一株假小链双歧杆菌及其应用

技术领域

本发明属于微生物的技术领域，具体地涉及一株假小链双歧杆菌及其应用。

背景技术

人体皮肤上栖息着各种细菌、真菌、病毒，还有螨虫等小型节肢动物，它们的集合形成皮肤微生物组或皮肤菌群。皮肤微生物组与皮肤表面的细胞、汗液、皮脂等物质，以及外界环境共同组成一个生态系统，对于维持宿主皮肤健康有重要作用。这些常驻微生物可以直接或通过调控皮肤的角质形成细胞而间接分泌抗菌肽，抗菌肽是指所有能够杀菌或抑菌的寡肽或多肽，它是—类天然免疫系统的效应分子，能够接触微生物膜，溶解细胞，具有广谱抗微生物作用。

大多数皮肤上的微生物与人体互利共生、相互影响。一方面，我们的皮脂、死亡的角质细胞为微生物提供了充足的养分；另一方面，微生物群维持着皮肤的正常结构，抵御外来病原体的入侵，促进皮肤的免疫反应和伤口的再生修复。这些微生物，主要存在于皮肤表面，以及皮肤附属器中，比如毛囊、汗腺及皮脂腺等，最有代表性的微生物包括丙酸杆菌属、棒状杆菌属、葡萄球菌属和马拉色菌属。常驻菌可以产生脂类、固醇类等物质，为肌体细胞提供营养，参与皮肤细胞代谢等，代谢的脂质可以在皮肤上形成一层乳化脂质膜，能防止水分过度蒸发，保持皮肤湿润。皮肤微生态的重要性，体现在整个微生态体系的动态平衡上，当人体的皮肤、环境和菌群处于不协调的状态时，就会呈现出皮肤问题甚至产生皮肤疾病。

二裂酵母发酵产物滤液和二裂酵母发酵溶胞产物目前已经录入《已使用化妆品原料名称目录》2021版，其菌属为双歧杆菌属(Bifidobacterium)，是一种革兰氏阳性、细胞呈杆状、一端有时呈分叉状的厌氧细菌。提供一种利用二裂酵母发酵产物技术开发的皮肤益生菌相关产品，具有巨大的商业应用价值。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的是提供了一株假小链双歧杆菌及其应用。

本发明的其一目的是提供了假小链双歧杆菌(Bifidobacteriumpseudocatenulatum)，该菌株被命名为LABOFMIC-320，已于2022年9月20日保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC No:M 20221460的假小链双歧杆菌。

较佳地，采样于健康男童粪便中，将样品适当处理后于生理盐水中震荡混匀，取上清划线于BBL固体平板，37℃厌氧培养48h后，挑取白色菌落反复接种筛选，直至得到均匀的单个菌落，命名为LABOFMIC-320；

显微镜下呈杆状；在BBL平板上生长，可形成乳白色、表面光滑、半透明、圆形小菌落，边缘整齐；在BBL液体培养基中呈均匀浑浊生长，久置菌体呈白色沉淀。

本发明的另一目的是提供了上述假小链双歧杆菌在制备改善皮肤状况的产品中的应用，其中，所述改善皮肤状况包括促进细胞增殖、修护皮肤屏障、保湿、抗衰老、提高皮肤抗菌能力中的至少一种。

一些实施方案中，所述促进细胞增殖包括促进皮肤角质细胞和/或成纤维细胞的增殖。

其中，本发明以HaCaT角质细胞为受试对象，对假小链双歧杆菌的促进细胞增殖效果进行研究。结果表明，假小链双歧杆菌可修复SDS引起的HaCaT角质细胞损伤，提高细胞增殖率，促进增殖率为28.05％～29.17％。

其中，本发明以HFF成纤维为受试对象，对假小链双歧杆菌的促进细胞增殖效果进行研究。结果表明，假小链双歧杆菌可促进HFF细胞增殖，促进增殖率为30.28％～34.81％。

一些实施方案中，所述修护皮肤屏障包括修复SDS诱导的细胞损伤和/或上调屏障修护相关基因的表达；所述屏障修护相关基因包括FLG。

其中，本发明以HaCaT细胞为受试对象，对假小链双歧杆菌的SDS损伤修复能力进行了研究。结果表明，假小链双歧杆菌可修复SDS引起的细胞损伤，提高细胞增殖率，并上调非损伤细胞的屏障修护相关基因的表达。

