抗原稳定剂及其应用与试剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及抗原稳定剂及其应用与试剂盒。

背景技术

人类于1956年首次从感冒的黑猩猩身上分离出RSV，并与1957年利用细胞培养技术从罹患肺炎的儿童呼吸道分离出该病毒。呼吸道合胞病毒被证实成为一种无处不在的病原体，在2岁之前感染几乎所有儿童，其中一半儿童在此期间经历过两次感染。

呼吸道合胞病毒(RSV)是一种丝状包膜，负股单链RNA病毒，属于Pneumoviridae家族的Orthopneumovirus属。呼吸道合胞病毒(RSV)在鼻咽和上呼吸道的上皮细胞中短时间复制后，进而扩散到下呼吸道的小细支气管或肺泡。宿主对呼吸道合胞病毒(RSV)感染的免疫反应会增加粘液和炎症的产生，导致气道狭窄，导致幼儿毛细支气管炎，老年人或有潜在慢性病的人出现急性呼吸道疾病。

由于呼吸道合胞病毒(RSV)脂质包膜结构，对乙醚或其他脂溶剂敏感。呼吸道合胞病毒对于环境的变化非常敏感。55℃暴露5min后，仅有10％的呼吸道合胞病毒仍能保持感染活性；室温48h后，RSV的感染活性下降至10％；4℃7天后，RSV仅剩下1％的感染活性。在每次冻融后，RSV的感染活性的滴度大约下降90％。氯仿和去污剂(如0.1％的脱氧胆酸钠、十二烷硫酸钠(SDS)和TritonX-100)均能迅速灭活RSV。RSV在环境中的生存能力部分取决于干燥时间和环境湿度。将标本放置于乙醇或干冰中速冻，同时向冻存液中加入稳定剂(如甘油或蔗糖)，能增强RSV长期储存的效果。

呼吸道合胞病毒很不稳定，需要特殊处理。用作培养的临床标本应在冷链运送并迅速接种在敏感的细胞系中。在37℃1h后敏感性就会减退，冻融后再慢慢冻至-20℃病毒活力将完全丧失。标本应在收集后4h内接种到培养基，不能及时处理的标本应用乙醇和干冰浴急冻起来。在冻存液里添加蔗糖或甘油可以增加呼吸道合胞病毒冻存后的复苏率。

通过体外细胞培养是对呼吸道合胞病毒扩增的有效办法；但是，由于RSV不稳定的特性，给RSV病毒体外细胞培养增加了难度。

病毒扩增的细胞选择，对于原代培养，通常首选人类非整倍体的细胞，例如HEP-2、HeLa和A549细胞。选择其他的细胞系用于培养，例如人肾细胞、猴肾细胞和二倍体成纤维细胞进行培养。

收毒时间点的控制，细胞系培养3～7天后，培养的细胞可出现特征性的合胞体的细胞病变。然而合胞体形成的程度取决于培养细胞的类型、单层细胞的融合、病毒株、感染复数。因此利用常规培养法培养出的RSV病毒收毒时间点存在很大差异。造成这种差异部分原因是：1、病毒生存能力的减弱；2、需要有经验的技术人员；3、实验室所使用的细胞系不同。

收毒后的处理工艺不同，目前主要有两种，收取培养细胞和收取培养上清。

呼吸道合胞病毒感染的检测方法有：核酸检测、抗原检测、血清学特异性抗体检测、病毒分离培养，其中血清特异性IgM抗体阳性对病原学诊断具有重要参考意义。目前国内检测呼吸道合胞病毒(RSV)感染方法有电镜检测、培养鉴定法、聚合酶链反应(PCR)、酶联免疫吸附试验、凝集法、荧光免疫特异性抗体检测方法等。采用四组分捕获法试剂盒检测血清/血浆中的IgM抗体，试剂盒包括抗人IgM抗体偶联的磁性微粒，呼吸道合胞病毒(RSV)抗原溶液，辣根过氧化物酶标记的抗呼吸道合胞病毒抗体溶液(酶结合物溶液)，样本稀释液。其中呼吸道合胞病毒(RSV)抗原溶液采用的是天然培养的灭活RSV抗原与缓冲液配制得到。但不同批试剂盒检测临床样本特异性差、本底信号值高，主要由抗原不同批次差异导致。

