一种聚多巴胺包覆的介孔金属有机骨架固定化葡萄糖氧化酶制备方法

技术领域

本发明涉及酶工程领域，特别涉及一种聚多巴胺包覆的介孔金属有机骨架固定化葡萄糖氧化酶的制备方法。

背景技术

葡萄糖氧化酶(glucoseoxidase，简写为GOx)能够催化葡萄糖生成葡萄糖酸和过氧化氢，具有催化高效性、高选择性、反应条件温和等特点，在食品、医药、发酵等领域得到广泛应用。游离的葡萄糖氧化酶在应用过程中易失活、稳定性差、回收率低，使其在应用上受到一定的局限。

酶的固定化是在保持酶生物活性的基础上，用固体材料将酶束缚或限制于一定区域内，使酶可以回收及重复利用的一项技术。目前固定化葡萄糖氧化酶的制备方法主要有四种：吸附、交联、包埋和共价结合。通过传统方法所制备的固定化葡萄糖氧化酶的酶活回收率相对较低，使用一定时间后，固定化酶活力下降明显，因此有必要寻求合适的材料，通过简便的方法，制备具有良好生物活性及稳定性的固定化葡萄糖氧化酶，实现固定化葡萄糖氧化酶的工业化生产和应用。

近年来，常用载体按组成可分为高分子载体、无机载体、复合载体以及新型载体等。高分子材料具有使用寿命较短，传质性能较差等不足；无机载体具有稳定性好，成本低，寿命长等优点，但使用无机材料制备的固定化酶的负载率一般而言较低。相较于，金属有机框架化合物(MOFs)作为一类新型固定化载体日益受到重视。金属有机骨架材料是一种具有三维孔结构的配位聚合物。与上述固定化材料相比，金属有机骨架材料具有比表面积高，且孔结构和孔化学环境可调等优点。此外，金属有机骨架材料制备条件温和，避免了酶结构和功能的损伤；可通过有机配体上的-COOH或-NH2与酶分子上的氨基酸残基发生相互作用，从而防止了酶在反应过程中浸出，在固定化酶领域有着着广泛的应用前景。

发明内容

本发明的目的是选择合适的有机配体和金属离子对葡萄糖氧化酶进行固定化，得到具有高酶活性和稳定性且可循环使用的固定化葡萄糖氧化酶，解决目前固定化酶酶活回收率低、酶易泄露的问题。

在本发明中，采用仿生矿化技术，将葡萄糖氧化酶原位法将引入二价金属锌离子和含氮杂环有机配体(简写为Bim)形成的金属有机框架材料ZIF-7的孔道结构中，实现对酶的一步快速固定化；得到的固定化酶克服了游离葡萄糖氧化酶在重复使用性和稳定性等方面的不足。

本发明的技术方案包括如下步骤：

一种聚多巴胺包覆的介孔金属有机骨架固定化葡萄糖氧化酶的制备方法，采用含氮杂环有机配体、二价金属离子(以Zn

作为对技术方案的进一步改进，以上所述的一种聚多巴胺包覆的介孔金属有机骨架固定化葡萄糖氧化酶的制备方法，具体包括如下步骤：

(1)原料制备：

含氮杂环有机配体水溶液配制：将含氮杂环有机配体溶于离子水中，配制得到含氮杂环有机配体水溶液；

二价金属离子六水合硝酸锌配制：将二价金属离子溶于去离子水中，配制得到二价金属离子水溶液；

双端多巴胺改性的亲水性高分子聚合物与葡萄糖氧化酶混合溶液配制：将双端多巴胺改性的亲水性高分子聚合物和葡萄糖氧化酶冻干粉于离心管中，加入Tris-HCl缓冲液配制为双端多巴胺改性的亲水性高分子聚合物与葡萄糖氧化酶混合溶液；

多巴胺溶液配制：将多巴胺溶于Tris-HCl缓冲液中混匀后得到多巴胺溶液；

(2)介孔金属有机框架材料固定化葡萄糖氧化酶的制备：将双端多巴胺改性的亲水性高分子聚合物与葡萄糖氧化酶混合溶液，加入含氮杂环有机配体水溶液和二价金属离子水溶液，在pH为3.0～8.0，温度为20～60℃条件下进行仿生矿化反应，使含氮杂环有机配体和二价金属离子配位聚合并对葡萄糖氧化酶进行原位包埋，然后离心，洗涤，收集沉淀，得到介孔金属有机框架材料固定化葡萄糖氧化酶，记为DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7；

(3)聚多巴胺包覆的介孔金属有机骨架固定化葡萄糖氧化酶的制备：将介孔金属有机框架材料固定化葡萄糖氧化酶与多巴胺溶液混合，在pH为7.0～10.0条件下，振荡反应；使多巴胺的自聚合形成聚多巴胺，并聚多巴胺附着在介孔金属有机框架材料固定化葡萄糖氧化酶(DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7)上，离心，洗涤，冷冻干燥，得到聚多巴胺包覆的介孔金属有机框架材料固定化葡萄糖氧化酶，记为DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7/PDA。

作为对技术方案的进一步改进，以上所述的一种聚多巴胺包覆的介孔金属有机骨架固定化葡萄糖氧化酶的制备方法，所述的含氮杂环有机配体包括苯并咪唑、2-甲基咪唑、2,5-二羟基-1,4-苯甲羧酸。

