鳄鱼源达卡气单胞菌phoBR和kdpE基因缺失株、回补株及其构建方法和应用

技术领域

本发明涉及一种鳄鱼源达卡气单胞菌phoBR和kdpE基因缺失株及其回补株，还涉及该缺失株和回补株的构建方法和应用。本发明属于生物技术领域。

背景技术

鳄鱼(crocodile)是一种属于爬行纲鳄目的动物，目前在世界上发现的有鳄科、食鱼鳄科和短吻鳄科三科。养殖鳄鱼带来很高的食用、药用及经济价值(唐樑，2007；肖琨，2014；王平，2011；陆桥，2011)。目前海南凭借优质的地理气候环境，有多个鳄鱼养殖场，成为国内主要的鳄鱼养殖省份(陈海艳，2011)，养殖品种大多是暹罗鳄。暹罗鳄被认为是世界上研究最少、最濒危的鳄鱼目之一(Bezuijen et al.,2013；Thorbjarnarson et al.,1992；sam etal.,2015)。

鳄鱼会食用各种各样的猎物，不仅包括各种动物甚至还有腐烂的肉(Daltryetal.,2003)，并且生存环境中存在各种病原体，但野生鳄鱼却少发现细菌、病毒感染的情况(Jeyamogan et al.,2017)，这归功于其强大的免疫系统。鳄鱼血有较好的抗菌(Merchant et al.,2004)、抗肿瘤(赓迪等，2012)、抗氧化(黄和平等，2014)效果。有相关研究发现鳄鱼的血清可对革兰氏阴性菌如肺炎克雷伯杆菌、鼠伤寒沙门氏菌和铜绿假单胞菌等产生有效的抗菌活性(Leelawongtawon etal.,2010)。

达卡气单胞菌(Aeromonas dhakensis)是一种流行于热带与亚热带、感染人及动物的新发传染病的病原细菌。该菌在热带与亚热带地区已有多例人与动物感染的报道，2016年我们实验室也在海南鳄鱼养殖场发病的幼年鳄鱼中分离到该菌，其对鳄鱼养殖业危害日益严重(王爱媛，2019)。

目前研究发现，气单胞菌感染后致死的通常为幼鳄(Turutoglu et al.,2004；Turutoglu et al.,2005；Thongkamkoon et al.,2018)。温和气单胞菌与衣原体联合感染后会引起鳄鱼的全身性疾病，特别是肝脾的损伤；在感染嗜水气单胞菌后，会导致鳄鱼败血症；达卡气单胞菌感染后的症状类似，造成鳄鱼群的菌血症爆发，以及出现肝脏出血、肺部栓塞的症状(Guo et al.,2018；Pu et al.,2019；Rehman etal.,2019)。2016年，海南鳄鱼养殖业因为达卡气单胞菌感染，造成仔鳄鱼大量死亡，经济损失巨大(Pu etal.,2019)，因此，对鳄鱼病原学及防治的研究有重要意义。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种鳄鱼源达卡气单胞菌phoBR和kdpE基因缺失株及其回补株。

本发明的目的之二在于提供上述基因缺失株及其回补株的构建方法。

本发明的目的之三在于提供上述基因缺失株及其回补株的应用。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

本发明提出的一种鳄鱼源达卡气单胞菌phoBR和kdpE基因缺失株或其回补株，所述的鳄鱼源达卡气单胞菌phoBR和kdpE基因缺失株是在达卡气单胞菌野生株的基础上同时缺失了phoBR和kdpE基因后得到的，命名为ΔphoBRΔkdpE；所述的回补株是在所述的鳄鱼源达卡气单胞菌phoBR和kdpE基因缺失株的基础上回补表达kdpE基因后得到的，命名为ΔphoBRΔkdpE+CkdpE。

