出，晾干，在365nm紫外灯下试检，后置氨蒸气中熏蒸使斑点清晰，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显示颜色相同的斑点；

作为优选方案，以上所述的大黄中蒽醌类物质的薄层检测方法，步骤(1)中对照品溶液的制备方法为：取对照品芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚，加入甲醇，制成对照品浓度均为1mg/ml的混合对照溶液；

作为优选方案，以上所述的大黄中蒽醌类物质的薄层检测方法，步骤(2)中供试品溶液的制备方法为：取15批次所述的三化汤基准样品冻干粉5.0g，置于250ml具塞锥形瓶中，精密加入甲醇-盐酸(10：0.3)混合溶液30ml，置80℃水浴中加热回流60min，冷却过滤，即得供试品溶液；

作为优选方案，以上所述的大黄中蒽醌类物质的薄层检测方法，步骤(4)中阴性样品溶液的制备方法为：取除大黄外的三种饮片，按所述的三化汤基准样品冻干粉的制备方法制备得冻干粉，取5.0g，置于250ml具塞锥形瓶中，精密加入甲醇-盐酸(10：0.3)混合溶液30ml，置80℃水浴中加热回流60min，冷却过滤，即得阴性样品溶液；

作为优选方案，以上所述的大黄中蒽醌类物质的薄层检测方法，步骤(5)中的薄层条件为：薄层板：羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶H薄层板；点样量：供试品溶液7μl，其余均为10μl；展开剂：石油醚(30～60℃)-甲酸乙酯-甲酸，体积比为(14～16)：(4～6)：(0.5～1)；

作为优选方案，展开剂为石油醚(30～60℃)-甲酸乙酯-甲酸(15：5：1)；

S2、枳实中辛弗林的鉴别

(1)对照品溶液的制备：取辛弗林对照品，加入甲醇，制成20～40μg/ml的溶液，即得对照品溶液；

(2)供试品溶液的制备：称取不同批次所述的三化汤基准样品冻干粉1.0～2.0g，置于250ml具塞锥形瓶中，加入甲醇10～50ml，超声处理10～60min，过滤，即得供试品溶液；

(3)阴性样品溶液的制备：除枳实外的三种饮片，按所述的方法制备得冻干粉，取适量置于250ml具塞锥形瓶中，加入甲醇，超声处理，过滤，即得阴性样品溶液；

(4)薄层鉴别方法：取辛弗林对照品溶液、供试品溶液、阴性样品溶液5～10μl点于薄层板上，加入展开剂，取出，晾干，喷以0.5％茚三酮乙醇溶液，在105℃加热显色；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显示颜色相同的斑点；

作为优选方案，以上所述的枳实中辛弗林的薄层检测方法，步骤(1)中对照品溶液的制备方法为：取辛弗林对照品，加入甲醇，制成30μg/ml的溶液，即得对照品溶液；

作为优选方案，以上所述的枳实中辛弗林的薄层检测方法，步骤(2)中供试品溶液的制备方法为：取15批次所述的三化汤基准样品冻干粉1.5g，置于250ml具塞锥形瓶中，加入甲醇50ml，超声处理45min，过滤，即得供试品溶液；

作为优选方案，以上所述的枳实中辛弗林的薄层检测方法，步骤(3)中阴性样品溶液的制备方法为：取除枳实外的三种饮片，按发明内容1所述的的方法制备得冻干粉，取1.5g，置于250ml具塞锥形瓶中，加入甲醇50ml，超声处理45min，过滤，即得阴性样品溶液；

作为优选方案，以上所述的枳实中辛弗林的薄层检测方法，步骤(4)中的薄层条件为：薄层板：硅胶G薄层板；点样量：7μl；展开剂：展开剂为正丁醇-冰醋酸-水试液溶液，体积比为(4～5)：(1～2)：(4～5)；

作为优选方案，展开剂为正丁醇-冰醋酸-水试液(4：1：5)；

S3、羌活中紫花前胡苷的鉴别

(1)对照品溶液的制备：取紫花前胡苷对照品，加入甲醇，制成0.3～1.0mg/ml的溶液，即得对照品溶液；

(2)供试品溶液的制备：称取不同批次所述的三化汤基准样品冻干粉1.0～2.0g，置于250ml具塞锥形瓶中，加入甲醇10～50ml，超声处理10～60min，过滤，即得供试品溶液；