一些实施方案中，所述保湿包括上调保湿相关基因GBA的表达。

其中，本发明以HaCaT细胞为受试对象，研究假小链双歧杆菌的对皮肤的保湿效果。结果显示，假小链双歧杆菌可上调保湿相关基因GBA的表达，促进皮肤细胞保湿。

一些实施方案中，所述抗衰老包括下列所示表达中的至少一种：

a).所述抗衰老包括上调细胞外基质合成相关基因的表达，所述细胞外基质合成相关基因包括TIMP1、SPTSSA中的至少一种；

b).所述抗衰老包括下调细胞外基质降解相关基因的表达，所述细胞外基质降解相关基因包括MMP家族基因MMP8、MMP10中的至少一种；

c).所述抗衰老包括上调细胞抗氧化相关基因NRF2、SIRT-1、SIRT-3的表达；

d).所述抗衰老包括下调细胞凋亡相关基因的表达；所述细胞凋亡相关基因包括BAX和/或Caspase家族Caspase-3、Caspase-9中的至少一种；

e).所述抗衰老包括上调细胞自噬相关基因LC3B的表达。

f).所述抗衰老包括上调细胞生长因子相关基因FGF1、FGF2的表达。

需要说明的是，为了探究假小链双歧杆菌的抗衰老效果，本发明对细胞衰老相关的指标进行了测定，相关的指标包括细胞外基质合成、细胞外基质降解、细胞抗氧化、细胞凋亡、细胞自噬及细胞生长因子中的至少一个。

其中，本发明以HaCaT角质细胞为受试对象，研究假小链双歧杆菌对HaCaT角质细胞细胞外基质合成相关基因和降解相关基因的影响。结果表明，假小链双歧杆菌可上调细胞外基质合成相关基因TIMP1的表达，促进细胞外基质的合成。

其中，本发明以HFF成纤维细胞为受试对象，研究假小链双歧杆菌对HFF成纤维细胞外基质合成相关基因和降解相关基因的影响。结果表明，假小链双歧杆菌可上调细胞外基质合成相关基因SPTSSA的表达，促进细胞外基质的合成；下调细胞外基质降解相关基因MMP8、MMP10的表达，抑制细胞外基质的降解。

其中，本发明以HaCaT角质细胞为受试对象，研究假小链双歧杆菌对HaCaT角质细胞抗氧化相关基因的表达的影响。结果表明，假小链双歧杆菌可上调抗氧化相关基因NRF2的表达，增强细胞的抗氧化能力。

其中，本发明以HFF成纤维为受试对象，研究假小链双歧杆菌对HFF成纤维抗氧化相关基因的表达的影响。结果表明，假小链双歧杆菌可上调抗氧化相关基因SIRT-1和SIRT-3的表达，增强细胞的抗氧化能力。

其中，本发明以HFF成纤维为受试对象，研究假小链双歧杆菌对HFF成纤维凋亡的影响。结果表明，假小链双歧杆菌可下调细胞凋亡相关基因BAX、Caspase-3、Caspase-9的表达，抑制细胞凋亡。

其中，本发明以HaCaT角质细胞为受试对象，研究假小链双歧杆菌对HaCaT角质细胞细胞自噬的影响。结果表明，假小链双歧杆菌可上调细胞自噬相关基因LC3B的表达，促进细胞自噬以清除老化细胞。

其中，本发明以HFF成纤维细胞为受试对象，研究假小链双歧杆菌对HFF成纤维细胞生长因子相关基因的表达的影响。结果表明，假小链双歧杆菌可上调成纤维细胞生长因子相关基因FGF1、FGF2的表达，促进细胞生长。

一些实施方案中，所述提高皮肤抗菌能力包括上调抗菌肽相关基因S100A7、S100A8、DEFB4、LCN-2的表达。

其中，本发明以HaCaT角质细胞为受试对象，研究假小链双歧杆菌对HaCaT角质细胞抗菌肽相关基因的表达的影响。结果表明，假小链双歧杆菌可上调抗菌肽相关基因S100A7、S100A8、DEFB4、LCN-2的表达，增强皮肤抗菌能力。

