提高雪莲绿原酸含量的SiHQT基因及其编码产物和应用

技术领域

本发明属于药用植物基因工程技术领域，具体地涉及一种提高雪莲绿原酸含量SiHQT基因及其编码产物和应用。

背景技术

天山雪莲(Saussurea involucrata)为菊科凤毛菊属多年生高山植物，是珍稀濒危的中草药资源，性温、微苦，具有温肾助阳、祛风胜湿、通经活血等功效，主要用于风寒湿痹痛、类风湿性关节炎及小腹冷痛、月经不调。天山雪莲主要分布在新疆境内的天山，阿勒泰和昆山等山脉。天山雪莲中主要的活性成分为黄酮类、木脂素类、酚酸类和半萜类化合物等，主要包括芦丁(rutin)、异槲皮素(isoquercetin)、高植物凝集素(homoplantaginin)、木犀草素(luteolin)、芹菜素(apigenin)、高车前素(hispidulin)和棕矢车菊素(jaceosidin)等黄酮类物质，异东莨菪醇(scopoline)、绿原酸(Chlorogenic acid，CGA)、紫丁香甙(syringin)、二咖啡酰奎尼酸(dicaffeoylqunic acid)等酚酸类物质，以及一些半萜类物质。

绿原酸是由奎尼酸和咖啡酸羧合生成的酚类化合物，广泛存在于金银花、杜仲、烟草等植物中。绿原酸被认为是一种抗氧化剂，具有抗病毒、抗菌、降低体脂、调节血糖、抗肿瘤等功能。奎尼酸羟基肉桂酰转移酶(Hydroxycinnamoyl CoA quinate hydroxycinnamoyltransferas，HQT)是植物中绿原酸合成关键酶。HQT的主要功能是催化咖啡酰CoA/香豆酰CoA和奎尼酸缩合生成绿原酸和香豆酰奎尼酸。绿原酸一方面可以进一步合成二绿原酸、三绿原酸，另一方面绿原酸作为一种苯丙素类化合物，在苯丙烷类衍生物支路中具有重要意义，绿原酸合成的调节将会对其他苯丙素类化合物的合成产生重要影响。因此SiHQT基因的克隆将会对天山雪莲药效的改良具有重要意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于提供天山雪莲SiHQT基因及其编码产物，以及该产物在天山雪莲细胞培养物中药用成分合成中的作用。

本发明是通过如下技术方案来实现的：

一种提高雪莲绿原酸含量SiHQT基因，所述雪莲SiHQT基因为以下核苷酸序列之一：

(1)具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；

(2)SEQ ID NO.1所示核苷酸序列添加、取代、插入或缺失一个或多个碱基的同源序列或者其等位基因及其衍生的核苷酸序列。

本发明还提供了SiHQT基因所编码的蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列为以下序列之一：

(1)具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；

(2)SEQ ID NO.2添加、取代、插入或缺失一个或多个氨基酸的同源蛋白序列。

本发明还提供了一种重组载体，所述重组载体为包含所述基因SiHQT的重组载体pET32a-SiHQT。

本发明还提供SiHQT基因在调控雪莲绿原酸合成及遗传改良方面的应用。

本发明还提供雪莲组织培养物，所述雪莲组织培养物中人工调控SiHQT基因的表达。

本发明还提供雪莲不定根系，所述雪莲不定根系中人工调控SiHQT基因的表达。

本发明还提供雪莲工程植株，所述雪莲工程植株中人工调控SiHQT基因的表达。

本发明与现有技术相比的有益效果：

本发明中获得的SiHQT基因是调控天山雪莲绿原酸合成的关键基因，这对通过基因工程获得高绿原酸的天山雪莲工程细胞系具有重要意义；对SiHQT进行分子调控，能够改良天山雪莲绿原酸类化合物的含量，对提高天山雪莲天然活性成分的含量具有重要意义。SiHQT基因编码的天山雪莲奎尼酸羟基肉桂酰转移酶可以催化香豆酰辅酶A/咖啡酰辅酶A(p-coumaroyl CoA or caffeoyl CoA，pCA-CoA/CA-CoA)和奎尼酸反应生成绿原酸和香豆酰奎尼酸。