(3)阴性样品溶液的制备：除羌活外的三种饮片，按所述的方法制备得冻干粉，取适量，置于250ml具塞锥形瓶中，加入甲醇，超声处理，过滤，即得阴性样品溶液；

(4)薄层鉴别方法：取紫花前胡苷对照品溶液、供试品溶液、阴性样品溶液各5～7μl分别点于薄层板上，加入展开剂，展开，取出，晾干，置紫外灯下365nm试检，供试品色谱中，在于对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；

作为优选方案，所述的羌活中紫花前胡苷的检测方法，步骤(1)中对照品溶液的制备方法为：取紫花前胡苷对照品，加入甲醇，制成0.5mg/ml的溶液，即得对照品溶液；

作为优选方案，所述的羌活中紫花前胡苷的检测方法，步骤(2)中供试品溶液的制备方法为：取15批次所述的三化汤基准样品冻干粉1.5g，置于250ml具塞锥形瓶中，加入甲醇50ml，超声处理45min，过滤，即得供试品溶液；

作为优选方案，以上所述的羌活中紫花前胡苷的薄层检测方法，步骤(3)中阴性样品溶液的制备方法为：取除羌活外的三种饮片，按所述的方法制备得冻干粉，取1.5g，置于250ml具塞锥形瓶中，加入甲醇50ml，超声处理45min，过滤，即得阴性样品溶液；

作为优选方案，以上所述的羌活中紫花前胡苷的薄层检测方法，步骤(4)中的薄层条件为：薄层板：硅胶G薄层板置于3％醋酸钠溶液中展开烘干后制得制备的薄层板；点样量：7μl；展开剂：三氯甲烷-甲醇试液，体积比为(6～8)：(1～2)。

作为优选方案，展开剂为三氯甲烷-甲醇试液(8：2)；

S4、厚朴中厚朴酚、和厚朴酚的鉴别

(1)对照品溶液的制备：取厚朴酚、和厚朴酚对照品，加入甲醇，制成含厚朴酚、和厚朴酚各30～35μg/ml的溶液，即得混合对照品溶液；

(2)供试品溶液的制备：称取不同批次所述的三化汤基准样品冻干粉1.5～2.5g，置于250ml具塞锥形瓶中，加入甲醇10～50ml，超声处理10～60min，过滤，即得供试品溶液；

(3)阴性样品溶液的制备：除厚朴外的三种饮片，按所述的方法制备得冻干粉，取适量，置于250ml具塞锥形瓶中，加入甲醇，超声处理，过滤，即得阴性样品溶液；

(4)薄层鉴别方法：取厚朴酚、和厚朴酚混合对照品溶液、供试品溶液、阴性样品溶液各5～10μl分别点于薄层板上，加入展开剂，展开，取出，晾干，喷以1％香草醛硫酸溶液，在100℃加热显色，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显示颜色相同的斑点；

作为优选方案，以上所述的厚朴中厚朴酚、和厚朴酚的检测方法，(1)中对照品溶液的制备方法为：取厚朴酚、和厚朴酚对照品，加入甲醇，制成32μg/ml的溶液，即得混合对照品溶液；

作为优选方案，以上所述的厚朴中厚朴酚、和厚朴酚的检测方法，(2)中供试品溶液的制备方法为：取15批次所述的三化汤基准样品冻干粉2.0g置于250ml具塞锥形瓶中，加入甲醇25ml，超声处理45min，过滤，即得供试品溶液；

作为优选方案，以上所述的厚朴中厚朴酚、和厚朴酚的检测方法，(3)中阴性样品溶液的制备方法为：取除厚朴外的三种饮片，按发明内容1所述的三化汤基准样品冻干粉的制备方法制备，取2.0g，置于250ml具塞锥形瓶中，加入甲醇25ml，超声处理45min，过滤，即得阴性样品溶液；

作为优选方案，以上所述的厚朴中厚朴酚、和厚朴酚的检测方法，(4)中的薄层条件为：薄层板：硅胶G薄层板；点样量：对照品溶液5μl，其余均为8μl；展开剂：甲苯-甲醇试液，体积比为(16～17)：(1～2)；