其中，优选的，所述的回补株组成型表达kdpE。

其中，优选的，所述的达卡气单胞菌野生株为A.dhakensis C160501。

进一步的，本发明还提出了一种构建所述的鳄鱼源达卡气单胞菌phoBR和kdpE基因缺失株或其回补株的方法，包括以下步骤：

(1)设计引物，送由公司合成，引物序列如下所示：

kdpE up-F： GCTCTAGAACCCTGTCGGTCTATTTTCTGG

kdpE up-R： CGAGCTGGAGGTTGATGATGTTTCACGTGG

kdpE down-F： TCAACCTCCAGCTCGCTGAT

kdpE down-R： CGAGCTCAACCGGGACAGACCGAC

ΔkdpE-F： TGGTTATCTCGGGGTATTTG

ΔkdpE-R： CTGTCTCCCACGATTTGAA

F0： ACCAGGCCATCACCTTCTTTA

R0： AGTTGCTGCATGGACAGGCC

pRE112-F： ACCGTAACACGCCACATCTT

pRE112-R： GCTTCCCTGCTGTTTTGTGG

kdpEDB-F： TCAGCTGCCGATAAAGCGGTAGCCG

kdpEDB-R： ATGGCTCACATACTGGTCATCGACGACG

kdpEDQ-F： ACAAAATATTAACGCTCAGCTGCCGATAAAGCGG kdpEDQ-R： ACACAGGAAACAGCTATGGCTCACATACTGGTCATC pBBR1MCS-2Δ(lacZα)-F：AGCTGTTTCCTGTGTGAAATTG

pBBR1MCS-2Δ(lacZα)-R：GCGTTAATATTTTGTTAAAATTCGCG

pBBR-F： TATTTAACGACCCTGCCCTG

pBBR-R： ATCTCATGCTGGAGTTCTTCG

2kdpE-F： CTCTAGAGCTGCCGATAAAGCGGT

2kdpE-R： GCGAGCTCATGGCTCACATACTGGT

(2)达卡气单胞菌野生株基因组提取

将活化并鉴定完成的达卡气单胞菌野生株在37℃培养，选择细菌DNA提取试剂盒提取细菌的DNA基因组；

(3)目的片段的PCR扩增及纯化回收

1)kdpE基因上、下游同源臂扩增

以达卡气单胞菌野生株为模板，使用引物：kdpE up-F/R和kdpE down-F/R，分别扩增kdpE基因的上、下游同源片段；

2)PCR扩增片段的纯化回收

PCR完成后，使用1％琼脂糖凝胶电泳检验，如果得到的结果条带大小与目的条带大小一致，将带有目的条带的凝胶块切下来，然后使用胶回收/DNA纯化试剂盒纯化回收；

(4)kdpE基因上、下游同源臂的融合

根据互补配对原理，利用overlap PCR将kdpE基因上、下游同源片段重叠拼接起来，再利用引物kdpE up-F/kdpE down-R进行扩增融合后的片段，然后进行PCR产物的纯化回收；