作为对技术方案的进一步改进，以上所述的一种聚多巴胺包覆的介孔金属有机骨架固定化葡萄糖氧化酶的制备方法，所述的双端多巴胺改性的亲水性高分子聚合物为双端多巴胺修饰的聚乙二醇、双端多巴胺修饰的聚吡咯烷酮或双端多巴胺修饰的聚乙烯基咪唑中的一种。

作为对技术方案的进一步改进，以上所述的一种聚多巴胺包覆的介孔金属有机骨架固定化葡萄糖氧化酶的制备方法，所述的二价金属离子为锌离子、钴离子、铜离子。

作为对技术方案的进一步改进，以上所述的一种聚多巴胺包覆的介孔金属有机骨架固定化葡萄糖氧化酶的制备方法，所述的含氮杂环有机配体水溶液浓度为0.01-0.1mol/L；所述的二价金属离子水溶液浓度为0.01-0.1mol/L；所述的双端多巴胺改性的亲水性高分子聚合物与葡萄糖氧化酶混合溶液中双端多巴胺改性的亲水性高分子聚合物浓度为0.01-0.08mmol/L，葡萄糖氧化酶浓度为3-8mg/mL；所述的多巴胺溶液浓度为1-3mg/mL。

作为对技术方案的进一步改进，以上所述的一种聚多巴胺包覆的介孔金属有机骨架固定化葡萄糖氧化酶的制备方法，所述的含氮杂环有机配体、二价金属离子、葡萄糖氧化酶、双端多巴胺改性的亲水性高分子聚合物、多巴胺的摩尔比为3250-49998：1934-25220：1.23-10.08：6.5-52：2637.5-15825。

作为对技术方案的进一步改进，以上所述的一种聚多巴胺包覆的介孔金属有机骨架固定化葡萄糖氧化酶的制备方法，所述的仿生矿化反应时间为0.5-10h，所述的振荡反应时间为2～10h。

作为对技术方案的进一步改进，以上所述的一种聚多巴胺包覆的介孔金属有机骨架固定化葡萄糖氧化酶的制备方法，所述双端多巴胺改性的亲水性高分子聚合物中的亲水性高分子聚合物的分子量为2000～12000。

一种如上任一所述的聚多巴胺包覆的介孔金属有机骨架固定化葡萄糖氧化酶的制备方法制备得到的聚多巴胺包覆的介孔金属有机骨架固定化葡萄糖氧化酶，其特征在于：该酶为小于100nm的球状颗粒堆积而成的黑色非晶态团簇颗粒，团簇颗粒粒径约461nm；比表面积为74.70m2/g，孔径为17.31nm，属于介孔材料；其Km值为10.35±0.80mM，Vmax值为2.86±0.13μM·min

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

(1)本发明中将葡萄糖氧化酶溶液与DA-PEG-DA混匀后，再依次与Bim和二价金属离子混匀，在水相温和条件下成功制备出介孔金属有机框架材料固定化葡萄糖氧化酶(DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7)，并将固定化酶与多巴胺溶液混合，成功制备出聚多巴胺包覆的介孔金属有机框架材料固定化葡萄糖氧化酶(DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7/PDA)与游离葡萄糖氧化酶相比，提高了其稳定性，防止了酶在反应过程中浸出。

(2)本发明通过调整DA-PEG-DA、Bim、二价金属离子以及酶的量并且优化了固定化条件，从而最大程度地得到高催化活性的固定化酶，当选择酶浓度为5mg/mL，酶溶解在pH7.0的Tris-HCl缓冲液中，DA-PEG-DA的分子量为10000，浓度为0.04mmol/L，Bim的浓度为38.46mmol/L，二价金属离子浓度为4.31mmol/L，固定化时间为40min，固定化温度为35℃时，介孔金属有机框架材料固定化葡萄糖氧化酶DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7的酶包封效率及酶活回收率达到最佳值，分别为99.93±3.01％和106.46±1.65％。

(3)本发明通过介孔金属有机框架材料固定化葡萄糖氧化酶(DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7)与多巴胺溶液混合，调整反应时间为10h、多巴胺浓度为2.0mg/mL时，固定化酶的泄露率有效地降低，由14.53％降低至0.11％，此时得到的聚多巴胺包覆的介孔金属有机框架材料固定化葡萄糖氧化酶DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7/PDA酶活回收率为99.02±1.03％。。

(4)本发明对固定化酶DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7/PDA的酶学性质进行了考察，发现其在稳定性等方面有着明显的提高。DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7/PDA材料的三维孔道结构为葡萄糖氧化酶提供了刚性屏蔽环境从而有效地减小外界不利环境对酶活力的影响，提高了其热稳定性、耐酸碱性、储藏稳定性、重复利用稳定性等特性。

附图说明

图1是本发明制备DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7/PDA的合成原理图(a)及DA-PEG-DA/aZIF-7(b),DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7(c),DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7/PDA(d)的外观图。

图2是本发明制备的DA-PEG-DA/aZIF-7(a),DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7(b),DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7/PDA(c)的SEM图。

图3是本发明制备的DA-PEG-DA/aZIF-7(a),DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7(b),DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7/PDA(c)的TEM图。

图4是本发明制备的DA-PEG-DA/aZIF-7,DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7及DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7/PDA的粒度分析图。