现有技术抗原稳定剂配方对病毒无法起到载体作用及附着保护作用，因而其稳定性较差，在受热条件下无法为病毒提供缓冲介质，导致病毒失效，因此其无法起到稳定以及保护作用。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了抗原稳定剂及其应用与试剂盒。本发明提供了一种抗原稳定剂及组合试剂和其在体外诊断试剂盒中的应用。本发明中的试剂盒简单易于制备，由于其试剂组分的热稳定性，特异性提升，从而使得其在储存测试过程中不会轻易变性导致产品失效，因此有利于保证测试结果的准确性，有效改善天然培养的RSV病毒抗原批间差异问题。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种抗原稳定剂，所述抗原稳定剂包括缓冲液，蛋白保护剂，稳定剂，生物相容性聚合物和生物防腐剂；

所述缓冲液包括PBS缓冲液；所述蛋白保护剂包括牛血清白蛋白；所述稳定剂包括蔗糖；所述生物相容性聚合物包括泊洛沙姆；所述生物防腐剂包括Proclin300。

在一些具体实施方案中，所述PBS缓冲液的浓度包括0.02～0.1mol/L，其pH包括6.5～8.0；和/或

所述牛血清白蛋白的浓度包括5～50g/L；和/或

所述蔗糖的浓度包括10～50g/L；和/或

所述泊洛沙姆的浓度包括1～50g/L；优选的，泊洛沙姆的分子量不低于8000；和/或

所述Proclin300的浓度包括0.1～1g/L。

优选的，在本发明的一些具体实施方案中，所述牛血清白蛋白浓度为10g/L。

优选的，在本发明的一些具体实施方案中，所述蔗糖浓度为15g/L。

优选的，在本发明的一些具体实施方案中，所述泊洛沙姆的分子量为12600～14600，其浓度为1g/L。

优选的，在本发明的一些具体实施方案中，所述Proclin300的浓度为1g/L。

本发明还提供了一种组合试剂，其包括所述抗原稳定剂和酶结合物溶液。

所述酶结合物溶液包括氯化钠。

所述氯化钠的浓度包括0.15mol/L～1.0mol/L；和/或

所述PBS缓冲液的浓度包括0.02～0.1mol/L，其pH包括6.5～8.0；和/或

所述牛血清白蛋白的浓度包括5～50g/L；和/或

所述蔗糖的浓度包括10～50g/L；和/或

所述泊洛沙姆的浓度包括1～50g/L；优选的，泊洛沙姆的分子量不低于8000；和/或

所述Proclin300的浓度包括0.1～1g/L。

优选的，在本发明的一些具体实施方案中，所述氯化钠不低于0.3mol/L。

优选的，在本发明的一些具体实施方案中，所述牛血清白蛋白浓度为10g/L。

优选的，在本发明的一些具体实施方案中，所述蔗糖浓度为15g/L。

优选的，在本发明的一些具体实施方案中，所述泊洛沙姆的分子量为12600～14600，其浓度为1g/L。

优选的，在本发明的一些具体实施方案中，所述Proclin300的浓度为1g/L。

本发明还提供了如下任意项在制备提高病毒抗原稳定性产品中的应用：

(I)、所述抗原稳定剂；和/或

(II)、所述组合试剂；

所述病毒包括呼吸道合胞病毒。

本发明还提供了如下任意项在制备提高病毒抗原检测特异性产品中的应用：

(I)、所述抗原稳定剂；和/或

(II)、所述组合试剂；

所述病毒包括呼吸道合胞病毒。

本发明还提供了如下任意项在制备体外诊断试剂盒中的应用：

(I)、所述抗原稳定剂；和/或

(II)、所述组合试剂。