(5)pRE112-ΔkdpE敲除质粒的构建

1)pRE112质粒提取

从-80℃冰箱内取出存在pRE112质粒的WM3064大肠杆菌，在含50μg/mL氯霉素的LB液体培养基活化培养后，使用诺唯赞的质粒DNA小提试剂盒提取质粒；

2)对融合片段和pRE112质粒双酶切

使用限制性内切酶FastDiges XbaⅠ和FastDigest SacⅠ分别对已经纯化回收后的融合片段和pRE112质粒双酶切，分别切胶回收纯化目标产物；

3)连接反应

T4连接酶连接进行了双酶切后回收纯化的上下游融合片段和pRE112质粒，得到重组质粒pRE112-ΔkdpE；

(6)pRE112-ΔkdpE重组质粒的转化

取连接液加入含WM3064大肠杆菌感受态细胞的EP管中，将pRE112-ΔkdpE重组质粒转化到WM3064大肠杆菌感受态细胞中；

(7)pRE112-ΔkdpE重组质粒的验证

1)使用融合片段的扩增引物kdpE up-F/kdpE down-R，对菌落进行菌落PCR，验证长出的菌落为含有pRE112-ΔkdpE重组质粒的阳性克隆；

2)双酶切鉴定：提取菌落PCR得到的正确条带的菌株质粒，做双酶切鉴定，经过凝胶电泳的鉴定条带大小一致后对条带纯化回收，送测序公司测序；

(8)ΔphoBRΔkdpE缺失株的构建

1)接合转移

活化存放在-80℃冰箱的达卡气单胞菌ΔphoBR缺失株和含有pRE112-ΔkdpE重组质粒的WM3064大肠杆菌，将得到的含有重组质粒pRE112-ΔkdpE的WM3064大肠杆菌与达卡气单胞菌ΔphoBR缺失株进行共培养，在此期间发生的接合转移，将重组质粒从大肠杆菌细胞内转移到达卡气单胞菌ΔphoBR缺失株中；

使用针对重组质粒为模板重新设计的引物pRE112-F/R，对长出的单菌落进行菌落PCR鉴定，经过凝胶电泳的鉴定条带大小一致，纯化回收并送测序；

2)筛选缺失株

取100μL过夜培养的含有pRE112-kdpE重组质粒的达卡气单胞菌ΔphoBR缺失株，加入900μL新鲜LB液体培养基；取100μL稀释后的菌液在含有20％蔗糖的LB固体平皿上涂布，37℃倒置培养12小时；使用引物kdpE up-F/kdpE down-R做菌落PCR鉴定，对正确的菌株扩培，做好菌种保存；

(9)达卡气单胞菌回补株ΔphoBRΔkdpE+CkdpE的构建

1)kdpE基因片段的扩增

以达卡气单胞菌野生株C160501DNA为模板，使用引物kdpEDB-F/R扩增kdpE基因片段并纯化回收；

2)无缝克隆

提取质粒pBBR1MCS-2后，使用ScaI单酶切，纯化回收保存，以单酶切后的pBBR1MCS-2为模板，利用引物pBBR1MCS-2Δ(lacZα)-F/R将其扩增，然后在线性化的质粒两端各选择一段合适大小的序列，通过重新设计的引物kdpEDQ-F/R将选择的序列连接到kdpE基因片段两端，得到kdpE搭桥片段，使得kdpE基因片段两端与载体上存在一段互补的碱基对，从而通过无缝克隆的方法，将kdpE基因片段连接到载体上；

3)pBBR1MCS-2Δ(lacZα)-kdpE回补质粒的转化

将pBBR1MCS-2Δ(lacZα)-kdpE回补质粒转到大肠杆菌WM3064感受态细胞，以长出的单菌落为模板，使用引物pBBR-F/R和kdpEDB-F/R分别PCR验证阳性克隆菌株；

4)回补株的筛选

通过存在pBBR1MCS-2Δ(lacZα)-kdpE回补质粒的大肠杆菌WM3064和ΔphoBRΔkdpE达卡气单胞菌进行接合转移，以得到的单菌落为模板，使用验证引物pBBR-F/R和在kdpE两端重新设计的验证引物2kdpE-F/R进行菌落PCR验证，得到回补株ΔphoBRΔkdpE+CkdpE。

更进一步的，本发明还提出了所述的鳄鱼源达卡气单胞菌phoBR和kdpE基因缺失株或其回补株在制备治疗或预防由达卡气单胞菌感染引发的疾病的药物中的应用。

其中，优选的，所述的药物为疫苗。

相较于现有技术，本发明的有益效果是

本发明首次构建了达卡气单胞菌的ΔphoBRΔkdpE缺失株及其回补株，缺失株及其回补株的遗传稳定。与野毒株和ΔphoBR缺失株相比，ΔphoBRΔkdpE缺失株生长无差异，但对抗菌肽的敏感性增强。免疫保护试验表明，ΔphoBRΔkdpE缺失株及其回补株的免疫保护率分别为43.30％以及55.60％。本发明为鳄鱼达卡气单胞菌病的减毒活疫苗的研究提供了技术手段。