图5是本发明制备的生物复合材料的红外光谱图。

图6是游离GOx(泳道1)、洗涤的DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7(泳道2)和洗涤的GOx-on-DA-PEG-DA/aZIF-7(泳道3)的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)图。

图7是本发明制备的生物复合材料的热重分析图。

图8是本发明制备的生物复合材料的X射线衍射(XRD)图。

图9是本发明制备的制备的DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7/PDA的XPS全谱(a)及XPS C 1s(b)、XPS N 1s(c)、XPS Zn 2p(d)高分辨谱图。

图10是本发明制备的生物复合材料的Ar吸附-脱附等温线(a)及孔径分布曲线(b)。

图11是DA-PEG-DA分子量(a)、DA-PEG-DA浓度(b)和多巴胺浓度(c)对酶固定化效率和酶活性回收率的影响结果图。

图12是pH对游离GOx及其固定化酶DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7/PDA催化反应活性的影响结果图。

图13是温度对游离GOx及其固定化酶DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7/PDA催化反应活性的影响结果图。

图14是游离GOx及其固定化酶DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7/PDA的米氏曲线(a)和Lineweaver-Burk双倒数曲线(b)。

图15是游离GOx及其固定化酶DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7/PDA的pH稳定性验证的结果图。

图16是游离GOx及其固定化酶DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7/PDA的热稳定性验证的结果图。

图17是本发明制备的固定化酶DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7/PDA的重复利用稳定性验证的结果图。

图18是游离GOx及固定化酶DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7/PDA的储存稳定性验证的结果图。

图19是游离GOx及固定化酶DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7/PDA耐不利环境稳定性验证的结果图。

图20是固定化酶DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7/PDA的底物选择性验证的结果图。

具体实施方式

下面通过实施例结合附图对本发明做进一步地详细说明，这些实施例仅用来说明本发明，并不限制本发明的保护范围。

对本发明得到的固定化酶通过以下的方式对其性质进行验证：

一、原料制备：

含氮杂环有机配体水溶液配制：将含氮杂环有机配体溶于离子水中，配制得到含氮杂环有机配体水溶液；浓度度为0.01-0.1mol/L，按照极差0.01mol/L进行配制。

二价金属离子六水合硝酸锌配制：将二价金属离子溶于去离子水中，配制得到二价金属离子水溶液；浓度为0.01-0.1mol/L，按照极差0.01mol/L进行配制。

双端多巴胺改性的亲水性高分子聚合物与葡萄糖氧化酶混合溶液配制：将双端多巴胺改性的亲水性高分子聚合物和葡萄糖氧化酶冻干粉于离心管中，加入Tris-HCl缓冲液配制为双端多巴胺改性的亲水性高分子聚合物与葡萄糖氧化酶混合溶液；双端多巴胺改性的亲水性高分子聚合物浓度为0.01-0.08mmol/L，按照极差0.02mmol/L进行配制；葡萄糖氧化酶浓度为3-8mg/mL；按照极差1mg/mL进行配制。

多巴胺溶液配制：将多巴胺溶于Tris-HCl缓冲液中混匀后得到多巴胺溶液；浓度为1-3mg/mL，按照极差0.5mol/L进行配制。

二、实验过程中使用的测定方法：

(1)葡萄糖氧化酶GOx活力的测定：

采用比色法进行酶活力测量，以葡萄糖为底物，催化水解所得产物为过氧化氢(H

10mM pH7.4的PBS缓冲液的配制:称取1.36g磷酸二氢钾，加入1000mL的去离子水定容为10mmol/L的磷酸氢二钾溶液。称取3.58g十二水磷酸氢二钠，加入1000mL的去离子水定容为10mmol/L的十二水磷酸氢二钠溶液。将配制好的两种溶液，使用pH计调成酸碱度为7.4的磷酸盐缓冲液。

1M的葡萄糖溶液配制：称取4.955g葡萄糖于烧杯中，用适量PBS溶解后定容到25mL。

50mM的ABTS溶液配制：称取0.2743gABTS于烧杯中，用适量PBS溶解后定容到10mL。

100μg/mL的HRP溶液配制：称取5mg HRP于10mL离心管中加入5mL的PBS配制成1mg/mL的HRP溶液，将1mg/mL的HRP溶液稀释10倍，配制成100μg/mL的HRP溶液。

酶活力的测定：在1mL狭缝比色皿中加入995μL的工作液(包括10mM pH7.4的PBS缓冲液785μL、1M的葡萄糖溶液100μL、50mM的ABTS溶液10μL及100μg/mL的HRP溶液100μL)和5μL的酶液或离心后的上清液及洗涤液，颠倒摇匀后，快速放入分光光度计样品槽中检测1min内在波长415nm处的吸光值随时间的变化。

(2)酶活力的计算：

葡萄糖氧化酶活力的定义：在25℃下单位时间(min)催化葡萄糖产生H

(3)酶的封装效率测定：

在1mL狭缝比色皿中加入995μL的工作液(包括10mM pH7.4的PBS缓冲液785μL、1M的葡萄糖溶液100μL、50mM的ABTS溶液10μL及100μg/mL的HRP溶液100μL)和5μL的酶液或离心后的上清液及洗涤液，颠倒摇匀后，快速放入分光光度计样品槽中检测1min内在波长415nm处的吸光值随时间的变化。

