重组人血清白蛋白-药物偶联物

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体的说，涉及一种基于重组人血清白蛋白与治疗药物的药物偶联物。

背景技术

药物的治疗效果取决于在特定给药浓度和频率下药物在靶点的可利用性，从而使对患者的治疗作用达到最大化并使副作用最小化。蛋白质、多肽类药物因无法耐受消化系统的破坏，口服后基本完全失效或者需要更大的剂量，即便采用注射，由于其分子量小易被肾脏清除或者被蛋白酶水解，导致其在体内的半衰期短，需要频繁给药。传统的小分子化合物药物通常在体内是非特异性分布，这就导致其在靶点的利用度低，给药剂量大，同时由于其分子量小，易被肾脏快速清除，也需要频繁给药。传统的给药方式和给药频率，给患者带来极大的不便与痛苦。

人血清白蛋白(Human Serum Albumin，HSA)是人体血浆中含量最丰富的蛋白质，约占血清总蛋白的50％以上。HSA的血清半衰期大约为19天，由585个氨基酸组成，包含1个游离的34位半胱氨酸(Cys34)和17个二硫键，分子量约为66.5kDa。HSA除了具有维持血浆渗透压的生理功能外，还是体内重要的非专一性运输蛋白，能与体内许多难溶性的小分子有机物和无机离子可逆地结合形成易溶性的复合物，成为这些物质在血液循环中的运输形式。

HSA具有超长的半数期。在生理环境中，HSA是以负离子的形式存在，且每个HSA分子能够带有200个以上的负电荷，使其避免被内皮系统细胞所吞噬，同时由于其能够分散血管内外的能力而在血液中非常稳定。HSA超长的半衰期一方面归功于FcRn受体介导的HSA回收机制(pH依赖型，防止溶酶体途径降解)，另一方面也与其可以避免肾清除有关(HSA的分子量大于肾脏阈值，可以通过肾近曲小管中受体介导的内吞作用而被重吸收，从而避免被肾脏清除)。

HSA具有肿瘤及炎症靶向性。肿瘤或者炎症部位血管渗透增加及淋巴引流不畅，导致药物分子更易于从肿瘤或炎症血管中渗透出来，同时也难以通过淋巴途径重回体循环，从而在肿瘤或者炎症组织蓄积，这种现象被称为高通透性和滞留效应(enhancedpermeability and retention effect，EPR)效应。HSA在血液中的浓度约为45-55mg/ml，而在肿瘤间质的浓度约为14mg/ml，在此浓度差下，HSA通过EPR效应，显现出良好的肿瘤被动靶向性。另外，HSA依赖于淋巴系统从细胞外空间返回循环，使其易于在淋巴引流不良的肿瘤中积聚。此外，肿瘤或者炎症部位细胞的快速代谢和生长需要主动摄取大量的细胞外蛋白(包括HSA)作为氨基酸的来源，这也使得HSA更加趋向于肿瘤或者炎症组织中的分布。MTX-HSA是临床上最早诞生的HSA化学偶联物，系由甲氨蝶呤(methotrexate，MTX)与HSA的赖氨酸残基共价偶联而得。研究数据表明，MTX-HSA相比MTX，由于HSA的引入使得药物的半衰期显著延长，且产生了明显的肿瘤靶向性(Burger AM,2001)。

由于人血清白蛋白体内稳定、安全无毒、低免疫原性、生物可降解及靶向功能等，是理想的药物载体。基于HSA的药物长效化技术主要包括构建HSA融合蛋白、通过共价化学键与HSA偶联、通过非共价键与HSA可逆性结合等。其中HSA融合技术是将HSA与目标蛋白质/多肽药物直接或者通过连接子融合后进行重组表达。FDA批准的首个HSA融合蛋白药物——阿必鲁肽，其为GLP-1类似物(8Gly)串联后和HSA的融合蛋白，半衰期长达5天，每周给药一次即可。HSA融合的优点是从基因水平将白蛋白与目标蛋白质/多肽连接在一起，不需要额外的化学修饰，纯化、制备过程简单，质量控制也相对容易。但是，HSA融合蛋白的体外生物学活性有着不同程度的降低、且存在表达产物不均一、易降解、表达水平低等缺点(ZhaoHL，2008)。