附图说明

图1同源片段和ΔphoBR融合片段；

(a)1：上游片段；2：下游片段；M：DL 2000Marker；

(b)1:融合片段；M：DL 5000Marker；

图2双酶切的验证；

1：完整质粒；2：双酶切后的pK18mobsacB质粒；3：双酶切后的融合片段；4：融合片段；M：DL 5000Marker；

图3敲除质粒的PCR验证；

1～9：PCR产物；M：DL 5000Marker；

图4敲除质粒的双酶切鉴定；

1：pK18mobsacB-ΔphoBR质粒双酶切片段；2：pK18mobsacB-ΔphoBR重组质粒；

3：pK18mobsacB质粒；M：DL 5000Marker；

图5PCR验证敲除菌株；

1：敲除株；2：野生株；M：DL5000 bp；

图6上、下游同源臂片段的扩增；

M1：DL 2,000Marker；

1：上游同源臂；2：下游同源臂；

图7融合片段PCR验证及双酶切；

M2：DL 5,000Marker；1：同源臂融合片段；2：融合片段双酶切纯化产物

图8pRE112质粒双酶切；

M3：DL 15,000Marker；1：完整质粒；2：质粒双酶切纯化产物；

图9重组质粒的验证；

M3：DL 15,000Marker；1：pRE112质粒；2：pRE112-ΔkdpE重组质粒；3：重组质粒双酶切；4：重组质粒菌落PCR验证；M2：DL 5,000Marker；

图10PCR验证敲除菌株；

M2：DL 5,000Marker；1：F0/R0验证ΔphoBRΔkdpE缺失株；2：F0/R0验证野生株C160501；3：kdpE-F/R验证ΔphoBRΔkdpE缺失株；4：kdpE-F/R验证野生株C160501；

图11kdpE搭桥片段扩增及pBBR1MCS-2Δ(lacZα)；

M1：DL 2,000Marker；M2：DL 5,000Marker；1：kdpE搭桥片段；2：pBBR1MCS-2Δ(lacZα)；

图12回补质粒鉴定；

M1：DL 2,000Marker；(A)：1：pBBR1MCS-2质粒验证片段；(B)：2：kdpE片段；

图13回补菌株的菌落PCR；

(A)：M1：DL 2,000Marker；1：pBBR1MCS-2质粒验证片段；

(B)：M2：DL 5,000Marker；2：kdpE验证片段；

图14菌落PCR验证；

M2：DL 5,000Marker；1：pBBR1MCS-2质粒验证片段；

图15缺失株菌落PCR验证；

1-8：传代30代单菌落PCR产物；M2：DL 5,000Marker；9：原代缺失株菌落PCR产物；

10：野生株菌落PCR产物；11：阴性对照；

图16细菌的存活率差异；

图17腹部出血死亡斑马鱼。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步说明，其目的仅在于更好的理解本发明的研究内容而非限制本发明的保护范围。

实施例1ΔphoBR达卡气单胞菌单突变株的构建

1材料和方法

1.1实验材料

1.1.1菌株

A.Dhakensis C160501野生株分离自海南省养殖暹罗鳄，记载在文献(Pu,W.,G.Guo,N.Yang,Q.Li,F.Yin,P.Wang,J.Zheng,and J.Zeng."Three Species ofAeromonas(A.Dhakensis,A.Hydrophila and A.Jandaei)Isolated from Freshwater Crocodiles(Crocodylus Siamensis)with Pneumonia and Septicemia."Lett Appl Microbiol 68,no.3(2019):212-18.)中，由本实验室分离保存。