酶固定化效率(％)＝(加入酶的酶活-上清液中酶的酶活-洗涤液中酶的酶活)/加入酶的酶活×100％..............................................(1)

(4)固定化酶的相对酶活计算：

固定化酶相对酶活(％)＝固定化酶酶活/封装的游离酶酶活×100％.......(2)

(5)酶泄露率计算

酶泄露率(％)＝上清中泄露的酶活/封装的游离酶活×100％.....(3)

(6)十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)测定DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7

首先，将1mg DA-PEG-DA/aZIF-7粉末中加入25mgGOx吸附40min后，加入去离子水洗涤3次，洗脱未固定的GOx后得到GOx-on-DA-PEG-DA/aZIF-7，将1mgDA-PEG-DA/GOx@aZIF-7和GOx-on-DA-PEG-DA/aZIF-7分别溶于2毫升1M盐酸中。粉末完全溶解后，用离心式过滤器(10KDa)离心(7000r/min)浓缩溶液。将浓缩酶液中加入去离子水，配成酶浓度为1mg/mL的稀溶液。将制备的酶液取7.5μL与配制的Laemmli样品缓冲液混合，在95℃水中加热5min。在80V下，将混合物在SDS-PAGE上(12％丙烯酰胺)，进行电泳，凝胶经考马斯亮蓝染色。用去离子水漂洗凝胶上多余的考马斯亮蓝。

三、实施例

实施例1：

将分子量为2000浓度为0.01mmol/L的DA-PEG-DA(其中的PEG为聚乙二醇)加入到pH为3.0的浓度为3mg/mL的葡萄糖氧化酶GOx溶液中混匀后，加入浓度为0.01mol/L的Bim(其中的Bim为苯并咪唑)溶液和浓度为0.03mol/L的硝酸锌溶液，充分混合，使得含氮杂环有机配体、二价金属离子、葡萄糖氧化酶、双端多巴胺改性的亲水性高分子聚合物的摩尔比为3250：1934：1.23：6.5。将混合溶液在温度为20℃下进行仿生矿化反应0.5h，反应结束后离心用去离子水洗涤，收集的沉淀真空冷冻干燥，得到介孔金属有机框架材料固定化葡萄糖氧化酶，记为DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7。对离心所得上清测定其酶包封率。

将上述制备好的介孔金属有机框架材料固定化葡萄糖氧化酶DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7与浓度为1mg/mL多巴胺溶液，调整介孔金属有机框架材料固定化葡萄糖氧化酶DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7(以反应物葡萄糖氧化酶的物质的量代计)与多巴胺物质的的摩尔比为1.23：2637.5在pH7.0的条件下，振荡反应2h；反应结束后离心，用去离子水洗涤，收集沉淀真空冷冻干燥，得到聚多巴胺包覆的介孔金属有机框架材料固定化葡萄糖氧化酶，记为DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7/PDA。

然后使用实验过程中使用的测定方法中(1)、(2)、(3)计算葡萄糖氧化酶的封装效率、固定化酶的相对酶活及葡萄糖氧化酶的酶泄露率，本实施例中介孔金属有机框架材料固定化葡萄糖氧化酶的封装效率为68.08±2.21％，DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7酶活回收率为40.13±2.65％，聚多巴胺包覆的介孔金属有机框架材料固定化葡萄糖氧化酶DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7/PDA酶活回收率为41.05±2.13％，酶泄露率为11±2.40％。

实施例2：

将分子量为10000浓度为0.02mmol/L的DA-PEG-DA(其中的PEG为聚乙二醇)加入到pH为7.0的浓度为4mg/mL的葡萄糖氧化酶GOx溶液中混匀后，加入浓度为0.04mol/L的Bim(其中的Bim为苯并咪唑)溶液和浓度为0.04mol/L的硝酸锌溶液，充分混合，使得含氮杂环有机配体、二价金属离子、葡萄糖氧化酶、双端多巴胺改性的亲水性高分子聚合物的摩尔比为10000：5000：1.42：10。将混合溶液在温度为30℃下进行仿生矿化反应2h，反应结束后离心用去离子水洗涤，收集的沉淀真空冷冻干燥，得到介孔金属有机框架材料固定化葡萄糖氧化酶，记为DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7。对离心所得上清测定其酶包封率。

将上述制备好的介孔金属有机框架材料固定化葡萄糖氧化酶DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7与浓度为2mg/mL多巴胺溶液，调整介孔金属有机框架材料固定化葡萄糖氧化酶DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7(以反应物葡萄糖氧化酶的物质的量代计)与多巴胺物质的的摩尔比为1.42：5000在pH8.0的条件下，振荡反应4h；反应结束后离心，用去离子水洗涤，收集沉淀真空冷冻干燥，得到聚多巴胺包覆的介孔金属有机框架材料固定化葡萄糖氧化酶，记为DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7/PDA。

然后使用实验过程中使用的测定方法中(1)、(2)、(3)计算葡萄糖氧化酶的封装效率、固定化酶的相对酶活及葡萄糖氧化酶的酶泄露率，本实施例中介孔金属有机框架材料固定化葡萄糖氧化酶的封装效率为85.83±3.21％，DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7酶活回收率为86.46±2.7％，聚多巴胺包覆的介孔金属有机框架材料固定化葡萄糖氧化酶DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7/PDA酶活回收率为87.12±1.07％，酶泄露率为5.15±1.30％。