本发明还提供了一种试剂盒，包括如下任意项，以及可接受的助剂或载体：

(I)、所述抗原稳定剂；和/或

(II)、所述组合试剂。

本发明还提供了一种提高病毒抗原稳定性和/或提高病毒抗原检测特异性的方法，基于以下任意项对病毒抗原进行检测：

(I)、所述抗原稳定剂；和/或

(II)、所述组合试剂；

所述病毒包括呼吸道合胞病毒。

本发明取得了包括但不限于如下有益效果：

提高了呼吸道合胞病毒抗原的稳定性，主要为热稳定性；所述抗原稳定剂中各成分之间相互协同作用，从而可以长期储存；且能普遍应用于RSV抗体检测的体外诊断试剂，其对试剂的稳定效果更好，有效地延长了试剂的有效期。

在抗原溶液中添加NaCL(实验中最高添加到了1.0mol/L)能改善特异性，有效降低本底信号值，但会造成抗原溶液的热稳定性变差；添加0.15mol/LNaCL及不添加不能解决特异性及本底问题。将0.3mol/LNaCL添加到酶结合物溶液中也能起到同样的效果，并且不影响抗原溶液的热稳定性。

本发明中的试剂盒简单易于制备，由于其试剂组分的热稳定性，特异性提升，从而使得其在储存测试过程中不会轻易变性导致产品失效，因此有利于保证测试结果的准确性，有效改善天然培养的RSV病毒抗原批间差异问题。

具体实施方式

本发明公开了一种抗原稳定剂及其应用与试剂盒，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明的目的在于提供一种用于提高呼吸道合胞病毒的热稳定性的方法。

本发明的目的还在于提供一种通过前述方法制得具有热稳定性的RSV抗体检验试剂盒。

为实现上述发明目的，本发明通过以下技术方案实现RSV抗体检测试剂盒抗原稳定剂，其包含缓冲液、蛋白保护剂、稳定剂、生物相容性聚合物、生物防腐剂。

作为优选所述抗原稳定剂具体包括：缓冲液采用PBS缓冲，浓度为0.02～0.1mol/L，pH6.5～8.0；蛋白保护剂采用牛血清白蛋白，浓度为5g/L～50g/L；稳定剂采用蔗糖，浓度为10g/L～50g/L；生物相容性聚合物采用泊洛沙姆，浓度为1.0g/L～50g/L；生物防腐剂采用Proclin300，浓度为0.1g/L～1g/L。

现有技术配方中不存在生物相容性聚合物或生物相容性聚合物多数为低分子量生物相容性聚合物；其对病毒无法起到载体作用及附着保护作用，因而其稳定性较差，在受热条件下无法为病毒提供缓冲介质，导致病毒失效，因此其无法起到稳定以及保护作用。

而所述的生物相容性聚合物泊洛沙姆(Poloxamer)商品名为普兰尼克(Pluronic)，是一类新型的高分子非离子型三嵌段共聚物，分子式HO·(C

本发明RSV抗体检测试剂盒用抗原稳定剂中，泊洛沙姆能与病毒疏水区域结合，结合后其外部亲水端形成一层水化膜，对病毒起到保护作用；同时因分子量大的特点，在结合后为病毒起到载体作用，具有更好的热稳定性。

本发明提供的RSV抗体检测试剂盒抗原稳定剂的制备方法：

(1)按组分含量配制所述PBS缓冲液，得到溶液1；

(2)按组分含量分别量取所述蛋白保护剂、稳定剂、生物相容性聚合物、生物防腐剂并加入到溶液1中，混匀得到溶液2；即制得所述抗原稳定剂。

另一方面，本发明还提供了一种包括用上述方法制得且具有热稳定性的抗体检测试剂盒。

所述试剂盒中，呼吸道合胞病毒抗原溶液R2作为单独组分存在，在抗体检测中起到侨联作用，该试剂盒可用于定性检测呼吸道合胞病毒抗体，检测抗体的类型取决于包被的抗人抗体。