1.1.2实验引物

经过Primer Premier 6.0设计的相关引物序列如表1所示，均送测序公司合成。

表1本实施例的引物

1.2实验方法

1.2.1细菌基因组和总RNA的提取

(1)细菌基因组DNA的提取

对达卡气单胞菌C160501进行活化和扩大培养，然后按照附录中Vazyme公司的细菌基因组DNA提取试剂盒的说明书进行细菌基因组提取。

(2)细菌总RNA的提取

将达卡气单胞菌C160501于限磷条件下培养，分别在3h、4h、5h、6h和8h收取菌液，10,000rpm离心1min收集菌体，参考Vazyme公司的细菌RNA提取试剂盒说明书提取总RNA，具体步骤见附录。

1.2.2细菌质粒的提取

先在一定条件下对含有质粒的菌株进行活化和扩大培养，然后按照附录中Vazyme公司的质粒提取试剂盒说明书提取质粒。

1.2.3目的片段的PCR扩增及纯化回收

按照表2-3的PCR扩增体系和表2-4的反应条件扩增出相应的目的片段，再进行琼脂糖凝胶电泳来鉴定目的条带，切下正确的片段，参考Vazyme公司的凝胶回收试剂盒说明书进行纯化回收，具体步骤见附录。

1.2.4phoBR敲除质粒的构建

(1)PCR扩增phoBR基因的上下游片段

以达卡气单胞菌C160501基因组为模板，利用引物F1和R1进行PCR扩增出phoBR基因的上游同源片段，同时用引物F2和R2扩增出下游同源片段，然后分别进行纯化回收。

(2)phoBR基因上下游片段的搭桥PCR

通过搭桥PCR将phoBR基因的上下游同源片段连接成一个融合片段，再加入引物F1和R2大量扩增融合片段，最后进行融合片段的纯化回收。

(3)双酶切融合片段和pK18mobsacB质粒

用限制性内切酶FastDigest EcoR I和FastDigestHind III对纯化回收的融合片段和pK18mobsacB质粒进行双酶切，最后切胶纯化回收目标产物。

(4)连接反应

用T4 DNA连接酶将双酶切后纯化回收的pK18mobsacB质粒和上下游融合片段连接起来，将连接液混匀后快速离心，于22℃恒温水浴1.5h。

(5)连接液的转化

利用热激法，将上述连接液45秒热激转化到制备好的大肠杆菌X6097感受态中，加900μL LB液体培养基(50μg/mL DAP)，37℃培养1h后，离心弃上清，将剩下的转化产物涂布在LB平板(50μg/mLKan和50μg/mLDAP)上，培养过夜筛选阳性克隆。

(6)阳性克隆的筛选

在转化的抗性板中挑取单菌落与8μL ddH

(7)敲除质粒的双酶切鉴定

将PCR验证阳性的暂存菌液扩大培养后提取敲除质粒，进行双酶切验证；同时以pK18mobsacB质粒和阳性质粒作为对照，取3μL酶切后的样品跑1％琼脂糖凝胶电泳，根据片段大小判断phoBR敲除质粒是否构建成功。

1.2.5构建ΔphoBR突变株

(1)接合转移

①分别用5mL LB液体培养基(50μg/mLAmp)及5mL LB液体培养基(50μg/mL Kan和50μg/mL DAP)37℃活化培养达卡气单胞菌C160501和含敲除质粒的X6097菌大约12h，然后取菌液在LB平板上划线培养，再分别挑取单菌落加入LB液体培养基中，37℃培养过夜。

②按体积比为1：50的比例将菌液分别接种于新鲜的相应的LB液体培养基中，37℃培养至OD

③分别取出2mL菌液离心，取菌体，加新鲜LB液体培养基重悬。再次清洗。

④分别以1：1，1：3，3：1的比例将含敲除质粒的X6097大肠杆菌和C160501菌株混合，分开点在一个无抗LB平板上，培养一天。

⑤用2mL新鲜的LB培养基将三个点的菌苔一起刮下，稀释到合适的浓度，取50μL涂在LB平板(50μg/mLKan)上，过夜培养。

⑥用引物F3和R3进行PCR扩增鉴定阳性菌落。

(2)筛选和鉴定ΔphoBR突变菌株

①在含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基里扩大培养含有敲除质粒的达卡气单胞菌，37℃培养大约12h。

