GW9662制备治疗非酒精性脂肪性肝炎药物的应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及GW9662制备治疗非酒精性脂肪性肝炎(NASH)药物的应用。

背景技术

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是世界范围内最常见的慢性肝病之一，影响全球至少1/4的人群。非酒精性脂肪性肝炎(NASH)是NAFLD的炎症亚型，伴有脂肪变性以及肝细胞损伤(气球样变)和炎症，伴有或不伴有纤维化。尽管NASH通常临床上无症状，但随着时间的推移，大约20％的NAFLD患者有NASH，随着时间的推移，其中约20％的NASH患者会发展为肝硬化，进而导致肝癌甚至需要肝移植。NASH与肥胖、血脂异常、2型糖尿病和代谢综合征密切相关，在代谢性疾病和肥胖患者中更为普遍。治疗的主要策略集中在控制饮食摄入和增加身体活动以减轻体重上，但通常患者依从性差，难以坚持，复发率高。尽管近年来NAFLD发病机制、治疗靶点和药物研发方面的研究取得稳步进展，但NAFLD治疗药物的研发基本都处在临床前或临床试验阶段，均未被批准用于NAFLD/NASH的治疗。

目前研究发现GW9662在富含脂肪、果糖和胆固醇的饮食(FFC)构建的NAFLD小鼠模型中，改善了胰岛素抵抗，减少toll样受体4(Tlr4)、骨髓分化初级反应88(Myd88)和白细胞介素1β(IL-1β)的表达以及亚硝酸盐(NO2-)浓度。

申请人在探究GW9662改善NASH的机制研究中发现，GW9662能通过抑制PPARγ/CD36通路，下调SCD1，FABP1，FASN，PDGFRα，α-SMA和Col1a1等改善肝脏脂质代谢，抑制脂肪酸转运及合成，促进脂肪酸的氧化，减轻肝纤维化以缓解CDAA-HFD饮食诱导NASH疾病进展。该结果目前尚未在国内外报道。

发明内容

基于此，本发明提供了一种GW9662在治疗肝脏疾病中的新用途。GW9662能有效改善肝脏脂质代谢，抑制脂肪酸转运及合成，促进脂肪酸的氧化，改善非酒精性脂肪性肝炎疾病进展。在目前缺乏特异性NASH治疗药物的前提下，GW9662的应用前景好。本发明是通过如下技术方案实现的：

本发明公开了GW9662在制备用于治疗非酒精性脂肪性肝炎药物中的应用。

本发明还公开了一种用于治疗非酒精性脂肪性肝炎的药物，该药物包括GW9662和制药学上可接受的载体、添加剂或/和赋形剂。

进一步地，所述GW9662通过抑制PPARγ/CD36通路，下调CDAA-HFD小鼠肝脏组织中SCD1的表达。

进一步地，所述GW9662通过抑制PPARγ/CD36通路，下调CDAA-HFD小鼠肝脏组织中FABP1的表达。

进一步地，所述GW9662通过抑制PPARγ/CD36通路，下调CDAA-HFD小鼠肝脏组织中FASN的表达。

进一步地，所述GW9662通过抑制PPARγ/CD36通路，下调CDAA-HFD小鼠肝脏组织中PDGFRα的表达。

进一步地，所述GW9662通过抑制PPARγ/CD36通路，下调CDAA-HFD小鼠肝脏组织中α-SMA的表达。

进一步地，所述GW9662通过抑制PPARγ/CD36通路，下调CDAA-HFD小鼠肝脏组织中Col1a1的表达。

进一步地，所述GW9662抑制脂肪酸转运及合成。

进一步地，所述GW9662促进脂肪酸的氧化。

本发明的有益效果在于：

申请人通过GW9662对非酒精性脂肪性肝炎小鼠肝脏的治疗实验，其结果表明，所述药物(化合物GW9662)可以抑制脂肪酸转运及合成，促进脂肪酸的氧化。因此，所述药物可通过抑制PPARγ/CD36通路，下调SCD1，FABP1，FASN，PDGFRα，α-SMA和Col1a1等改善肝脏脂质代谢，抑制脂肪酸转运及合成，促进脂肪酸的氧化，减轻肝纤维化以缓解CDAA-HFD饮食诱导NASH疾病进展。为NASH提供新的治疗策略。