相对融合技术而言，通过化学偶联技术将HSA与药物分子进行偶联则不会对药物分子尤其是蛋白质多肽类药物进行结构上的改变，对药物活性结构域的影响较小。赖氨酸残基(Lys)是建立HSA与药物间分子链接的重要官能团，目前以HSA为载体的药物偶联物大多是在交联剂的作用下通过药物本身或其衍生物与HSA的Lys残基的氨基共价连接。采用该种方法通过酰胺键与HSA结合的小分子药物包括甲氨蝶呤、姜黄素和阿霉素等(Hoogenboezem and Duvall 2018)。这种偶联方法的好处是可以使用多个HSA的Lys。但是由于缺乏选择性，可能会影响HSA与FcRn的结合以及随之而来的HSA的药代动力学问题(Kuhlmann et al.2017)。另外，这种方法可能很难控制每个HSA的修饰数目以及位点。比如，MTX-HSA是临床上应用最早HSA化学偶联物，其最大缺陷在于MTX是不等量地与HSA结合，因为HSA上Lys残基众多，只是反应的平均结合比例为1:1，因此这一偶联物的化学结构并不清楚，其分解速率分解产物也尚不明确(Fiehn et al.2004)。

HSA中的Cys34是另外一个HSA与药物间分子链接的重要官能团，它提供的游离巯基可与马来酰亚胺等具有巯基反应活性的基团特异性偶联，且它们之间的迈克尔加成反应选择性高、快速、条件温和。由于Cys34位于HSA表面且远离其它配体结合位点，因此Cys34偶联的化合物不会干扰HSA与其它配体的结合亲和力和生物活性。鉴于此，Cys34是HSA中理想的药物定点偶联位置。

目前市场上使用的HSA因为来源于血液，存在潜在的被病毒污染的风险，更重要的是，血浆来源的HSA由于其Cys34可能结合有某些重金属离子、谷胱甘肽或者半胱氨酸，导致HSA的巯基游离度低，而重组人血清白蛋白不存在上述问题。结构确证表明，植物源重组人血清白蛋白(OsrHSA)具有与HSA相同的一级及高级结构，非临床及临床研究表明，OsrHSA具有良好的安全性和有效性，可完全替代HSA，缓解目前临床用药紧张的局面，更重要的是，OsrHSA的Cys3 4因不受谷胱甘肽等影响，其游离巯基的含量更高，更有利于偶联物的制备。

发明内容

本发明的目的在于提供一种人血清白蛋白与治疗药物的偶联物。

本发明的另一个目的在于提供制备所述重组人血清白蛋白偶联物的方法。

重组人血清白蛋白具有多个可修饰位点，利用其Cys34的游离巯基，可实现对治疗性药物的定点偶联。治疗性药物通过与重组人血清白蛋白偶联，可显著增加所偶联药物的分子量、降低肾脏清除率，延长体内血清清除半衰期，还可以起到靶向炎症，减少药物毒副作用的作用。

在第一方面，本发明提供了一种人血清白蛋白偶联物，其特征在于所述的偶联物结构如下所示：

重组人血清白蛋白(Cys34)——异端双功能团连接子——药物分子

其中，所述的重组人血清白蛋白的第34位巯基和所述的药物分子分别与所述的异端双功能团连接子共价偶联。

进一步地，所述的重组人血清白蛋白来源于酵母或者水稻胚乳细胞表达，优选来自水稻胚乳细胞表达的重组人血清白蛋白(OsrHSA)。

进一步地，所述的重组人血清白蛋白为高纯度的，临床级别的重组人血清白蛋白。

在本发明的重组人血清白蛋白偶联物中，所述的连接子具有异端双功能团。

优选地，所述的双功能团具有巯基反应活性及氨基、羟基、羧基反应活性基团中的一种，其中巯基反应活性基团与重组人血清白蛋白的第34半胱氨酸共价偶联。氨基、羟基、羰基、羧基活性基团与药物分子共价偶联。