本发明的另一目的是提供了一种改善皮肤状况的产品，由包括上述假小链双歧杆菌原料制成；所述产品为食品、药品或化妆品，所述产品中的假小链双歧杆菌包括如下所示的至少一种：

(1)假小链双歧杆菌的菌群和/或菌剂；

(2)假小链双歧杆菌的培养物、外泌体、溶胞物和/或提取物。

进一步的，所述产品还包括含有上述假小链双歧杆菌的菌群。

进一步的，所述产品包括含有上述假小链双歧杆菌及其溶胞物、提取物、代谢产物制成的菌剂，或者含有上述假小链双歧杆菌的菌群制成的菌剂。

进一步的，所述产品的剂型包括膏霜类、乳液类、油剂类、水剂类、凝胶类、粉剂类、冻干类中的至少一种。

本发明的另一目的是提供了一种改善肌肤状态的方法，其包括使用本发明所述从产品。所述使用的方法包括涂抹、外敷、熏蒸或注射。

本发明公开的假小链双歧杆菌(Bifidobacterium pseudocatenulatum)LABOFMIC-320，其保藏编号为CCTCC No:M 20221460的假小链双歧杆菌。实验表明，本发明提供的假小链双歧杆菌具有促进细胞增殖、修护皮肤屏障、保湿、抗衰老、提高皮肤抗菌能力的功能，可用于制备食品、药品、化妆品等。

生物保藏说明

假小链双歧杆菌(Bifidobacterium pseudocatenulatum)LABOFMIC-320，于2022年9月20日保藏在中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址为:武汉市武昌区八一路299号，武汉大学，邮编430072)，其保藏编号为CCTCC No:M20221460。

具体实施方式

本发明提供了假小链双歧杆菌及其应用。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明的假小链双歧杆菌菌株LABOFMIC-320，来源于2岁健康男童粪便，经16SrDNA鉴定为假小链双歧杆菌(Bifidobacterium pseudocatenulatum)。该菌株革兰氏阳性，显微镜下呈杆状；在BBL平板上生长，可形成表面光滑半透明的圆形菌落，乳白色，边缘整齐；在BBL液体培养基中呈均匀浑浊生长，久置菌体呈白色沉淀，最适生长温度37℃。

假小链双歧杆菌(Bifidobacterium pseudocatenulatum)LABOFMIC-320，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，保藏日期：2022年9月20日，保藏编号为CCTCC NO:M20221460。

本发明提供的假小链双歧杆菌LABOFMIC-320在本发明所述应用或产品中,存在形式是活的或死的或经间歇灭菌的，或为发酵溶胞产物和/或提取物的形式，或为细菌产物的形式或为发酵滤液形式或衍生物形式，所述衍生物形式优选地选自：代谢产物、代谢生物产物、外泌体、益生素、细胞壁及其成分、胞外多糖，和含有免疫原性成分的化合物，优选地选自：发酵滤液和发酵溶胞产物。

本发明采用的试材皆为普通市售品，均可市售购买得到，下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1LABOFMIC-320的分离

采样于于2岁健康男童粪便中采样。将样品适当处理后于生理盐水中震荡混匀，取上清划线于BBL固体平板，37℃厌氧培养48h后，挑取白色菌落反复接种筛选，直至得到均匀的单个菌落，命名为LABOFMIC-320。

革兰氏染色镜检：菌株LABOFMIC-320为革兰氏染色阳性，显微镜下呈杆状；在BBL平板上生长，可形成乳白色、表面光滑、半透明、圆形小菌落，边缘整齐；在BBL液体培养基中呈均匀浑浊生长，久置菌体呈白色沉淀。

实施例2LABOFMIC-320的核酸鉴定

1、16S rDNA基因序列分析：

挑取单菌落置BBL液体培养基中，37℃厌氧培养过夜后，12000r/min转速离心1min收集菌体，按照DNA提取试剂盒步骤进行操作。引物采用细菌通用引物27F、1492R、PCR扩增体系为50μL体系，95℃预变性5min；94℃、15s，57℃、15s，72℃、40s，35个循环；72℃延伸10min。

2、结果

PCR产物测序结果与GenBank中已发表的标准序列进行同源性比较(BLASTN)后得出LABOFMIC-320菌株为假小链双歧杆菌(Bifidobacterium pseudocatenulatum)。