②以不同倍数的稀释菌液，吸30μL涂在LB平板(含20％蔗糖和50μg/mLAmp)上，培养过夜。

③用特别设计的F0和R0引物做菌落PCR验证双交换是否成功。

④将验证准确的敲除菌株接种于5mL LB液体培养基(50μg/mLAmp)，扩大培养12h。取一部分菌液，加入30％甘油，将菌种保存于-80℃。另一部分用来提取基因组，利用引物F0和R0进行基因组PCR，将PCR产物送至广州天一辉远有限公司进行测序。

2结果和分析

2.1ΔphoBR达卡气单胞菌突变株的构建

2.1.1phoBR上游和下游同源片段的扩增及融合

如图1所示，用C160501基因组PCR扩增phoBR基因两侧同源片段，图(a)的1片段大约在1027bp，为上游同源片段；2片段是下游同源片段，大小在923bp。图(b)是通过搭桥PCR将上、下游同源片连接而成1930bp的ΔphoBR融合片段，目的片段大小与预期相同。

2.1.2同源融合片段及pK18mobsacB质粒的双酶切

用FastDigest EcoR I和FastDigestHindIII同时对pK18mobsacB质粒和上下游融合片段进行双酶切并回收酶切产物。如图2所示，条带1代表大小为5721bp的pK18mobsacB完整质粒，条带2代表大小为5670bp的双酶切后pK18mobsacB质粒的回收产物，条带4代表大小为1934bp的phoBR基因上下游同源臂融合片段，条带3代表大小为1928bp的phoBR基因上下游同源臂融合片段双酶切后的回收产物，与预期相符。

2.1.3敲除质粒的鉴定

(1)在LB平板上挑取大小形态合适的单克隆菌落为模板，使用F1和R2引物进行菌落PCR，然后进行1％琼脂糖凝胶电泳验证PCR产物。如图3所示，第4、7、8、9泳道的PCR产物片段大小均为1928bp，符合预期。

(2)挑选经菌落PCR验证后的阳性质粒，用FastDigest EcoR I和FastDigestHindIII对质粒进行快速双酶切。如图4所示，第1泳道中双酶切得到的条带大小为1928bp和5670bp，第2、3泳道分别是pK18mobsacB-ΔphoBR重组质粒和pK18mobsacB质粒。

2.1.4ΔphoBR突变株的鉴定

利用特别设计的特异性引物F0和R0，菌落PCR鉴定ΔphoBR突变株，如图5所示，1条带为ΔphoBR突变株对应的PCR片段，大小为1315bp；2条带为野生株对应的PCR片段，大小为3270bp，可以得出由于phoBR基因缺失导致片段变短，与预期一样，因此达卡气单胞菌ΔphoBR突变株构建成功。

实施例2鳄鱼源达卡气单胞菌phoBR和kdpE基因缺失株、回补株的构建

1材料与方法

1.1实验材料

1.1.1模式动物

研究中所用的模式动物斑马鱼采买于海口市某水族馆，体态基本均一，在28-29℃的流动水箱内照Wester方法(Wester,1995)饲养一周，待斑马鱼存活率稳定后，进行后续实验。

1.1.2实验引物

Primer Premier 6.0设计引物，送由公司合成，序列详见表2。

表2实验相关引物

1.2实验方法

1.2.1菌株活化

首先从在-80℃环境中取达卡气单胞菌野生株C160501甘油管，接种10μL到LB液体试管中，37℃过夜培养后，接种环蘸菌液在LB固体平皿上划线分离培养，挑选线上单菌落使用引物F0/R0进行菌落PCR鉴定后培养。