在本发明的重组人血清白蛋白偶联物中，所述的药物分子为不含游离巯基的分子量低于80kDa的蛋白质、多肽或者小分子化合物。

进一步地，所述的药物分子包括但不限于乳铁蛋白、生长激素、胰岛素、特立帕肽、两性霉素B及衍生物等。

在第二方面，提供了制备所述重组人血清白蛋白偶联物的方法，它包括以下操作步骤：

(1)将所述的药物分子与连接子的一端通过共价键进行偶联；然后通过脱盐或者化学分离的方法去除过量的连接子，获得药物-连接子偶联物；

(2)将所述的重组人血清白蛋白和药物-连接子偶联物进行共价偶联；

本发明也涉及所述重组人血清白蛋白偶联物在偶联效率方面相比人血清白蛋白所具有的优势及原因分析。其中所述优势主要体现在重组人血清白蛋白与药物分子偶联效率相比人血清白蛋白提高约50％，这样可大大降低偶联药物的生产成本。进一步分析发现，重组人血清白蛋白中游离巯基的含量约是人血清白蛋白的3倍。

为了直观的展示本发明中所述的重组人血清白蛋白药物偶联物的制备方法及相比人血清白蛋白偶联物的优势，本发明以乳铁蛋白、生长激素、胰岛素、特立帕肽、两性霉素B等具有不同分子量的药物作为模式药物，以6-(马来酰亚胺基)己酸琥珀酰亚胺酯(EMCS)作为代表性连接子，详细描述了重组人血清白蛋白药物偶联物的制备及其与人血清白蛋白偶联效率的比较，结果表明，重组人血清蛋白与药物的偶联效率显著高于血浆来源人血清白蛋白。

附图说明

图1OsrHSA和HSA与OsrhLF偶联产物电泳检测结果(A)及目标产物条带相对灰度值(B)(**表示与HSA相比，p＜0.01)；

图2OsrHSA和HSA与OsrhGH偶联产物电泳检测结果(A)及目标产物条带相对灰度值(B)(**表示与HSA相比，p＜0.01)；

图3OsrHSA和HSA与特立帕肽偶联产物电泳检测结果(A)及目标产物条带相对灰度值(B)(**表示与HSA相比，p＜0.01)；

图4OsrHSA和HSA与两性霉素B偶联产物电泳检测结果(A)及目标产物条带相对灰度值(B)(**表示与HSA相比，p＜0.01)；

图5为OsrHSA-EMCS-OsrhGH药代曲线；

图6为OsrHSA-ECMS-OsrhGH体外细胞学生物活性测定；

图7为OsrHSA-SPDP-Insulin偶联产物纯化层析图谱(A)及电泳检测结果(B)；

图8为糖尿病小鼠皮下注射OsrHSA-SPDP-Insulin血糖变化曲线；

图9相同浓度(50mg/ml，752μmol/L)的OsrHSA和HSA，游离巯基含量测定结果(A)及巯基游离度(游离巯基摩尔浓度/蛋白质的摩尔浓度)(B)(**表示与HSA相比，p＜0.01)；

图10为OsrHSA-EMCS-Insulin高载量3批工艺验证层析图谱及SDS-PAGE检测结果；A，层析图谱。B，SDS-PAGE检测结果(01-03分别表示3个不同批次)；

图11为大鼠葡萄糖耐量试验。A，采血时间示意图；B，不同时间血糖浓度曲线)；

图12为非禁食条件下单次给药大鼠血糖(A)及血药浓度(B)曲线。

具体实施方式

以下通过具体实施例对本发明内容进一步阐明。所提供的实施例仅是对本发明内容的举例说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。