实施例3LABOFMIC-320促进SDS诱导的人永生化角质形成细胞HaCaT损伤修复实验

1、LABOFMIC-320发酵滤液制备：

挑取假小链双歧杆菌LABOFMIC-320单菌落于BBL液体培养基，37℃厌氧培养箱静置培养16h～18h，酶标仪检测并以PBS稀释调整OD

2、促进HaCaT细胞修复实验

接种HaCaT细胞(5×10

细胞增殖率计算公式及结果如下表：

上表结果可知，LABOFMIC-320发酵滤液可促进可修复SDS引起的HaCaT角质细胞损伤，提高细胞增殖率，促进增殖率为28.05％～29.17％。

实施例4LABOFMIC-320促进HaCaT屏障修护相关基因表达实验

1、LABOFMIC-320发酵溶胞产物的制备：

挑取假小链双歧杆菌LABOFMIC-320单菌落于BBL液体培养基，37℃厌氧培养箱静置培养16h～18h，酶标仪检测并以PBS稀释调整至OD

2、促进HaCaT屏障修护相关基因表达实验

接种人永生化角质形成细胞HaCaT(2ml/孔，内含5×10

公式：F＝2

△CT

△CT

△△CT＝△CT

发酵溶胞产物上调修复相关基因FLG的表达。结果见下表：

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体外细胞实验表明，本发明的假小链双歧杆菌LABOFMIC-320发酵溶胞产物具有上调皮肤屏障修护相关因子丝聚合蛋白基因FLG表达的作用，基因表达量上调1.18～1.34倍。表明LABOFMIC-320具有促进皮肤屏障修护的作用。

实施例5LABOFMIC-320上调HaCaT保湿相关基因表达实验

1、LABOFMIC-320发酵滤液和发酵溶胞产物的制备：

制备方法参照实施例3和4。

2、上调HaCaT保湿相关基因表达实验

接种人永生化角质形成细胞HaCaT(2ml/孔，内含5×10

结果见下表：

体外细胞实验表明，本发明的假小链双歧杆菌LABOFMIC-320具有上调保湿相关的葡萄糖脑苷脂酶基因GBA表达的作用，基因表达量上调1.13～1.50倍。表明LABOFMIC-320具有促进皮肤保湿的作用。

实施例6LABOFMIC-320调节光老化HaCaT细胞外基质/细胞自噬/抗氧化相关基因表达实验

1、LABOFMIC-320发酵滤液及发酵溶胞产物制备：

制备方法参照实施例3和4。

2、HaCaT细胞制备及紫外线损伤

将HaCaT细胞消化后以0.5ml/孔(内含2×10

3、LABOFMIC-320添加

将5％(V/V)发酵产物、10％(V/V)溶胞物分别加入刺激过的HaCaT细胞(对照组分别以等体积PBS替代发酵滤液/发酵溶胞产物)。每组3平行，37℃培养过夜。

4、qPCR法检测细胞外基质/细胞自噬/抗氧化相关基因相对表达倍数

将上述细胞弃去培养基后，加入裂解液，提取细胞总RNA，检测RNA浓度及纯度后反转录为cDNA，以GAPDH为内参基因，采用实时qPCR检测细胞外基质相关基因COL1A1，抗氧化相关基因NRF2，细胞自噬相关基因LC3B，以及细胞外基质降解相关基因MMP1的表达。以对照组基因相对表达倍数F＝1，利用2

发酵滤液上调细胞外基质相关基因TIMP1和细胞自噬相关基因LC3B以及抗氧化相关基因NRF2。结果见下表：

发酵溶胞产物上调细胞外基质基因TIMP1和抗氧化相关基因NRF2。结果见下表：

体外细胞实验表明，本发明的假小链双歧杆菌LABOFMIC-320具有上调HaCaT细胞外基质相关的组织金属蛋白酶抑制物1基因TIMP1和细胞自噬相关的微管相关蛋白1轻链3β基因LC3B，以及抗氧化相关的核因子E2相关因子2基因NRF2表达的作用，基因相对表达倍数1.12～1.43。