附图说明

图1：SiHQT基因全长克隆的琼脂糖凝胶电泳图；

图2：pET32a-SiHQT原核表达蛋白电泳图谱；M、marker，1、纯化蛋白，2、上清液；

图3：SiHQT酶活性检测；A：SiHQT蛋白与咖啡酰CoA反应结果；B：咖啡酰CoA；C：SiHQT蛋白与香豆酰CoA反应结果；D：香豆酰CoA。

具体实施方式

下述实施中所用的材料、试剂、载体和大肠杆菌等，如无特殊说明，均可从公司购买，其中PCR扩增反应所需的酶由TaKaRa公司提供(目录号：DR044A)，PCR产物鉴定所用Marker和蛋白电泳实验所用Marker由全式金生物公司提供(目录号分别为：BM101-01，DM111-02)。

实施例1：天山雪莲cDNA文库构建

首先取天山雪莲植株叶片，用TransZol法(全式金生物公司，目录号：ET101-01)提取叶片RNA，之后利用核酸定量分析仪检测所提取的RNA的总量，最后利用Easy

1.1材料处理

用剪刀剪取适量叶片，用锡箔纸包裹好，放于液氮中速冻，之后存放于-80℃冰箱中。

1.2匀浆

从-80℃冰箱中取出天山雪莲叶片，置于液氮中。清洗好的研钵先用少许酒精燃烧除去不利于RNA的物质，再用液氮预冷，之后将天山雪莲叶片置于研钵中，用研杵不断研磨(该过程研钵中需要一直保持低温，可持续添加液氮)，直至将样品研磨至粉末状。将研磨好的粉末装入已在液氮中充分预冷的2mL离心管中(管中的液氮要去除干净，防止盖子崩开)，取1/5管的样品，加入TransZoL1 mL震荡混匀。

1.2分层

将匀浆好的样品置于冰上5min(使核蛋白物质完全分离)。加入氯仿200μL，剧烈震荡3s，立即置于冰上3min。用提前预冷到4℃的离心机12000rpm，15min。

1.3RNA的沉淀

室温下，取上清液600mL左右(保证质量的前提下尽量吸取)至新的已经提前遇冷的2mL离心管中，加入异丙醇500μL，轻轻的上下颠倒，使管中液体混匀，将混匀的液体置于-20℃冰箱中10min。用预冷到4℃的离心机12000rpm，离心10min，弃上清。

1.4RNA漂洗

向离心管中加入75％的乙醇1mL，涡旋震荡，使其混匀，4℃离心机中1000rpm离心5min。

1.5RNA再溶解

弃上清，用移液枪尽可能地吸干管中乙醇，超净台吹10min。加入RNase-freeddH

1.6RNA检测

使用核酸分析仪检测RNA的含量和纯度。

1.7RNA反转录

反转录反应体系如下：

Total RNA 50ng-5μg

Anchored Oligo(dT)1μL

2×ES reaction Mix10μL

Trans Script RT 1μL

gDNA Remover1μL

RNase-free Waterup to 20μL

先将总RNA，Anchored Oligo(dT)与RNase-free Water混匀，PCR仪设置65℃，5min进行孵育，孵育完成后冰上放置2min，之后加入其它组分，轻轻混匀，将反应的PCR管置于PCR仪中，程序设置：42℃，15min；85℃，5s，启动程序，完成反转录。

实施例2：SiHQT基因的克隆及原核表达载体构建

2.1基因克隆

引物序列如下：

正向引物：5’-ATGRRHAKYRMWMWRAMSAWRWYR-3’

反向引物：5’-TCAAAACTCRTACAAGAACTTTTCR-3’