附图说明

图1为本发明的技术路线图；

图2为本发明CDAA-HFD造模及GW9662处理时间轴；

图3A为GW9662对体重的影响；

图3B为GW9662对肝重的影响；

图3C为GW9662对血清转氨酶ALT、AST的影响；

图4A为肝脏病理染色；

图4B为肝脏病理染色分析；

图5A为GW9662对肝脏脂质合成和转运相关mRNA表达的影响；

图5B为GW9662对肝脏脂质氧化相关mRNA表达的影响；

图5C为GW9662对肝脏炎症相关mRNA表达的影响；

图5D为GW9662对肝脏纤维化相关mRNA表达的影响。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1

本实施例实验GW9662购买自MCE公司；

C57BL/6N小鼠购于北京维通利华公司；

ALT，AST，FFA，TG，HYP检测试剂盒购自南京建成公司；

引物设计及合成由擎科生物公司完成；

PCR实验相关试剂购买自TAKARA公司；

本实施例实验所用其它试剂为市售的分析纯试剂。

技术路线图(附图1)

本发明通过在给C57BL/6N小鼠喂养胆碱缺乏、氨基酸定义的高脂肪饮食(CDAA-HFD)12周构建NASH模型，并给与GW9662治疗。造模结束后取材测定体重、肝重，血清转氨酶ALT、AST等，对小鼠肝脏进行病理切片染色，测定小鼠肝脏组织中mRNA表达水平。

动物处理(附图2)

在IVC房间适应性喂养30只7周龄的C57BL/6N雄性小鼠共一周，后转移至SPF房，随后将30只小鼠随机分为正常饮食组(Control组)、CDAA-HFD高脂饮食组(CDAA-HFD组)和GW9662组，每组10只。正常饮食组每天饲喂小鼠维持饲料，高脂饮食组和GW9662组饲喂CDAA-HFD饮食；正常对照组和高脂饮食组从第5周开始根据体重腹腔注射一定体积0.9％生理盐水，GW9662组从第5周开始每日腹腔注射1mg/kg体重GW9662。给药时间从第5周开始至第12周结束，持续8周。

实验结果

(1)NASH小鼠肝功能变化(附图3)

动物处理后，处死动物取肝脏称重，使用ALT，AST检测试剂盒测定血清中转氨酶含量。

结果如图3A所示，干预8周后与正常饮食相比较，CDAA-HFD饲喂小鼠的体重明显减轻，而GW9662治疗对小鼠体重没有明显影响。高脂饮食喂养小鼠的肝脏重量明显较正常饮食小鼠增加(p＜0.05)，而GW9662治疗后，肝脏重量无明显改变(图3B)。CDAA-HFD组小鼠ALT升高了约4.8倍，AST升高了约3倍，提示CDAA-HFD喂养小鼠导致明显的肝功能异常。GW9662干预8周后显著改善了NASH小鼠的肝功能，与CDAA-HFD组小鼠相比，GW9662组小鼠ALT和AST分别降低了50.46％及34.73％(图3C)。

(2)NASH小鼠脂肪变和纤维化(附图4)