实施例7LABOFMIC-320促进人成纤维细胞HFF的增殖

1、LABOFMIC-320发酵滤液及发酵溶胞产物的制备：

制备方法参照实施例3和4。

2、HFF细胞制备及LABOFMIC-320添加

接种以DMEM培养的HFF细胞，以100μl/孔(每孔含3×104细胞)转接至96孔板，过夜培养至细胞贴壁。配制200μM H

计算公式及结果如下表。

体外细胞实验表明，本发明的假小链双歧杆菌LABOFMIC-320具有促进人成纤维细胞HFF增殖的作用，增殖率30.28％～34.81％。

实施例8LABOFMIC-320调节氧化损伤HFF细胞外基质/抗氧化/细胞凋亡/细胞生长因子相关基因表达实验

1、LABOFMIC-320发酵滤液及发酵溶胞产物制备：

制备方法参照实施例3和4。

2、HFF细胞制备及H

将DMEM培养的HFF细胞消化后以0.5ml/孔(内含2×10

3、LABOFMIC-320添加

将发酵滤液5％(V/V)、发酵溶胞产物10％(V/V)分别加入刺激过的HFF细胞(对照组分别以等体积PBS替代发酵滤液/发酵溶胞产物)。每组3平行，37℃培养过夜。

4、qPCR法检测细胞外基质/抗氧化/细胞凋亡/细胞生长因子相关基因相对表达倍数

将上述细胞弃去培养基后，加入裂解液，提取细胞总RNA，检测RNA浓度及纯度后反转录为cDNA，以GAPDH为内参基因，采用实时qPCR检测细胞外基质相关基因SPTSSA，抗氧化相关基因SIRT-1、SIRT-3，细胞生长因子相关基因FGF1、FGF2以及降解细胞外基质相关基因MMP家族和细胞凋亡相关基因Caspase家族和BAX的表达。以对照组基因相对表达倍数F＝1，利用2

发酵滤液上调细胞外基质相关基因SPTSSA，抗氧化相关基因SIRT-1、SIRT-3，细胞生长因子相关基因FGF1、FGF2；下调降解细胞外基质相关基因MMP家族，细胞凋亡相关基因Caspase家族和BAX，结果见下表：

发酵溶胞产物下调降解细胞外基质相关基因MMP家族，细胞凋亡相关基因Caspase家族和BAX。结果见下表：

体外细胞实验表明，本发明的假小链双歧杆菌LABOFMIC-320具有上调HFF细胞外基质相关的丝氨酸棕榈酰转移酶基因SPTSSA，抗氧化相关的Sirtuins蛋白家族基因SIRT-1和SIRT-3，以及细胞生长因子相关的成纤维细胞生长因子基因FGF1、FGF2表达的作用，基因相对表达倍数1.12～1.37倍；具下调降解细胞外基质相关的基质金属蛋白酶家族基因MMP，细胞凋亡相关的BCL2-Associated X蛋白基因BAX和半胱氨酸蛋白酶家族基因Caspase，基因相对表达倍数0.40～0.83。

实施例9 LABOFMIC-320上调HaCaT抗菌肽相关基因表达实验

1、LABOFMIC-320发酵溶胞产物制备：

制备方法参照实施例4。

2、HaCaT细胞制备

将HaCaT细胞消化后以0.5ml/孔(内含2×10

3、LABOFMIC-320添加及LPS刺激

将发酵溶胞产物10％(V/V)分别加入培养过夜的HaCaT细胞(对照组以等体积PBS替代发酵溶胞产物)。2h后添加0.5ml浓度为0.2μg/ml的LPS溶液，诱导细胞发炎，5％二氧化碳培养箱37℃培养20h。

4、qPCR法检测抗菌肽相关基因相对表达倍数

将上述细胞弃去培养基后，加入裂解液，提取细胞总RNA，检测RNA浓度及纯度后反转录为cDNA，以GAPDH为内参基因，采用实时qPCR检测S100A7、S100A8、DEFB4、LCN-2基因的表达。以等体积PBS处理组为对照(基因相对表达倍数F＝1)，利用2

结果见下表：

LABOFMIC-320发酵溶胞产物上调抗菌肽相关基因的表达

体外细胞实验表明，本发明的假小链双歧杆菌LABOFMIC-320发酵溶胞产物具有上调抗菌肽相关银屑病素基因S100A7、钙粒蛋白基因S100A8、β防御素4基因DEFB4、脂质运载蛋白-2基因LCN-2表达的作用。基因相对表达倍数1.15～5.01。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。