作为优选，上述抗原溶液R2稀释液选择上述抗原稳定剂。

试剂盒其他组分均为业内普遍认知的相关成分；包括抗人抗体偶联的磁性微粒R1，辣根过氧化物酶标记的抗呼吸道合胞病毒抗体R3，样本稀释液R4，化学发光底物A液R5和化学发光底物B液R6。

本发明提供的RSV抗体检测试剂盒酶结合物溶液(辣根过氧化物酶标记的抗呼吸道合胞病毒抗体R3)的制备方法：

(1)按组分含量分别取三(羟甲基)氨基甲烷Tris 6.038g，氯化钠(0.15～1.0mol)，将上述各组分在1L的纯化水中充分溶解、混合，用6mol/L盐酸将溶液的pH值调至pH7.4，得到溶液1；

(2)按组分含量分别量取小牛血清203.430g，Proclin3001g，Bronidox防腐剂0.199g，氨基比林(ADP蛋白保护剂)0.997g，酪蛋白1.994g并加入到溶液1中，混匀得到溶液2；即制得酶结合物稀释液；

(3)将酶结合物活性材料按照体积比1:8000的比例添加到溶液2中制得溶液3；即制得酶结合物溶液。

与现技术相比，本发明提供的RSV抗体检测试剂盒抗原稳定剂的有益效果在于：

提高了呼吸道合胞病毒抗原的稳定性，主要为热稳定性；所述抗原稳定剂中各成分之间相互协同作用，从而可以长期储存；且能普遍应用于RSV抗体检测的体外诊断试剂，其对试剂的稳定效果更好，有效地延长了试剂的有效期。

在抗原溶液中添加NaCL(实验中最高添加到了1.0mol/L)能改善特异性，有效降低本底信号值，但会造成抗原溶液的热稳定性变差；添加0.15mol/LNaCL及不添加)不能解决特异性及本底问题。将0.3mol/LNaCL添加到酶结合物溶液中也能起到同样的效果，并且不影响抗原溶液的热稳定性。

本发明中的试剂盒简单易于制备，由于其试剂组分的热稳定性，特异性提升，从而使得其在储存测试过程中不会轻易变性导致产品失效，因此有利于保证测试结果的准确性，有效改善天然培养的RSV病毒抗原批间差异问题。

本发明所使用的牛血清白蛋白，由郑州伊美诺生物技术有限公司生产；蔗糖，由北京益利精细化学品有限公司生产；泊洛沙姆，由阿拉丁生产；

Proclin300，由SIGMA生产；吐温20，由北京益利精细化学品有限公司生产；PVA，由SIGMA生产；PVP由SIGMA生产；PEG由SIGMA生产。

本发明所使用的试剂盒为呼吸道合胞病毒IgM抗体检测试剂盒(磁微粒化学发光法)；注册证编号：国械注准20203400075；产品批号：20220426；规格：100测试/盒。

如无特殊说明，本发明提供的抗原稳定剂及其应用与试剂盒中所用原料及试剂均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

制备例1含0.1％泊洛沙姆抗原溶液的制备

RSV抗体检测试剂盒组成成份：试剂1：磁微粒混悬液，含有抗人IgM抗体偶联的磁性微粒；试剂2：抗原溶液：含呼吸道合包病毒的抗原溶液；试剂3：酶结合物溶液，含有辣根过氧化物酶标记的抗呼吸道合胞病毒抗体；试剂4：样品稀释液，含有蛋白的缓冲液。

1、含0.1％泊洛沙姆抗原稳定剂的制备

(1)按组分含量分别称取磷酸二氢钠0.59g，磷酸氢二钠5.8g，氯化钠8.766g，将上述各组分在1L的纯化水中充分溶解、混合，得到溶液1；

(2)按组分含量分别量取牛血清白蛋白10g，蔗糖15g，Proclin3001g/L，泊洛沙姆分子量126001g，并加入到溶液1中，混匀得到溶液2；即制得含0.1％泊洛沙姆的抗原稳定剂。