实施例3

将分子量为6000浓度为0.04mmol/L的DA-PEG-DA(其中的PEG为聚吡咯烷酮)加入到pH为5.0的浓度为5mg/mL的葡萄糖氧化酶GOx溶液中混匀后，加入浓度为0.05mol/L的Bim(其中的Bim为苯并咪唑)溶液和浓度为0.056mol/L的硝酸钴溶液，充分混合，使得含氮杂环有机配体、二价金属离子、葡萄糖氧化酶、双端多巴胺改性的亲水性高分子聚合物的摩尔比为20000：10000：1.62：15。将混合溶液在温度为35℃下进行仿生矿化反应3h，反应结束后离心用去离子水洗涤，收集的沉淀真空冷冻干燥，得到介孔金属有机框架材料固定化葡萄糖氧化酶，记为DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7。对离心所得上清测定其酶包封率。

将上述制备好的介孔金属有机框架材料固定化葡萄糖氧化酶DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7与浓度为3mg/mL多巴胺溶液，调整介孔金属有机框架材料固定化葡萄糖氧化酶DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7(以反应物葡萄糖氧化酶的物质的量代计)与多巴胺物质的的摩尔比为1.62：10000在pH8.5的条件下，振荡反应6h；反应结束后离心，用去离子水洗涤，收集沉淀真空冷冻干燥，得到聚多巴胺包覆的介孔金属有机框架材料固定化葡萄糖氧化酶，记为DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7/PDA。

然后使用实验过程中使用的测定方法中(1)、(2)、(3)计算葡萄糖氧化酶的封装效率、固定化酶的相对酶活及葡萄糖氧化酶的酶泄露率，本实施例中固定化葡萄糖氧化酶的封装效率为86.93±3.31％，介孔金属有机框架材料固定化葡萄糖氧化酶DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7酶活回收率为84.46±2.54％，聚多巴胺包覆的介孔金属有机框架材料固定化葡萄糖氧化酶DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7/PDA酶活回收率为58.12±2.03％，酶泄露率为0.51±1.00％。

实施例4

将分子量为8000浓度为0.04mmol/L的DA-PEG-DA(其中的PEG为聚乙二醇)加入到pH为7.0的浓度为5mg/mL的葡萄糖氧化酶GOx溶液中混匀后，加入浓度为0.005mol/L的Bim(其中的Bim为苯并咪唑)溶液和浓度为0.056mol/L的硝酸锌溶液，充分混合，使得含氮杂环有机配体、二价金属离子、葡萄糖氧化酶、双端多巴胺改性的亲水性高分子聚合物的摩尔比为24999：2801：6.3：26。将混合溶液在温度为35℃下进行仿生矿化反应0.7h，反应结束后离心用去离子水洗涤，收集的沉淀真空冷冻干燥，得到介孔金属有机框架材料固定化葡萄糖氧化酶，记为DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7。对离心所得上清测定其酶包封率。

将上述制备好的介孔金属有机框架材料固定化葡萄糖氧化酶DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7与浓度为2mg/mL多巴胺溶液，调整介孔金属有机框架材料固定化葡萄糖氧化酶DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7(以反应物葡萄糖氧化酶的物质的量代计)与多巴胺物质的的摩尔比为6.3：10550在pH 8.5的条件下，振荡反应10h；反应结束后离心，用去离子水洗涤，收集沉淀真空冷冻干燥，得到聚多巴胺包覆的介孔金属有机框架材料固定化葡萄糖氧化酶，记为DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7/PDA。

然后使用实验过程中使用的测定方法中(1)、(2)、(3)计算葡萄糖氧化酶的封装效率、固定化酶的相对酶活及葡萄糖氧化酶的酶泄露率，本实施例中介孔金属有机框架材料固定化葡萄糖氧化酶的封装效率为99.93±3.01％，DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7酶活回收率为106.46±1.65％，聚多巴胺包覆的介孔金属有机框架材料固定化葡萄糖氧化酶DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7/PDA酶活回收率为99.02±1.03％，酶泄露率为0.11±1.00％。

实施例5

将分子量为10000浓度为0.04mmol/L的DA-PEG-DA(其中的PEG为聚乙烯基咪唑)加入到pH为6.0的浓度为6mg/mL的葡萄糖氧化酶GOx溶液中混匀后，加入浓度为0.08mol/L的Bim(其中的Bim为2-甲基咪唑)溶液和浓度为0.08mol/L的硝酸铜溶液，充分混合，使得含氮杂环有机配体、二价金属离子、葡萄糖氧化酶、双端多巴胺改性的亲水性高分子聚合物的摩尔比为35000：20000：2.0：35。将混合溶液在温度为50℃下进行仿生矿化反应6h，反应结束后离心用去离子水洗涤，收集的沉淀真空冷冻干燥，得到介孔金属有机框架材料固定化葡萄糖氧化酶，记为DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7。对离心所得上清测定其酶包封率。