材料来源：

人血清白蛋白(pHSA或HSA)：商购，Grifols，批号A3AFE01332；

水稻种子表达的重组人血清白蛋白(OsrHSA)：根据专利CN100540667C及CN103880947A制备；

重组人乳铁蛋白(OsrhLF，分子量78.6kDa):根据专利WO2020088207A1制备；

重组人生长激素(OsrhGH，分子量22kDa):根据专利CN111057138A制备；

特立帕肽(Teriparatide，分子量4252Da)：商购，信海医药；

重组人胰岛素(Insulin，分子量5.8kDa)：商购，合肥天麦生物科技发展有限公司；

其他材料均为商业购买。

实施例1OsrHSA和pHSA与重组人乳铁蛋白偶联产物的制备

将重组人乳铁蛋白(OsrhLF，分子量78.6kDa)(根据专利WO2020088207A1制备)溶解于磷酸盐缓冲液(PBS)中，然后按照OsrhLF与EMCS分子摩尔比1:5的比例，缓慢滴加EMCS溶液(100mmol/L)，室温下搅拌反应30min，然后加入5倍EMCS摩尔量的Glycine溶液(1mol/L)终止反应。

反应结束后，采用Bestdex G-25M脱盐柱去除过量的EMCS。将脱盐后获得的OsrhLF-EMCS分为2份，按照分子摩尔比1:0.5的比例分别加入OsrHSA注射液(C001202010002，20％)(根据专利CN100540667C及CN103880947A制备)和HSA注射液(Grifols，批号A3AFE01332，20％)，室温下反应1h。取适量反应液，在相同的点样量下，采用4-20％的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析不同来源白蛋白与OsrhLF的偶联效率。从电泳结果看，OsrHSA反应液中的偶联产物(目标产物)的条带灰度明显高于HSA反应液，经Image J灰度扫描计算，OsrHSA反应液中目标产物的含量约是HSA反应液中目标产物含量的1.67倍(图1)。

实施例2OsrHSA和HSA与重组人生长激素偶联产物的制备

将重组人生长激素(OsrhGH，分子量22kDa)(根据专利CN111057138A制备)溶解于磷酸盐缓冲液(PBS)中，然后按照OsrhGH与EMCS分子摩尔比1:5的比例，缓慢滴加EMCS溶液(100mmol/L)，室温下搅拌反应30min，然后加入5倍EMCS摩尔量的Glycine溶液(1mol/L)终止反应。

反应结束后，采用Bestdex G-25M脱盐柱去除过量的EMCS。将脱盐后获得OsrhGH-EMCS分为2份，按照分子摩尔比1:1的比例分别加入OsrHSA注射液和HSA注射液，室温下反应1h。然后在相同点样量的情况下，采用4-20％SDS-PAGE分析不同来源白蛋白与OsrhGH的偶联效率。从电泳结果看，OsrHSA反应液中的偶联产物(目标产物)的条带灰度明显高于HSA反应液，经Image J灰度扫描计算，OsrHSA反应液中目标产物的含量约是HSA反应液中目标产物含量的1.66倍(图2)。

实施例3OsrHSA和HSA与特立帕肽偶联产物的制备

称取22mg特立帕肽(Teriparatide，信海医药，分子量4252Da)加超纯水溶解(4.25mg/ml)。然按照特立帕肽与EMCS摩尔比1：2的比例的加入EMCS储备液(100mmol/L)，室温搅拌反应30min后加入1mol/L Glycine终止反应。

反应结束后，采用Bestdex G-25M脱盐柱去除过量的EMCS。将脱盐后获得的特立帕肽-EMCS分为2份，按照分子摩尔比1:1的比例分别加入OsrHSA注射液和HSA注射液，室温下反应1h。然后在相同点样量的情况下，采用4-20％的SDS-PAGE分析不同来源白蛋白与特立帕肽的偶联效率。从电泳结果看，OsrHSA反应液中的目标产物的含量明显高于HSA反应液，经Image J灰度扫描计算，OsrHSA反应液中目标产物的含量约是HSA反应液中目标产物含量的1.61倍(图3)。