2、含0.1％泊洛沙姆抗原溶液的制备

活材厂家及编号：厂家ATCC(全称：美国模式培养物集存库)，毒株编号：VR-26。

病毒抗原制备过程：

(1)细胞准备：细胞复苏，贴壁传代培养，比例放大培养至10层细胞工厂；

(2)病毒制备：病毒接种，接毒比例1:5，带毒传代，细胞工厂扩大至40层，取样检测，病毒收获；

(3)病毒灭活、灭活验证：β丙内酯灭活，灭活后盲传；

(4)病毒浓缩：通过病毒液浓缩管路系统进行浓缩(浓缩比为1:10)，得到呼吸道合胞病毒抗原。

(5)按照体积比呼吸道合胞病毒抗原：含0.1％泊洛沙姆抗原稳定剂＝1:15的比例，制得含0.1％泊洛沙姆抗原溶液。

制备例2酶结合物溶液的制备

(1)按组分含量分别取三(羟甲基)氨基甲烷Tris 6.038g，氯化钠(0.15、0.3、0.5、1mol)，将上述各组分在1L的纯化水中充分溶解、混合，用6mol/L盐酸将溶液的pH值调至pH7.4，得到含不同浓度氯化钠的溶液1；

(2)按组分含量分别量取小牛血清203.430g，Proclin3001g，Bronidox防腐剂0.199g，氨基比林(ADP蛋白保护剂)0.997g，酪蛋白1.994g并加入到溶液1中，混匀得到溶液2；即制得含不同浓度氯化钠的酶结合物稀释液；

(3)将酶结合物活性材料按照体积比1:8000的比例添加到溶液2中制得溶液3；即制得含不同浓度氯化钠的酶结合物溶液。

对比例1含0.1％TW20抗原溶液的制备

本对比例中试剂2的制备过程中，其制备过程与组分加入量同制备例1中的1～2所示，但泊洛沙姆分子量12600换成TW20。制得含0.1％TW20抗原溶液。

对比例2含0.1％PVA80抗原溶液的制备

本对比例中试剂2的制备过程中，其制备过程与组分加入量同制备例1中的1～2所示，但泊洛沙姆分子量12600换成PVA80。制得含0.1％PVA80抗原溶液。

对比例3含0.1％PVA203抗原溶液的制备

本对比例中试剂2的制备过程中，其制备过程与组分加入量同制备例1中的1～2所示，但泊洛沙姆分子量12600换成PVA203。制得含0.1％PVA203抗原溶液。

对比例4含0.1％PVP(K30)抗原溶液的制备

本对比例中试剂2的制备过程中，其制备过程与组分加入量同制备例1中的1～2所示，但泊洛沙姆分子量12600换成PVP(K30)。制得含0.1％PVP(K30)抗原溶液。

对比例5含0.1％PEG2000抗原溶液的制备

本对比例中试剂2的制备过程中，其制备过程与组分加入量同制备例1中的1～2所示，但泊洛沙姆分子量12600换成PEG2000。制得含0.1％PEG2000抗原溶液。

对比例6含0.1％PEG4000抗原溶液的制备

本对比例中试剂2的制备过程中，其制备过程与组分加入量同制备例1中的1～2所示，但泊洛沙姆分子量12600换成PEG4000。制得含0.1％PEG4000抗原溶液。

对比例7含0.1％PEG20000抗原溶液的制备

本对比例中试剂2的制备过程中，其制备过程与组分加入量同制备例1中的1～2所示，但泊洛沙姆分子量12600换成PEG20000。制得含0.1％PEG20000抗原溶液。