将上述制备好的介孔金属有机框架材料固定化葡萄糖氧化酶DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7与浓度为2mg/mL多巴胺溶液，调整介孔金属有机框架材料固定化葡萄糖氧化酶DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7(以反应物葡萄糖氧化酶的物质的量代计)与多巴胺物质的的摩尔比为2.0：12000在pH9.0的条件下，振荡反应8h；反应结束后离心，用去离子水洗涤，收集沉淀真空冷冻干燥，得到聚多巴胺包覆的介孔金属有机框架材料固定化葡萄糖氧化酶，记为DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7/PDA。

然后使用实验过程中使用的测定方法中(1)、(2)、(3)计算葡萄糖氧化酶的封装效率、固定化酶的相对酶活及葡萄糖氧化酶的酶泄露率，本实施例中固定化葡萄糖氧化酶的封装效率为96.93±2.01％，介孔金属有机框架材料固定化葡萄糖氧化酶DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7酶活回收率为68.46±2.45％，聚多巴胺包覆的介孔金属有机框架材料固定化葡萄糖氧化酶DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7/PDA酶活回收率为75.12±3.13％，酶泄露率为1.15±1.40％。

实施例6

将分子量为10000浓度为0.08mmol/L的DA-PEG-DA(其中的PEG为聚乙二醇)加入到pH为8.0的浓度为8mg/mL的葡萄糖氧化酶GOx溶液中混匀后，加入浓度为0.1mol/L的Bim(其中的Bim为2,5-二羟基-1,4-苯甲羧酸)溶液和浓度为0.1mol/L的硝酸锌溶液，充分混合，使得含氮杂环有机配体、二价金属离子、葡萄糖氧化酶、双端多巴胺改性的亲水性高分子聚合物的摩尔比为49998：25220：10.08：52。将混合溶液在温度为60℃下进行仿生矿化反应10h，反应结束后离心用去离子水洗涤，收集的沉淀真空冷冻干燥，得到介孔金属有机框架材料固定化葡萄糖氧化酶，记为DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7。对离心所得上清测定其酶包封率。

将上述制备好的介孔金属有机框架材料固定化葡萄糖氧化酶DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7与浓度为2.5mg/mL多巴胺溶液，调整介孔金属有机框架材料固定化葡萄糖氧化酶DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7(以反应物葡萄糖氧化酶的物质的量代计)与多巴胺物质的的摩尔比为10.08：15825在pH～10.0的条件下，振荡反应10h；反应结束后离心，用去离子水洗涤，收集沉淀真空冷冻干燥，得到聚多巴胺包覆的介孔金属有机框架材料固定化葡萄糖氧化酶，记为DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7/PDA。

然后使用实验过程中使用的测定方法中(1)、(2)、(3)计算葡萄糖氧化酶的封装效率、固定化酶的相对酶活及葡萄糖氧化酶的酶泄露率，本实施例中固定化葡萄糖氧化酶的封装效率为99.70±2.01％，介孔金属有机框架材料固定化葡萄糖氧化酶DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7酶活回收率为56.56±2.15％，聚多巴胺包覆的介孔金属有机框架材料固定化葡萄糖氧化酶DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7/PDA酶活回收率为59±2.13％，酶泄露率为0.15±0.60％。

对比实施例：

对比实施例1

将分子量为2000浓度为0.04mmol/L的DA-PEG-DA(其中的PEG为聚乙二醇)加入到pH为3.0的浓度为3mg/mL的葡萄糖氧化酶GOx溶液中混匀后，加入浓度为0.01mol/L的Bim(其中的Bim为苯并咪唑)溶液和浓度为0.01mol/L的硝酸锌溶液，充分混合，使得含氮杂环有机配体、二价金属离子、葡萄糖氧化酶、双端多巴胺改性的亲水性高分子聚合物的摩尔比为3250：1934：1.23：6.5。将混合溶液在温度为20℃下进行仿生矿化反应0.5h，反应结束后离心用去离子水洗涤，收集的沉淀真空冷冻干燥，得到介孔金属有机框架材料固定化葡萄糖氧化酶，记为DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7。

对比实施例2

将分子量为10000浓度为0.02mmol/L的DA-PEG-DA(其中的PEG为聚乙二醇)加入到pH为7.0的浓度为4mg/mL的葡萄糖氧化酶GOx溶液中混匀后，加入浓度为0.04mol/L的Bim(其中的Bim为苯并咪唑)溶液和浓度为0.04mol/L的硝酸锌溶液，充分混合，使得含氮杂环有机配体、二价金属离子、葡萄糖氧化酶、双端多巴胺改性的亲水性高分子聚合物的摩尔比为10000：5000：1.42：10。将混合溶液在温度为30℃下进行仿生矿化反应2h，反应结束后离心用去离子水洗涤，收集的沉淀真空冷冻干燥，得到介孔金属有机框架材料固定化葡萄糖氧化酶，记为DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7。

四、介孔金属有机骨架材料的表征

图1是制备DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7/PDA的合成原理图(a)及DA-PEG-DA/aZIF-7(b),DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7(c),DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7/PDA(d)的外观图。

由图可见，DA-PEG-DA/aZIF-7为白色颗粒状样品；DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7为黄色颗粒状样品；DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7/PDA为黑色颗粒状样品。

图2分别是制备的DA-PEG-DA/aZIF-7(a),DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7(b),DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7/PDA(c)的SEM图。