作为优选方案，展开剂为甲苯-甲醇试液(17：2)；

S5、大黄中土大黄苷的检查

(1)对照品溶液的制备：取土大黄苷对照品适量，加入甲醇，制成8～15μg/ml的溶液，得土大黄苷对照品溶液；

(2)供试品溶液的制备：称取不同批次所述的三化汤基准样品冻干粉1.5～2.5g，置于250ml具塞锥形瓶中，加入甲醇10～50ml，超声处理10～60min，过滤，即得供试品溶液；

(3)薄层鉴别方法：取土大黄苷对照品溶液、供试品溶液各4～5μl分别点于薄层板上，加入展开剂，展开，取出，晾干，置365nm紫外灯下试检，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，若检出相同的亮蓝色荧光斑点则认为质量不符合要求，若没有检出相同的亮蓝色荧光斑点，则质量符合要求；

作为优选方案，以上所述的大黄中土大黄苷的检查方法，步骤(1)中对照品溶液的制备方法为：取土大黄苷对照品，加入甲醇，制成10μg/ml的溶液，得对照品溶液；

作为优选方案，以上所述的大黄中土大黄苷的检查方法，步骤(2)中供试品溶液的制备方法为：取15批次所述的三化汤基准样品冻干粉2.0g，置于250ml具塞锥形瓶中，加入甲醇25ml，超声处理45min，过滤，即得供试品溶液；

作为优选方案，以上所述的大黄中土大黄苷的检查方法，步骤(3)中的薄层条件为：薄层板：聚酰胺薄膜薄层板；点样量：5μl；展开剂：甲苯-甲酸乙酯-丙酮-甲醇-甲酸试液，体积比为(25～30)：(4～5)：(4～5)：(20～25)：(0.1～0.2)；

作为优选方案，展开剂为甲苯-甲酸乙酯-丙酮-甲醇-甲酸试液(30：5：5：20：0.1)。

3.采用高效液相色谱法测定所述三化汤基准样品冻干粉厚朴中厚朴酚、和厚朴酚的含量，包括以下步骤：

S1、对照品溶液的制备：取厚朴酚、和厚朴酚对照品，加入甲醇，制成55～65μg/ml的溶液，即得对照品溶液；

S2、供试品溶液的制备：取三化汤基准样品冻干粉1.5～2.0g，置于250ml具塞锥形瓶中，加入甲醇10～50ml，超声处理10～60min，过滤，即得供试品溶液；

S3、阴性样品溶液的制备：取除厚朴外的三种饮片，按上述的制备方法制备冻干粉，取适量，置于250ml具塞锥形瓶中，加入甲醇，超声处理，过滤，即得供试品溶液；

S4、测定法：分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性样品溶液各10μl注入液相色谱仪，记录色谱图；

S5、根据S1中获得的三化汤基准样品冻干粉与单一对照品进行比对，指认出和厚朴酚的保留时间为7.474min、厚朴酚的保留时间为9.581min。

S6、在S4中的液相条件为：进样量：5～15μl；色谱柱：Extend-C18；流动相：甲醇-水(78：22)，等度洗脱，流速为0.5～1.0ml/min；检测波长：260～310nm。

作为优选方案，所述三化汤基准样品冻干粉厚朴中厚朴酚、和厚朴酚的含量检测方法，S1中对照品溶液的制备方法为：取厚朴酚、和厚朴酚对照品，加入甲醇分别制成60.294μg/ml、60.176μg/ml的溶液，即得对照品溶液；

作为优选方案，所述三化汤基准样品冻干粉厚朴中厚朴酚、和厚朴酚的含量检测方法，S2中供试品溶液的制备方法为：取2.0g三化汤基准样品冻干粉，置于250ml具塞锥形瓶中，加入甲醇25ml，超声处理45min，过滤，即得供试品溶液；

作为优选方案，所述三化汤基准样品冻干粉厚朴中厚朴酚、和厚朴酚的含量检测方法，S3中阴性样品溶液的制备方法为：取除厚朴外的三种饮片，按所述的方法制备得冻干粉，取2.0g置于250ml具塞锥形瓶中，加入甲醇25ml，超声处理45min，过滤，即得阴性样品溶液；

作为优选方案，所述三化汤基准样品冻干粉厚朴中厚朴酚、和厚朴酚的含量检测方法，S4中液相色谱条件为：进样量：10μl；色谱柱：Extend-C18；流动相：甲醇：水＝78：22，等度洗脱；流速为0.8ml/min；检测波长：294nm。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：