实施例4OsrHSA和HSA与两性霉素B偶联物的制备

在25℃避光下，取100mg两性霉素B(AmB，MW924.09)溶于5ml N,N-二甲基甲酰胺中，然后搅拌下向反应液中分别加入N,N-二异丙基乙胺(37μl，0.216mmol)，羟基苯并三唑(5mg，32.5μmol)和马来酰亚胺基己酰-L-缬氨酸-L-瓜氨酸对氨基苄醇对硝基苯基碳酸脂(Mc-Val-Cit-PABC-PNP，96mg，0.13mmol)，反应液在25℃避光下搅拌5小时。经薄层色谱(TLC，二氯甲烷：甲醇＝5：1)及LC-MC检测，显示两性霉素B转化完全。将反应液浓缩，然后向残渣里加入10ml甲醇，在搅拌的情况下，缓慢向反应瓶中滴入30ml甲基叔丁醚，悬浊液在室温下搅拌10分钟，然后减压抽滤，收集滤饼，干燥后即得黄色固体AmB—Mc-Val-Cit-PAB-PNP(AmB-MVCPP，MW:1117.28)。

将AmB-MVCPP溶解于DMSO(10mmol/L)，分为2份，然后分子摩尔比1:0.2的比例分别加入OsrHSA注射液和HSA注射液，室温下反应过夜。然后在相同点样量的情况下，采用8％的SDS-PAGE分析不同来源白蛋白与AmB的偶联效率。从电泳结果看，OsrHSA反应液中的目标产物的含量明显高于HSA反应液，经Image J灰度扫描计算，OsrHSA反应液中目标产物的含量约是HSA反应液中目标产物含量的1.47倍(图4)。

实施例5OsrHSA-EMCS-OsrhGH在小鼠体内药代动力学研究

为了考察OsrHSA-EMCS-OsrhGH的半衰期是否比OsrhGH显著延长，将实施例2制备所得OsrHSA-EMCS-OsrhGH样品(经Phenyl HP及Nano 50Q纯化，去除未反应的OsrHSA及OsrhGH)，按照5mg/kg(以OsrhGH计)的剂量皮下注射至昆明小鼠，然后在给药后不同时间点，从小鼠眼眶静脉从取血，采用Human Growth Hormone(GH)DuoSet ELISA(DY1067)试剂盒测定血清中OsrhGH含量。根据不同时间点血清中OsrhGH的含量，计算其药代参数。如表1所示，OsrhGH在小鼠体内的半衰期(t1/2)为0.47h，而OsrHSA-EMCS-OsrhGH的半衰期为7.39h，约是OsrhGH的16倍，说明OsrhGH偶联OsrHSA后，其半衰期显著延长。OsrhGH的药峰时间(Tmax)为1h，而OsrHSA-EMCS-OsrhGH的药峰时间为9h，即OsrHSA-EMCS-OsrhGH的作用持续时间显著长于OsrhGH。OsrHSA-EMCS-OsrhGH的药峰浓度(Cmax)约是OsrhGH的2倍，而药时曲线下面积(AUClast)，OsrHSA-OsrhGH约是OsrhGH的12倍。综上，OsrhGH偶联OsrHSA后，其半衰期、药峰时间、药峰浓度及AUClast均显著高于OsrhGH(图5)。

表1OsrHSA-EMCS-OsrhGH药代参数

实施例6OsrHSA-EMCS-OsrhGH体外活性测定

为了验证OsrhGH偶联OsrHSA后所获得的OsrHSA-EMCS-OsrhGH是否具有生物活性，将实施例2所制备的OsrHSA-EMCS-OsrhGH进行体外细胞生物学活性试验。结果如图6所示，OsrHSA-EMCS-OsrhGH可明显促进小鼠淋巴瘤NB2-11细胞生长增殖，细胞数量随OsrHSA-EMCS-OsrhGH浓度升高而逐渐增多；与rhGH标准品相比，OsrHSA-EMCS-OsrhGH具有与rhGH基本一致的细胞生长促进作用，生物学活性接近。

实施例7重组人血清白蛋白—重组人胰岛素偶联物(OsrHSA-SPDP-Insulin)的制备

重组人胰岛素(Insulin)与SPDP偶联

取42ml Insulin溶液(合肥天麦生物科技发展有限公司，0.4mmol/L，偶联液溶解)，然后按照Insulin与SPDP分子摩尔比1:5的比例，缓慢滴加8ml的N-琥珀酰亚胺3-(2-吡啶二硫代)丙酸酯(SPDP)溶液(100mmol/L，DMSO溶解)，室温下搅拌反应1h，然后加入5倍SPDP摩尔量的Glycine溶液终止反应。