图3是DA-PEG-DA/aZIF-7(a),DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7(b),DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7/PDA(c)的TEM图。通过对比可以看出，DA-PEG-DA/aZIF-7、DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7和DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7/PDA的SEM和TEM图形貌基本一致，均为不规则小于100nm的球状颗粒堆积在一起形成的团簇，表明葡萄糖氧化酶和聚多巴胺的引入并没有破坏aZIF-7的形貌。从TEM图看出，加入GOx后，DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7的粒径增大，这可能是由于GOx的引入加速了aZIF-7的合成。从DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7/PDA样品的TEM图看出，PDA在DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7的外表面上形成，并将纳米颗粒栓系成为粒径更大的团聚体。

图4是制备的DA-PEG-DA/aZIF-7,DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7及DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7/PDA的粒度分析图。由图可知，DA-PEG-DA/aZIF-7,DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7和DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7/PDA的团簇颗粒分别为270.7nm、356.9nm和461nm。样品粒径依次增大，结果与TEM一致。

图5是生物复合材料的红外光谱图，DA-PEG-DA/aZIF-7的特征峰出现在1461cm

图6是游离GOx(泳道1)、洗涤的DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7(泳道2)和洗涤的GOx-on-DA-PEG-DA/aZIF-7(泳道3)的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)图。泳道1和泳道2出现了明显的蛋白条带，而泳道3没有出现蛋白条带，这一结果清楚地证明了GOx确实嵌入在DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7中，并且嵌入的GOx分子不容易从生物复合材料中被去除。相反，GOx-on-DA-PEG-DA/aZIF-7表面的GOx分子被轻易地移除，因为它们只被物理吸附在DA-PEG-DA/aZIF-7表面。

图7是生物复合材料的热重分析图。从35℃到275℃，DA-PEG-DA/aZIF-7由于样品中水分子的蒸发而损失了约5.95％的质量，从275℃到800℃，DA-PEG-DA/aZIF-7自身分解，损失了约76.42％的质量；从35℃到113℃，DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7由于样品中水分子的蒸发而损失了约1.51％的质量，从113℃到800℃，DA-PEG-DA/aZIF-7自身分解，损失了约82.58％的质量；从35℃到132.3℃，DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7/PDA由于样品中水分子的蒸发而损失了约2.57％的质量，从132.3℃到800℃，DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7/PDA自身分解，损失了约81.83％的质量。通过DA-PEG-DA/aZIF-7,DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7和DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7/PDA的三条失重曲线分析可知GOx成功固定于DA-PEG-DA/aZIF-7中，DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7中GOx的重量约占材料总重量6.16％，DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7/PDA中GOx的重量约占材料总重量5.41％。

图8是生物复合材料的X射线衍射(XRD)图。由图可知，在水相原位合成过程中未添加DA-PEG-DA得到的ZIF-7具有部分晶态结构，特征峰位置与ZIF-7-Ⅲ类似，但加入DA-PEG-DA得到的DA-PEG-DA/aZIF-7、DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7和DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7/PDA的X射线衍射图表明存在更多非晶态结构，说明DA-PEG-DA的引入能引起ZIF-7的长程有序丢失，诱导DA-PEG-DA/aZIF-7、DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7和DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7/PDA材料中出现配位缺陷。

图9是制备的DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7/PDA的XPS全谱(a)及XPS C 1s(b)、XPS N 1s(c)、XPS Zn 2p(d)高分辨谱以检测DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7/PDA的化学结构。DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7/PDA的XPS全谱表明，生物复合材料中含有C、N、O、Zn元素，与合成时加入物质的元素一致。XPS C 1s谱可被拟合为C-C(284.74ev)、C-O/C-N(286.22ev)、O＝C-O(288.11ev)。XPS N 1s谱可被拟合为N-Zn(399.21ev)、咪唑C＝N(400.34ev)、胺C-N(398.65ev)。XPS Zn 2p谱显示，Zn 2p

图10是生物复合材料的Ar吸附-脱附等温线(a)及孔径分布曲线(b)。从图(a)中可以看出，DA-PEG-DA/aZIF-7、DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7和DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7/PDA的吸附和脱附等温线曲线交点都在0.6-0.8之间，这说明DA-PEG-DA/aZIF-7、DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7和DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7/PDA是介孔材料。结合图(b)的孔径分布图可以看出DA-PEG-DA/aZIF-7、DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7和DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7/PDA中的孔隙主要以介孔为主，属于介孔材料，其中部分介孔的存在可能是由于材料间的堆积所致。同时，DA-PEG-DA/aZIF-7、DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7和DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7/PDA的比表面积分别为103.77m

五、固定化酶DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7/PDA的酶学性质

(1)游离GOx及固定化酶DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7/PDA的最适催化反应pH值：

pH是影响酶活力的一个重要因素，酶的构象易受pH变化而发生重大改变，从而引起酶活力损失。如图12所示，游离酶和固定化酶的最佳反应pH都为6.0，这说明DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7/PDA中GOx的构象没有发生明显变化。与游离GOx相比，DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7/PDA在pH值5.0-8.0时表现出较高的相对活性。

(2)游离GOx及固定化酶DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7/PDA的最适催化反应温度：

温度是影响酶催化反应活性的另一个重要因素，本发明探究了游离GOx及固定化酶DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7/PDAA在不同温度体系下的催化反应活性。如图13所示，游离GOx的最佳反应温度为40℃，固定化酶DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7/PDA的最佳反应温度为45℃。