以获得的天山雪莲cDNA为模板，进行PCR扩增反应。PCR扩增反应体系为20μL：2×Mix 10μL，F和R各1μL，模板2μL，ddH

反应完成后在扩增产物中加入6×loading buffer4μL利用琼脂糖凝胶电泳检测目的片段大小。电泳仪采用恒压模式，程序设置140V，20min，之后使用凝胶成像仪，获得目的片段凝胶电泳图谱，扩增片段大小约为1300bp(图1)。扩大反应体系，在引物前面加上pET32a接头，以前面的PCR产物为模板，进行PCR扩增，共50μL体系，各组分浓度同20μL体系。再用胶回收试剂盒回收进行基因片段回收。

2.2酶切pET32a质粒，获得空载体

前期将含有pET32a质粒的大肠杆菌菌株过夜培养，通过质粒提取试剂盒获得pET32a质粒，之后用EcoRI限制性核酸内切酶在37℃下酶切pET32a质粒1h。酶切反应体系为：pET32a质粒1μg，酶1μL，buffer 2μL，其余用水补齐，共20μL。酶切完成后利用琼脂糖凝胶电泳检测片段大小，再利用胶回收试剂盒回收空载体片段。

2.3测序扩增的目的片段

测序成功后获得SEQ ID NO.1的核酸序列，利用SnapGene软件将DNA序列翻译成氨基酸序列，结果如SEQ ID NO.2所示：

用Infusion方法将天山雪莲HQT片段和pET32a载体上进行连接。反应体系：pET32a载体片段59ng，酶1μL，片段39ng，5×CEⅡbuffer 2μL，ddH

实施例3：工程菌诱导表达

3.1提取pET32a-SiHQT质粒，利用热激法将pET32a-SiHQT质粒转化到表达菌株BL21中，并涂板。

3.2挑单克隆，在含有Car

3.3按照1:100比例将小摇菌液接种到100mL LB液体培养基中，37℃摇床培养4-6h，摇至OD

3.4在4℃离心机中5000rpm，10min离心收集菌体。

3.5加入结合缓冲液15mL(50mM Tris-HCl，20mM咪唑，pH＝7.5)，重悬细胞，超声5s，间歇5s，共99次。

3.6在4℃离心机中12000rpm，离心30min。

3.7用结合缓冲液冲洗Ni柱3次，将上清加入Ni柱中，孵育30min，过柱子前，取上清蛋白500μL用于跑蛋白胶电泳对照。

3.8孵育完成后，用结合缓冲液洗两三次。

3.9加洗脱缓冲液(50mM Tris-HCl，250mM咪唑，pH＝7.5)洗脱His标签蛋白，用5mL离心管接洗脱的蛋白，测浓度。

3.10煮样：取此上清、沉淀、纯化后蛋白样品各20μL，加入Loadingbuffer 4μL，在98℃温度下煮样10min。

3.11取样品10μL另取Marker 10μL利用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测纯化蛋白大小和纯度，程序设置：190V，90min。

3.12跑完电泳后，将蛋白胶染色，l h后用自来水进行脱色。

结果如图2所示：在63-75kDa处出有一条蛋白条带，该条带与SiHQT理论值65kDa(含His标签)一致。

实施例4：SiHQT蛋白生物活性检测

以pCA-CoA/CA-CoA为底物完成酶活实验。酶活体系为：pH＝6的磷酸钠缓冲液100mM，奎宁酸500μM，二硫苏糖醇500μM和酰基供体底物(pCA-CoA/CA-CoA)400μL，最终体积为600μL，反应条件：37℃，反应30min，加等体积甲醇终止反应，每种底物增加1个空白对照。用高效液相色谱法检测SiHQT酶活，检测前12000rpm，5min离心样品，吸取上清过滤到2mL进样瓶中，将进样瓶放置到进样盘进行液相检测。结果表明，如图3A所示，SiHQT以CA-CoA为底物时反应生成绿原酸，图3B为以CA-CoA为底物时对应的阴性对照结果；如图3C所示，SiHQT以pCA-CoA为底物时反应生成香豆酰奎尼酸，图3D为以pCA-CoA为底物时对应的阴性对照结果。