实验结束后处死小鼠取肝脏固定，石蜡包埋，切片行病理染色，镜下观察各组间肝脏组织学的改变。

如图4所示，经过HE和油红O染色后，对照组小鼠肝脏组织显示出完整的小叶结构，细胞质均匀，不存在肝细胞变性；与正常饮食小鼠相比，CDAA-HFD饲喂小鼠的肝脏可见大量脂肪变性肝细胞密集分布，呈中度脂肪变(脂肪变性程度分类：0-33％为轻度；33％-66％为中度；＞66％为重度)，肝细胞中含有大量大小不一的圆形空泡，肝细胞肿胀将胞核挤向一侧。相较于高脂饮食组，GW9662组肝脏中空泡明显减少，呈轻度脂肪变，只剩少量脂滴小空泡存在。SR染色切片显示，Control组观察到明晰的肝小叶结构和正常的肝细胞形态，门管区几乎未见结缔组织；CDAA-HFD组肝索结构紊乱，窦周大量纤维组织增生，胶原沉积，偶尔可见桥接型纤维化，纤维化分级分布在F2/3等级(纤维化分级：F0，无明显纤维化；F1，肝窦或门静脉周围纤维化；F2肝窦和门静脉或汇管区纤维化；F3桥接型纤维化；F4，肝硬化)；GW9662治疗过后的肝脏纤维化明显减轻，胶原沉积减少，纤维化分级以F1居多。与CDAA-HFD组相比，GW9662组的油红O染色面积降低了68.81％。

使用TG，FFA，HYP检测试剂盒测定小鼠肝脏中TG，FFA，HYP含量。

在CDAA-HFD组中FFA和TG含量相较于正常饮食组显著升高(P＜0.01)，在GW9662治疗后小鼠肝脏中FFA和TG含量均显著下降(P＜0.05，P＜0.01)，肝脏脂质蓄积明显被抑制，GW9662治疗明显减少了NASH小鼠的脂肪变性(图3B)。对小鼠肝脏的病理切片进行胶原比例面积(CPA)分析，CDAA-HFD饮食饲喂小鼠后，肝脏胶原比例面积显著升高了12.2倍，而在GW9662治疗过后，肝脏胶原比例面积显著下降了49.95％。小鼠肝脏中羟脯氨酸(HYP)含量变化同肝脏病理切片表现一致，CDAA-HFD饮食引起肝脏纤维化程度增加，HYP含量显著增高2.38倍，而在GW9662治疗后降低了20.22％。我们通过NAFLD活性评分(NAS)来评估小鼠脂肪性肝炎的病变程度。如图4所示，CDAA-HFD组小鼠NAS相较于Control组小鼠升高至5.50±0.88，在GW9662治疗后NAS下降了24.91％。

(3)NASH小鼠的潜在机制(附图5)

通过对小鼠肝脏组织提取mRNA，进行定量聚合酶链式反应(qPCR)实验，检测GW9662对NASH小鼠脂质代谢和纤维化相关基因的调控。

qPCR结果显示在图5，和Control组相比，CDAA-HFD组肝脏PPARγ，CD36，FABP1，LPL，FASN的mRNA表达量显著增加，表明高脂饮食促进了肝脏脂质转运及合成基因表达的升高，在GW9662干预后，PPARγ，CD36，LPL，FASN相对于CDAA-HFD组显著下降(图5A)；而脂肪酸氧化相关基因PPARα的水平在CDAA-HFD组降低，GW9662治疗过后肝脏PPARα表达量恢复至正常水平，高脂饮食饲喂下调了ACOX1的表达，GW9662治疗对其没有影响(图5B)。其次，CDAA-HFD组中TNF-α，NF-κB和F4/80的表达水平较正常组显著上调；GW9662组的改变和高脂饮食组相比没有统计学意义，IL-1和IL-6的表达水平在三组中均无显著变化(图5C)。在基因水平，提示肝脏纤维化程度的基因PDGFRα，α-SMA和Col1a1在高脂饮食组显著上调，GW9662治疗明显下调了小鼠肝纤维化基因(图5D)。

需要说明的是上述实施例仅仅是本发明的较佳实施例，并没有用来限定本发明的保护范围，在上述基础上做出的等同替换或者替代均属于本发明的保护范围。