(3)游离GOx及固定化酶DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7/PDA的动力学参数：

配制浓度为0-100mM底物葡萄糖，短时间内进行催化反应，测定游离GOx及固定化酶DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7/PDA的酶活力，利用Lineweaver-Burk法求出其两者的K m值，kcat值及k cat/K m值。结果如图14的米氏曲线(a)和Lineweaver-Burk双倒数曲线(b)以及表1所示。

表1.游离GOx及固定化酶DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7/PDA的动力学参数表

从表1中可以看出，与游离GOx相比，DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7/PDA的Km值大大降低，说明DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7/PDA与底物的亲和力较好。此外，DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7/PDA的催化常数(k cat)和催化效率(Kcat/Km)与游离GOx相比均有提高，表明DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7/PDA比游离GOx有更高的催化效率。

(4)游离GOx及固定化酶DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7/PDA的pH稳定性

GOx是一种蛋白质，其催化性能易受环境pH值影响，过高或过低的pH值会破坏酶的三维结构或者阻碍底物与酶结合，从而导致酶分子活性降低甚至失活。图15为在不同pH值下处理30min后游离酶和固定化酶DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7/PDA的稳定性。由图可见，pH值对游离酶的催化性能的影响大于对DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7/PDA的影响。DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7/PDA在pH值为4.5-8.5的范围内仍具有高的相对活力(＞75％)，但对于游离GOx而言，在pH值为8.5的缓冲液中处理30min后，相对活力仅有69.50±3.00％。可见，固定化酶DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7/PDA在较宽的pH值范围内表现出良好的稳定性。

(5)游离GOx及固定化酶DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7/PDA的温度稳定性

图16对游离酶GOx和固定化酶DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7/PDA的温度稳定性进行了评价。由图16可见，在低于30℃时，游离酶GOx和固定化酶DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7/PDA的相对活力均缓慢降低，而高于30℃后固定化酶DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7/PDA的相对活力降低趋势相对于游离酶更小，在70℃时，游离酶GOx的相对活力仅有17.69±3.76％，而DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7/PDA仍具54.83±2.41％的相对活力。表明固定化酶DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7/PDA的热稳定性明显高于游离酶。这是由于高温环境会破坏GOx的空间结构，导致不可逆失活，而DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7/PDA为GOx提供了刚性的保护层，提高了热稳定性。

(6)固定化酶DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7/PDA的重复利用稳定性：

如图17所示，排除实验中离心等一系列破坏酶活力因素，在第一次降解酶活性为100％的情况下，DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7/PDA经过10个循环后仍保持96.68±2.33％的相对活性。固定化酶DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7/PDA使用简单，可有效回收，可重复使用，符合经济和绿色化学要求。

(7)游离GOx及固定化酶DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7/PDA的储存稳定性：

酶的贮藏条件及稳定性等问题是酶工业化应用中必须应对的问题。本实施例将游离GOx和固定化酶DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7/PDA保存在4℃的冰箱中，测定其10天内的相对酶活力。如图18所示，在4℃条件下，储存第10天固定化酶DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7/PDA的相对活性保持在98.02±3.41％，游离GOx仅能保持62.21±3.26％的相对活力。证明固定化酶DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7/PDA能够在一定的温度和时间范围内成功保存而不失去活性，这可能是由于材料的保护作用导致。

(8)游离GOx及固定化酶DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7/PDA耐不利环境稳定性：

酶暴露在不利环境下，如极性有机溶剂、尿素、胰蛋白酶等，通常会导致酶活性降低甚至失活。本实施例考察了游离GOx和固定化酶DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7/PDA在含1mg/mL胰蛋白酶、6M尿素、50％二甲基亚砜、50％甲醇、50％丙酮的水溶液中的耐受性。如图19所示，在处理后，DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7/PDA的剩余活性均高于游离GOx。表明DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7/PDA具有良好的保护作用和屏蔽作用，这可能是由于酶与载体之间的相互作用提高了酶分子稳定性。

(9)固定化酶DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7/PDA的底物选择性：

GOx由于其具有安全性、高效性、高度特异性等特点，常被作为葡萄糖检测生物传感器的生物元件，为了避免在检测过程中其他物质的干扰，本实施例检测了相同浓度不同分析物(包括葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖、阿拉伯糖、木糖、鼠李糖和麦芽糖)存在时DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7/PDA对葡萄糖的选择性。以DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7/PDA催化葡萄糖反应的酶活力计为100％，计算DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7/PDA催化干扰物反应的相对酶活力。如图20所示，DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7/PDA催化干扰物蔗糖、果糖、半乳糖、阿拉伯糖、木糖、鼠李糖几乎没有响应，催化麦芽糖时相对活力极小，低于6％。此外，通过目测同一时间反应液的颜色，可以看出在相同浓度下，只有含有葡萄糖的反应液呈明显的蓝色。以上结果表明，DA-PEG-DA/GOx@aZIF-7/PDA对葡萄糖有敏感的特异性颜色反应，有良好的底物选择性。

所述实施例为本发明的优选的实施方式，但本发明并不限于上述实施方式，在不背离本发明的实质内容的情况下，本领域技术人员能够做出的任何显而易见的改进、替换或变型均属于本发明的保护范围。