本发明通过实验优化三化汤基准样品冻干粉的制备方法制备冻干粉，包括药材浸泡时间，煎煮时间，煎煮方式，干燥方式等，优选出最佳的制备方法，为经典名方基准样品的现代化工艺参数，方便其后续中试及工业化生产。

本发明通过薄层色谱法和高相液相色谱两种技术手段对三化汤基准样品冻干粉的质量进行检测，采用薄层色谱法对方中所有药材进行鉴别，根据不同药材成分的差异，为其制定单独的TLC检测手段，并增加了土大黄苷的检测，用于大黄药材防伪，相比于现有技术更直观明了且更加清晰。通过高效液相色谱法测定厚朴酚及和厚朴酚的总含量，提供了定量监测手段，三化汤中厚朴作为第二重要的臣药，其含量测定相比于君药大黄来说的优势有：(1)指标成分较统一、便于检出；(2)含量较高，在炮制和煎煮后仍然在四味药材中保持着相对稳定的高含量，利于检出；(3)厚朴作为关键药味，对其检测也有代表性。两种技术手段互为补充，构成一套完整的质量控制方法，检测方法全面、准确，使三化汤基准样品冻干粉的质量能够更为有效的控制，从而更为安全的使用。

进一步的，本发明对薄层色谱法中对照品、供试品制备方法及薄层条件分别进行优化，薄层板展开效果好，分离度好，斑点清晰度高，更准确的对质量进行检测。

附图说明

图1为本发明所述的三化汤基准样品冻干粉的制备工艺流程图。

图2为本发明所述的三化汤基准样品冻干粉样图。

图3为本发明所述的药材粒度考察样图，其中A为厚朴，B为大黄，C为枳实，D为羌活。

图4为本发明所述的药材粒度考察色谱图。

图5为本发明所述的处方剂量考察色谱图。

图6为本发明所述的煎煮方法考察色谱图。

图7为本发明所述的干燥方法考察色谱图。

图8为薄层鉴别大黄中蒽醌类物质供试品溶液的制备优化图，其中斑点1、斑点4是大黄酸标准样品溶液，斑点2、斑点5是方法一(取冻干粉5.0g、加热回流后不蒸干)制备的供试品溶液，斑点3是方法二(取冻干粉1.25g、加热回流后不蒸干)制备的供试品溶液，斑点6是方法三(取冻干粉1.25g、加热回流后蒸干)制备的供试品溶液。

图9为薄层鉴别大黄中蒽醌类物质标准品溶液点样量的优化图，其中A的点样量为4μl，B的点样量为7μl，C的点样量为10μl。

图10为薄层鉴别大黄中蒽醌类物质供试品溶液点样量的优化图，其中A的点样量为3μl，B的点样量为7μl，C的点样量为10μl。

图11为薄层鉴别羌活紫花前胡苷薄层板制备的优化图，其中A为方法一(将3％醋酸钠溶液滴加在薄层板上)，B为方法二(将薄层板置于3％醋酸钠溶液中展开烘干)，C为方法三(将薄层板浸泡在3％醋酸钠溶液中)。

图12为薄层鉴别厚朴中厚朴酚、和厚朴酚展开体系的优化图，其中A为甲苯-甲醇＝17：0.2(1-混标、2供试品)；B为甲苯-甲醇＝17：1(1-混标、2-3不同点样量的供试品)；C为甲苯-甲醇＝17：2(1-混标、2-3不同点样量的供试品)

图13为大黄中蒽醌类物质的薄层色谱鉴别图，其中斑点1是混合标准品溶液(斑点自上而下依次为：大黄酚、大黄素甲醚、大黄素、芦荟大黄素、大黄酸)，斑点2是大黄阴性样品溶液，斑点3～17是15批次的三化汤基准样品冻干粉溶液。

图14为枳实中辛弗林的薄层色谱鉴别图，其中斑点1是辛弗林对照品溶液，斑点2、斑点3是枳实阴性对照品溶液，斑点4～18是15批次三化汤基准样品冻干粉溶液。

图15为羌活中紫花前胡苷的薄层色谱鉴别图，其中斑点1是紫花前胡苷对照品溶液，斑点2是羌活阴性对照品溶液，斑点3～17是15批次三化汤基准样品冻干粉溶液。

图16为厚朴中厚朴酚、和厚朴酚的薄层色谱鉴别图，其中斑点1是厚朴酚、和厚朴酚混合标准品溶液(斑点自上而下依次为：厚朴酚、和厚朴酚)；斑点2是厚朴阴性对照品溶液，斑点3～18是15批次三化汤基准样品冻干粉溶液。