实施例5SiHQT基因的应用

以SiHQT基因的全长编码区为目标片段，连接转化植物表达载体pEarlyGate100(除草剂抗性)，阳性克隆转化根癌农杆菌EHA105。使用叶圆盘或者愈伤组织作为转化受体，经侵染、共培养、筛选培养、芽再生和生根，获得阳性转基因植株。以SiHQT基因的全长编码区为目标片段，连接转化植物表达载体pEarlyGate100(除草剂抗性)，阳性克隆转化发根农杆菌LBA9402，经诱导、筛选培养，获得阳性毛状根系。阳性转基因株系及其经脱分化产生的愈伤细胞系、毛状根系，经液氮冷冻研磨，甲醇：水(1：1)提取，高压液相测定样品中绿原酸含量。经SiHQT遗传改造优选获得的阳性转基因工程植株、细胞系和毛状根系均为高产绿原酸雪莲工程系。

SEQ ID NO.1

atgggaagtgatcaaaagatgatgatgaacatcaatataaagaagtcatcaattattcccccttcagagtccataacagagtgtcctaagcaactatggacctccaatttggacttagttgttggtagaatccatattctcaccgtctatttctacagaccaaatggatcctccaaattcttcgatccaaacgttatgaaaaaggcgcttgccgatgtactcgtctcgttttatccgatggctgggcgattgggtagagatgacagtggcaggatcgtaattaactgtaacagtgagggcgttttgttcgttgaggccgagtcggattccaccttggacgacttcggcgagttcacgccgtcgccggagttccgccgacttactcctactgttgattactccggcgatatttcttcatatccgctattttttgcacaggtgactcatttcaaatgtggaggggttgcactcggttgcggtgtgcaccatacgttgtcagatggtctatcctcgctccatttcataaacacatggtccgatatggctcgtgggctctctgtagccatcccaccattcatcgaacgaaccctactacgtgcccgcaaaccacccatcccaacctatgaccatatcgaataccactcaccgccttccatgaatcccacggctcaatacccaggttccggttccctttctaaatcctccaccaccatgctaaagctcacactcgatcaactcaatactctcaaagccaaagccaaaagcgagagtggaaccacccatagcacgtatgaaatcctagcggctcatatttggcggtgtgcgtgcaaggctcgaggactcccagttgaccaattgaccaaactatatgtagccacagatggacggtcaagattgagtcctcagctcccaccagggtacctaggcaacgtggtcttcaccgccaccccggttgccaaatccggtgatcttacgtcaaaatcgttgtcaaacgctgcaaaactgattcacgccatgctggcgaaaatggacgatgattacttgagatctgcgattgatttcttggaattgcaaccggatctatcagcactgattcgtggaccgagttactttgcgagcccgaacctgaacataaacgcatggaccagactaccggtacatgatgcagaatttgggtggggtcggccgatctttatgggacccgcgtgtatattgtatgagggaactatttatgttctaccaagcccaaataacgatagaagtgtgtcattggcggtttgcttggacgcaaatgaacagccactttttgagaagttcttgtacgagttttga

SEQ ID NO.2

MGSDQKMMMNINIKKSSI IPPSESITECPKQLWTSNLDLVVGRIHILTVYFYRPNGSSKFFDPNVMKKALADVLVSFYPMAGRLGRDDSGRIVINCNSEGVLFVEAESDSTLDDFGEFTPSPEFRRLTPTVDYSGDISSYPLFFAQVTHFKCGGVALGCGVHHTLSDGLSSLHFINTWSDMARGLSVAIPPFIERTLLRARKPPIPTYDHIEYHSPPSMNPTAQYPGSGSLSKSSTTMLKLTLDQLNTLKAKAKSESGTTHSTYEILAAHIWRCACKARGLPVDQLTKLYVATDGRSRLSPQLPPGYLGNVVFTATPVAKSGDLTSKSLSNAAKLIHAMLAKMDDDYLRSAIDFLELQPDLSALIRGPSYFASPNLNINAWTRLPVHDAEFGWGRPIFMGPACILYEGTIYVLPSPNNDRSVSLAVCLDANEQPLFEKFLYEF*。