Insulin-SPDP与OsrHSA偶联

反应结束后，采用Bestdex G-25M脱盐柱去除过量的SPDP及DMSO。将脱盐后获得Insulin-SPDP按照其与OsrHSA分子摩尔比1:1的比例加入3.88mlOsrHSA溶液(3mmol/L)，充分混匀后，4℃静置反应18h。

OsrHSA-SPDP-Insulin偶联产物的纯化

将上述反应液采用3M的硫酸铵调节电导与平衡液(10mM PB，0.2M硫酸铵，pH6.5)一致，然后用平衡液稀释至约1mg/ml(以OsrHSA计)，以15ml/min的流速上样至装填有176mlPhenyl Bestrose HP层析介质，柱高25cm的层析柱。上样结束后，用平衡液再次平衡层析柱至UV与基线基本一致。采用10mM PB，0.18M硫酸铵，pH6.5的洗杂液进行二聚体的去除，最后采用10mM PB，pH7.2的洗脱液进行目标蛋白的洗脱。将洗脱收集液采用50kDa超滤膜包浓缩换液后即获得OsrHSA-SPDP-Insulin偶联物原液。OsrHSA-SPDP-Insulin偶联产物纯化层析图谱(A)及电泳检测结果(B)如图7。

实施例8OsrHSA-SPDP-Insulin在糖尿病小鼠模型中降血糖效果研究

为了证明OsrHSA-SPDP-Insulin的长效性，选择雄性BSK-DB糖尿病小鼠模型进行研究。根据实施7制备OsrHSA-SPDP-Insulin。小鼠过夜禁食不禁水，每试验组5只小鼠。采用皮下注射的方式单次给药，其中OsrHSA-SPDP-Insulin给药剂量设定为25IU/kg，50IU/kg(假定Insulin偶联OsrHSA后活性保持不变，Insulin活性为28IU/mg)，阳性对照Insulin的给药剂量为10IU/kg，阴性对照组给同等体积的生理盐水。分别在给药前及给药后8h取小鼠尾静脉血并采用Roche血糖仪及试纸条测定血糖。根据不同时间点血糖值(T

实施例9OsrHSA和HSA游离巯基含量测定

为了阐明OsrHSA的偶联效率高于HSA的机制，我们采用DTNB法，以半胱氨酸为标曲测定OsrHSA和HSA中游离巯基的含量。将OsrHSA或者HSA采用反应缓冲液(100mmol/L磷酸钠，1mmol/L EDTA，pH8.0)稀释至50mg/ml(752μmol/L)待测。取5ml反应管，预先加入2.5ml反应缓冲液和50μl的DTNB反应液(4mg/ml)，然后分别加入250μl的半胱氨酸标准溶液(0.25～1.5mmol/L)或待测样品，室温反应15min后采用分光光度计测量其在412nm处的吸光度值，根据半胱氨酸标准溶液的吸光度值绘制标准曲线，然后计算待测样品的巯基含量。根据标曲计算，OsrHSA(752μmol/L)中其游离巯基含量541μmol/L(巯基游离度为72％)，而HSA(752μmol/L)中游离巯基含量为183μmol/L(巯基游离度为24％)。从检测结果可以看出，OsrHSA中游离巯基的含量约是HSA的3倍。

实施例10OsrHSA-EMCS-Insulin高载量制备

称取400mg Insulin干粉(GMP级重组人胰岛素购自东抗生物(货号：GMP-045))，加入约20ml 4mmol/L稀盐酸(pH2.0)充分溶解后，搅拌条件下，采用0.5mol/L NaOH溶液缓慢调节pH至7.2(pH不能超过8.0)，然后补加偶联缓冲液(20mmol/LPB，2mmol/LEDTA，pH7.2)至100ml。然后按照Insulin与EMCS质量比1：0.266(摩尔比1:5)的比例，搅拌条件下，缓慢滴加3.43ml EMCS溶液(31mg/ml)，25℃搅拌反应30min，反应结束后，加入5倍EMCS摩尔量的Glycine终止反应。