图17为大黄中土大黄苷的薄层色谱检查图，其中斑点1是标准品溶液，斑点2～16是15批次三化汤基准样品冻干粉溶液。

图18为厚朴酚标准溶液高效液相色谱图。

图19为和厚朴酚标准溶液高效液相色谱图。

图20为厚朴药材高效液相色谱图。

图21为厚朴阴性样品溶液高效液相色谱图。

图22为厚朴酚含量测定的标准曲线图。

图23为和厚朴酚含量测定的的标准曲线图。

图24～26为系统适应性试验高效液相色谱图。依次为Extend-C18(250mm×4.6mm，5μm)色谱柱；Hypersil ODS C18(250mm×4.6mm，5μm)色谱柱；Kromasil 100-5-C18(250mm×4.6mm，5μm)色谱柱。

具体实施方式

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明进行描述，这些描述只是进一步解释本发明的特征和优点，并非用于限制本发明的权利要求。

实施例中用到的仪器和试剂如下：

1.仪器

HH-8数显恒水浴锅(金坛市江南仪器厂)、旋转蒸发器EYELA(东京理化器械株式会社)、电热恒温鼓风干燥箱(西安莫吉娜仪器制造有限公司)、煎药锅(潮州市潮安区龙光电器有限公司)、FD5-series(冷冻干燥喷雾冷冻干燥机上海沪誉贸易有限公司)、SD-Basic喷雾干燥机(LabPlant嘉盛科技有限公司)、JCS-600电子天平(凯丰集团有限公司)、JA2603B电子天平(上海天美天平仪器有限公司)、LE204E/02电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)、多功能粉碎机(合肥荣事达小家电有限公司)、紫外线分析仪(南京大卫仪器设备有限公司)、岛津仪器(中国苏州)股份有限公司LC-16(UV)高效液相色谱仪，包括LC-16送液单元，SIL-16自动进样器，SPD-16紫外可见双波长检测器和CTO-16储液盒一体型柱温箱。

2.药品与试剂

辛弗林对照品(批号110727-202110)、紫花前胡苷对照品(批号111821-201604)、异欧前胡素对照品(批号110827-201812)、厚朴酚对照品(批号110729-201915)、和厚朴酚对照品(批号110730-201905)、大黄酸对照品(批号110757-201607)、芦荟大黄素对照品(批号110795-202011)、大黄素对照品(批号110756-201913)、大黄酚对照品(批号110796-201922)、大黄素甲醚对照品(批号110758-201817)，以上对照品均购于中国食品药品检定研究院；甲醇(色谱纯)、水(超纯水)；石油醚、甲酸甲酯、甲酸、三氯甲烷、甲烷、甲苯、丙酮、甲醇，以上试剂均为色谱纯。

实施例1一种三化汤基准样品冻干粉的制备方法的优化，包括以下步骤：

S1、处方剂量考察

本发明比较了2100ml、2300ml、2500ml三种不同加水量，结果发现，随着水量增加，如图5，出膏率也随之增加但总体相差不大，而就出峰情况，来说2100ml加水量时，明显较好；所以选用2100ml为总加水量。

S2、饮片粒度考察

本发明通过10目、5目两种筛子，对饮片粒度进行了饮片粒度为黄豆大小、绿豆大小两种考察，如图3和4，结果出膏率及出峰情况二者不差上下，为减少损耗，因此选择黄豆大小进行煎煮。

S3、浸泡时间考察

本发明通过为确定最佳浸泡时间，以15min为间隔考察了药材的浸泡与吸水情况，结果浸泡为45min，饮片的吸水率基本达到饱和，故选45min为最终浸泡时间。

S4、煎煮方式考察

本发明比较了，一次煎煮、二次煎煮大黄先下、二次煎煮大黄后下三种煎煮方式，如图6，综合出膏、出峰情况，以及传统和现代的煎煮要求，选用二次煎煮大黄先下的煎煮方式。

S5、干燥方式考察

本发明对中药及经典名方中常用的喷雾及喷雾冷冻干燥方式进行了考察，如图7，结果二者的出膏率分别差异较小，且为保证枳实、羌活中含有挥发油及芳香性挥发类物质，最终选用冷冻喷雾干燥，得到三化汤基准样品冻干粉。