对比例8含0.1％PEG100000抗原溶液的制备

本对比例中试剂2的制备过程中，其制备过程与组分加入量同制备例1中的1～2所示，但泊洛沙姆分子量12600换成PEG100000。制得含0.1％PEG100000抗原溶液。

实施例1稳定性和重复性检测

本发明所使用的试剂盒为呼吸道合胞病毒IgM抗体检测试剂盒(磁微粒化学发光法)；注册证编号：国械注准20203400075；产品批号：20220426；规格：100测试/盒。

将试剂盒中的试剂2分别替换为制备例1得到的含0.1％泊洛沙姆抗原溶液，对比例1～8得到的含0.1％TW20抗原溶液，含0.1％PVA80抗原溶液，含0.1％PVA203抗原溶液，含0.1％PVP(K30)抗原溶液，含0.1％PEG2000抗原溶液，含0.1％PEG4000抗原溶液，含0.1％PEG20000抗原溶液，含0.1％PEG100000抗原溶液，然后将成品试剂盒放置实验室恒温培养箱，温度设定为37℃，加速考核3天、7天、10天，正序放置，到时间点取出，与相同条件的未加速考核试剂一同检测临床样本。试剂盒与郑州安图生物工程股份有限公司的全自动化学发光仪AutoLumo A2000 Plus等仪器配套使用，可实现对样本的自动化检测，提供当天的检测样本信号值，基于磁微粒平台并通过HRP酶促化学发光进行发光值检测，并计算与未加速考核试剂的检测样本信号值比值。

以未加速试剂考核样本信号值的重复性。

稳定性检测比对数据如表1～3所示：

表137℃热加速第3天稳定性检测

表237℃热加速第7天稳定性检测

表337℃热加速第10天稳定性检测

结果表明，添加了泊洛沙姆的抗原溶液热加速3天、7天、10天的信号值比值均值稳定在95％以上，而添加其他组分的对比例试剂，热加速后信号值比值明显差于泊洛沙姆均值处于87％以下；并且吐温20随着热加速的延长，信号值比值一直处于下降趋势，表现不稳定。

重复性检测结果如表4所示：

表4重复性检测

结果表明，添加了泊洛沙姆后检测样本信号值的重复性也有0.5％的提升。

实施例2特异性检测

本发明所使用的试剂盒为呼吸道合胞病毒IgM抗体检测试剂盒(磁微粒化学发光法)；注册证编号：国械注准20203400075；产品批号：20220426；规格：100测试/盒。

1、在制备例1制得的含0.1％泊洛沙姆抗原溶液中加入氯化钠，得到含0、0.5、1mol/L氯化钠的0.1％泊洛沙姆抗原溶液，将试剂盒中的试剂2分别替换为含0、0.5、1mol/L氯化钠的0.1％泊洛沙姆抗原溶液。检测本底样本的信号值水平和37℃热加速第10天阳性样本信号值。本底信号值水平检测结果如表5所示，37℃热加速第10天阳性样本信号值如表6所示：

表5本底信号值水平

表637℃热加速第10天阳性样本信号值

结果表明，在抗原溶液中添加NaCL(实验中最高添加到了1.0mol/L)能改善特异性，有效降低本底信号值，本底信号均值从100多万降低至万级水平。但抗原稀释液中添加NaCL从0.15mol/L～1.0mol/L抗原溶液的热稳定性从降22％到降42％，造成抗原溶液的热稳定性变差；0.15mol/L及不添加不能解决特异性及本底问题。

2、在制备例2制得的酶结合物溶液中加入氯化钠，得到含0.15、0.3、0.5、1mol/L氯化钠的酶结合物溶液，将试剂盒中的试剂3替换为含0.15、0.3、0.5、1mol/L氯化钠的酶结合物溶液。检测样本信号值，结果如表7所示：

表7样本信号值

结果分析：将0.3mol/L NaCL添加到酶结合物溶液中也能起到同样降本底的效果，本底信号均值在10万以下，并且不影响抗原稳定性。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。