采用G-25脱盐柱(柱体积490ml，流速25-40ml/min)去除过量的EMCS。所用缓冲液为偶联缓冲液。

将脱盐后的Insulin-EMCS，采用偶联缓冲液稀释至约1600ml，然后按照Insulin-EMCS：OsrHSA质量比1:22.9(摩尔比1：2)的比例，加入50.9ml的OsrHSA(153mg/ml)(OsrHSA加入后在体系中终浓度为5mg/ml)。25℃反应50min后加入5倍OsrHSA摩尔量的Cys终止反应。

将偶联产物的反应液稀释至约1mg/ml(以OsrHSA计算)，采用Phenyl HP层析柱进行纯化。层析条件如下：层析柱：GCC-50-400；柱高20cm；柱体积(CV)390ml；流速35ml/min。上样体积：约7.8L，20CV；平衡液：10mmol/LPB，0.5M硫酸铵，pH6.5(再平衡体积：3CV，1170ml)；洗脱液：10mmol/LPB，0.025M硫酸铵，pH7.2(收集至UV30mAu)；CIP：H

验证结果显示，层析图谱及电泳检测结果一致性良好；3批验证收率(表1)及纯度一致(表2、表3及图10)。

表2高载量3批工艺验证层析收率

表3OsrHSA-EMCS-Insulin三批原液SEC-HPLC检测结果汇总

实施例11葡萄糖耐量试验(IPGTT)

对OsrHSA-EMCS-Insulin(根据实施例10制备)进行大鼠葡萄糖耐量实验(IPGTT)。实验分为3组，对照组和实验组，每组6只SD大鼠。实验组按照125nmol/kg剂量一次皮下注射给药，对照组给同体积安慰剂生理盐水。糖耐量实验前16h，禁食不禁水。采用大鼠眼眶静脉丛取血，取血时间点分别为-0.5h,0h,0.5h,1h,2h,4h,6h；其中-0.5h为给药前空腹血糖浓度，0h为给药0.5h后，腹腔注射20g/kg葡萄糖前的血糖浓度，在葡萄注射后的0.5h,1h,2h,4h,6h测定血糖浓度。结果显示(图11)，与Insulin组和阴性对照组相比，OsrHSA-EMCS-Insulin药效可以持续到45-49h，提示OsrHSA-EMCS-Insulin具有较长的药效；在5轮IPGTT后，OsrHSA-EMCS-Insulin血糖浓度与对照组基本一致，说明OsrHSA-EMCS-Insulin在大鼠体内的作用时间约为24h。

实施例12OsrHSA-EMCS-Insulin在SD大鼠中药效及药代动力学研究。

为了证明OsrHSA-EMCS-Insulin的长效性及有效性，选择SD大鼠为研究对象进行测试。具体操作如下：将7周龄体重200g-250g的SD雄性大鼠随机分组，在非禁食的条件下，单次皮下注射不同剂量的OsrHSA-EMCS-Insulin(按照实施例10制备)及同等体积的生理盐水(阴性对照)，然后在给药后4h、8h、24h、32h及48h分别从大鼠眼眶静脉丛取血，37℃处理30min，然后4000rpm离心15min，取上清置于-80℃保存。采用血糖测定试纸条(Roche)及Insulin ELISA试剂盒(R&D，DY8056-05)进行血糖及胰岛素含量测定。结果如图12所示，OsrHSA-EMCS-Insulin呈现明显的剂量效应，给药剂量越大，降糖效果越佳，持续时间越久；最高剂量1000nmol/kg下，SD大鼠体内降糖药效可维持32-48h。血药(Insulin)浓度测定结果显示，血液中Insulin浓度在0-32h内与给药剂量成正相关，48h后，三组血液中Insulin含量趋于本底水平；血液中Insulin含量变化与血糖浓度变化趋势基本保持一致。

本发明通过上述实施例来说明重组人血清白蛋白在基于游离巯基偶联中相比人血清白蛋白的巨大优势及相关治疗性药物偶联物的制备方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细制备方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明中OsrHSA所偶联药物的替换等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。