在确定最佳三化汤基准样品冻干粉制备工艺如图1后，本发明通过大量实验筛选，得到最佳制备方法，包括以下步骤：

S1、称取酒大黄、姜厚朴、麸炒枳实、去芦羌活各31.0g，捣碎后过5目筛而不过10目筛，置煎药锅中，加水1500ml浸泡45min；

S2、一煎20min煮沸，文火90min煎煮至750ml，趁热过滤，另加温水600ml，二煎武火10min煮沸，文火20min煎煮至300ml，趁热过滤；将两次煎液合并，滤液于60℃条件下进行减压浓缩，以-50℃为冻结温度进行喷雾冷冻干燥。

本发明得到的三化汤基准样品冻干粉样图如图2，出膏率如表1。

表1 15批次三化汤基准样品冻干粉出膏率

实施例2一系列采用薄层色谱法控制三化汤基准样品冻干粉质量的方法优化，包括以下步骤：

S1、大黄中蒽醌类物质检测方法的优化

(1)供试品制备方面的优化

本发明通过对三化汤基准样品冻干粉的不同取样量(1.25g、5.0g)及加热回流后是否蒸干进行实验比较，如图8，结果发现取三化汤基准样品冻干粉5.0g，加热回流后不蒸干，在薄层板上点样效果良好，故选用此种方法制备供试品。

(2)标准品溶液点样量方面的优化

本发明通过对标准品溶液不同的点样量(4μl、7μl、10μl)进行实验比较，如图9，结果发现以10μl为点样量，斑点清晰度最佳，故选用10μl为点样量。

(3)对照品溶液点样量方面的优化

本发明通过对对照品溶液不同的点样量(3μl、7μl、10μl)进行实验比较，如图10，结果发现以7μl为点样量，样品可与标准品在相同高度处显示出5个颜色一致的斑点，故选用7μl为点样量。

S2、羌活中紫花前胡苷检测方法的优化

(1)薄层板制备方面的优化

本发明通过对不同的薄层板制备方法(将3％醋酸钠溶液滴加在薄层板上、将薄层板置于3％醋酸钠溶液中展开烘干、将薄层板浸泡在3％醋酸钠溶液中)进行实验比较，结果如图11，发现将薄层板置于3％醋酸钠溶液中展开烘干制得的薄层板展开效果最佳，斑点清晰，分离度好，故选用此种方法制备薄层板。

S3、厚朴中厚朴酚、和厚朴酚检测方法的优化

(1)展开剂方面的优化

本发明通过对不同的展开剂(甲苯-甲醇(17：1)、甲苯-甲醇(17：0.2)和甲苯-甲醇(17：2))进行实验比较，结果如图12，发现以甲苯-甲醇(17：2)为展开剂时斑点的分离度较好，故选用甲苯-甲醇(17：2)为展开剂。

最终确定最佳的质量检测方法，包括以下步骤：

S1、大黄中蒽醌类物质的鉴别

(1)对照品溶液的制备：取对照品芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚，加入甲醇，制成对照品浓度均为1mg/ml的混合对照溶液；

(2)供试品溶液的制备：取实施例1所述的三化汤基准样品冻干粉5.0g，置于250ml具塞锥形瓶中，精密加入甲醇-盐酸(10：0.3)混合溶液30ml，置80℃水浴中加热回流60min，冷却，过滤，即得供试品溶液；

(3)阴性样品溶液的制备：取除大黄的三种饮片，按实施例1的方法制备得冻干粉，取5.0g置于250ml具塞锥形瓶中，精密加入甲醇-盐酸(10：0.3)混合溶液30ml，置80℃水浴中加热回流60min，冷却，过滤，即得供试品溶液；

(4)薄层鉴别方法：取混合对照品溶液、阴性样品溶液各10μl、供试品溶液7μl分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶H薄层板上，加入展开剂，展开，取出，晾干，置365nm紫外灯下试检，后置氨蒸气中熏蒸使斑点清晰，如图13，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显示颜色相同的斑点；

所述的展开剂为石油醚(30～60℃)-甲酸乙酯-甲酸试液(15：5：1)；

S2、枳实中辛弗林的鉴别

(1)对照品溶液的制备：取辛弗林对照品，加入甲醇，制成0.5mg/ml的溶液，即得辛弗林对照品溶液；

(2)供试品溶液的制备：取实施例1所述的三化汤基准样品冻干粉1.25g置于250ml具塞锥形瓶中，加入甲醇50ml，超声处理45min，过滤，即得供试品溶液；

(3)阴性样品溶液的制备：取除枳实外的三种饮片，按实施例1的方法制备得冻干粉，取1.25g置于250ml具塞锥形瓶中，加入甲醇50ml，超声处理45min，过滤，即得阴性样品溶液；

(4)薄层鉴别方法：取辛弗林对照品溶液、供试品溶液、阴性样品溶液各7μl分别点于同一硅胶G薄层板上，加入展开剂，展开，取出，晾干，喷以0.5％茚三酮乙醇溶液，在105℃加热显色；如图14，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显示颜色相同的斑点；

所述展开剂为正丁醇-冰醋酸-水(4：1：5)；

S3、羌活的紫花前胡苷的鉴别

(1)对照品溶液的制备：取紫花前胡苷对照品，加入甲醇，制成0.5mg/ml的溶液，即得紫花前胡苷对照品溶液；

(2)供试品溶液的制备：取实施例1所述的三化汤基准样品冻干粉1.5g置于250ml具塞锥形瓶中，加入甲醇50ml，超声处理45min，过滤即得供试品溶液；

(3)阴性样品溶液的制备：取除羌活外的三种饮片，按实施例1的方法制备得冻干粉，取1.5g置于250ml具塞锥形瓶中，加入甲醇50ml，超声处理45min，过滤即得阴性样品溶液；

(4)薄层鉴别方法：取紫花前胡苷对照品溶液、供试品溶液、阴性样品溶液各7μl分别点于同一硅胶G薄层板置于3％醋酸钠溶液中展开后烘干制得的薄层板上，加入展开剂展开，取出，晾干，在365nm紫外灯下试检，如图15，供试品色谱中，在于对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；

所述展开剂为三氯甲烷-甲醇试液(8：2)；

S4、厚朴中厚朴酚、和厚朴酚的鉴别

(1)对照品溶液的制备：取厚朴酚、和厚朴酚对照品，加入甲醇，制成含厚朴酚、和厚朴酚各32μg/ml的溶液，得混合对照品溶液；

(2)供试品溶液的制备：取实施例1所述的三化汤基准样品冻干粉2.0g置于250ml具塞锥形瓶中，加入甲醇25ml，超声处理45min，过滤即得供试品溶液；

(3)阴性样品溶液的制备：取除厚朴外的三种饮片，按实施例1的方法制备得冻干粉，取2.0g置于250ml具塞锥形瓶中，加入甲醇25ml，超声处理45min，过滤即得供试品溶液；

(4)薄层鉴别方法：取厚朴酚、和厚朴酚混合对照品溶液、供试品溶液、阴性样品溶液各8μl分别点于同一以硅胶G薄层板上，加入展开剂，展开，取出，晾干，喷1％香草醛硫酸乙醇(10％)溶液，在100℃下加热显色，如图16，供试品色谱中，在于对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；

所述展开剂为甲苯-甲醇试液(17：2)；

S5、大黄中土大黄苷的检查

(1)对照品溶液的制备：取土大黄苷对照品，加入甲醇，制成10μg/ml的溶液，即得土大黄苷对照品溶液；

(2)供试品溶液的制备：取实施例1所述的三化汤基准样品冻干粉2.0g，置于250ml具塞锥形瓶中，加入甲醇25ml，超声处理45min，过滤，即得供试品溶液；

(3)薄层鉴别方法：取土大黄苷对照品溶液、供试品溶液各5μl点于同一聚酰胺薄膜薄层板上，加入展开剂，展开，取出，晾干，置365nm紫外灯下试检，如图17，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，没有检出相同的亮蓝色荧光斑点；

所述展开剂为甲苯-甲酸乙酯-丙酮-甲醇-甲酸试液(30：5：5：20：0.1)。

实施例3采用高效液相色谱法测定所述三化汤基准样品冻干粉厚朴中的厚朴酚及和厚朴酚的总含量，包括以下步骤：

S1、对照品溶液的制备：取厚朴酚、和厚朴酚对照品，加入甲醇分别制成浓度为60.294μg/ml、60.176μg/ml的对照品溶液；

S2、供试品溶液的制备：取实施例1的2.0g三化汤基准样品冻干粉置于250ml具塞锥形瓶中，加入甲醇25ml，超声处理45min，过滤，即得供试品溶液；

S3、阴性样品溶液的制备：取除厚朴外的三种饮片，按实施例1的方法制备得冻干粉，取2.0g置于250ml具塞锥形瓶中，加入甲醇25ml，超声处理45min，过滤，即得阴性样品溶液；

S4、测定法：分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性样品溶液各10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，如图18-21；液相条件为：色谱柱：Extend-C18；流动相：甲醇-水(78：22)，等度洗脱，流速为0.8ml/min；检测波长：294nm。

实施例4厚朴酚、和厚朴酚含量测定方法的方法学考察，包括以下步骤：

S1、线性关系考察

按实施例3中对照品溶液制备方法，分别配制一系列浓度梯度的厚朴酚、和厚朴酚对照品溶液，见表2。按实施例3的色谱条件进样分析，记录峰面积，以峰面积(A)为纵坐标，进样浓度C(μg/ml)为横坐标，绘制标准曲线，如图22和图23，计算回归方程。厚朴酚、和厚朴酚的回归方程分别为：Y＝64776X-269632(R

表2线性关系考察

S2、精密度试验

按实施例3制备厚朴酚、和厚朴酚对照品溶液，参照实施例3色谱条件，平行进样6次，进样量为10μl，分析样品峰面积及保留时间并计算RSD值，结果见表3，结果表明该设备的平行进样精密性良好。

表3精密度试验结果

S3、稳定性试验

取三化汤基准样品冻干粉2.0g按实施例3中的方法制备样品为供试品溶液，参照实施例3的检测方法分析，采用0、2、6、12、18、24h不同时间进样分析，进样量为10μl，以厚朴酚、和厚朴酚为参照峰，分析样品的峰面积及保留时间并计算RSD值，结果见表4，表明三化汤供试品溶液在24h之内的色谱峰几乎没有变化，稳定性好。

表4稳定性试验结果

S4、重复性试验

按实施例3中供试品溶液制备方法，平行制备6批供试品溶液，参照实施例3的色谱条件，以厚朴酚、和厚朴酚为参照峰，分析样品的峰面积及保留时间并计算RSD值，结果见表5，结果表明样品色谱峰重现性好，该方法的重复性良好。

表5重复性试验结果

S5、准确性试验

以厚朴酚的回收率试验为例，精密称定三化汤基准样品冻干粉1.0g，一式6份，分别置于锥形瓶中，精密加入3ml厚朴酚对照品溶液(237.02μg/ml)，参照实施例3的供试品溶液制备方法及色谱条件，以厚朴酚、和厚朴酚为参照峰，分析样品的峰面积及保留时间并计算RSD值，结果见表6，记录厚朴酚色谱峰的峰面积，计算得平均回收率为100.17％，RSD为2.140％，表明该方法回收率良好。

表6厚朴酚回收率试验结果

同法测量和厚朴酚的回收率，平均回收率为100.32％，RSD为2.360％，结果见表7。

表7和厚朴酚回收率试验结果

S6、系统适应性试验

取同一批样品，按实施例3制备供试品溶液，参照实施例3的检测方法，对三种品牌色谱柱Extend-C18(250mm×4.6mm，5μm)、Hypersil ODSC18(250mm×4.6mm，5μm)、Kromasil100-5-C18(250mm×4.6mm，5μm)的适应性进行考察。结果表明在不同的色谱柱中，厚朴酚及和厚朴酚与杂质峰分离较好，测定结果基本一致，适应性良好，厚朴酚、和厚朴酚系统适应性色谱图见图23～25。

S7、含量测定

按实施例3中的供试品溶液制备方法，取15批药材分别制成供试品溶液，参照实施例3的色谱条件，注入高效液相色谱仪进行分析，计算15批冻干粉中厚朴酚及和厚朴酚的含量，含量测定结果见表8。

表8样品含量测定结果

以上实验结果表明，本发明提供的三化汤基准样品冻干粉检测方法，精密度高、稳定性好、重复性好、灵敏度和准确度高，能全面客观评价三化汤基准样品冻干粉的质量，为保证临床疗效具有重要的意义。

以上实施例仅为本发明的示例性实施例，不用于限制本发明，本发明的保护范围由权利要求书限定。本领域技术人员可以在本发明的实质和保护范围内，对本发明做出各种修改或等同替换，这种修改或等同替换也应视为落在本发明的保护范围内。