1.2.2达卡气单胞菌野生株C160501基因组提取

将活化并鉴定完成的达卡气单胞菌野生株C160501在37℃培养，选择诺唯赞的细菌DNA提取试剂盒提取细菌的DNA基因组。

1.2.3目的片段的PCR扩增及纯化回收

(1)kdpE基因上、下游同源臂扩增

A.dhakensis C160501DNA为模板，使用引物：kdpE up-F/R和kdpE down-F/R，分别扩增kdpE基因的上、下游同源片段。

(2)PCR扩增片段的纯化回收

PCR完成后，使用1％琼脂糖凝胶电泳检验，如果得到的结果条带大小与目的条带大小一致，将带有目的条带的凝胶块切下来，然后使用诺唯赞胶回收/DNA纯化试剂盒纯化回收。

1.2.4kdpE基因上、下游同源臂的融合

根据互补配对原理，利用overlap PCR将kdpE基因上、下游同源片段重叠拼接起来，再利用引物kdpE up-F/kdpE down-R进行扩增融合后的片段，然后进行PCR产物的纯化回收。

1.2.5pRE112-ΔkdpE敲除质粒的构建

(1)pRE112质粒提取

从-80℃冰箱内取出存在pRE112质粒的WM3064大肠杆菌，在含氯霉素(50μg/mL)LB液体培养基活化培养后，使用诺唯赞的质粒DNA小提试剂盒提取质粒。

(2)对融合片段和pRE112质粒双酶切

使用限制性内切酶FastDiges XbaⅠ和FastDigest SacⅠ分别对已经纯化回收后的融合片段和pRE112质粒双酶切。将融合片段和质粒分别与限制性内切酶混合，37℃恒温水浴2小时，再放入65℃水浴锅中灭活10分钟，放在冰上保存。电泳仪跑胶判断酶切的程度，选择与预期的结果条带一致的，分别切胶回收纯化目标产物。

(3)连接反应

T4连接酶连接进行了双酶切后回收纯化的上下游融合片段和pRE112质粒，得到重组质粒pRE112-ΔkdpE。

1.2.6pRE112-ΔkdpE重组质粒的转化

①取5μL连接液加入含100μLWM3064大肠杆菌感受态细胞的EP管(已经在冰上冰浴5分钟)中，轻轻摇晃混匀后放到提前准备好的冰上冰浴30分钟。

②将冰浴后的混合液转移至已预热到42℃的恒温水浴锅内，利用热激法，50-60秒后立刻放在冰上2-3分钟。

③向混合液中加入LB液体培养基(含有50μg/mL的2，6二氨基庚二酸)900μL，放入37℃恒温摇床内1.5小时后取出。

④培养好的菌液放入离心机6000rpm离心6分钟，无菌操作弃去900μL上清液后，混匀菌体沉淀和剩余上清液后涂布到含有50μg/mL的2，6二氨基庚二酸和50μg/mL的氯霉素的LB固体平皿上，37℃培养12小时。

1.2.7pRE112-ΔkdpE重组质粒的验证

(1)菌落PCR鉴定：挑取培养基上的单菌落在含有50μg/mL的2，6二氨基庚二酸和50μg/mL的氯霉素的LB固体培养基上划线以保存菌株，再将部分菌体融于3μL已灭菌的去离子水中，微波炉加热5-8分钟，冷却后加入融合片段的扩增引物kdpE up-F/kdpE down-R，对菌落进行菌落PCR，验证长出的菌落为含有pRE112-ΔkdpE重组质粒的阳性克隆。

(2)双酶切鉴定：提取菌落PCR得到的正确条带的菌株质粒，做双酶切鉴定，经过凝胶电泳的鉴定条带大小一致后对条带纯化回收，送测序公司测序。

1.2.8ΔphoBRΔkdpE缺失株的构建

(1)接合转移

①活化存放在-80℃冰箱的达卡气单胞菌ΔphoBR缺失株和含有pRE112-ΔkdpE重组质粒的WM3064大肠杆菌。

②活化后将两株菌重新接种至新的培养基内培养至OD

③两株菌分别取1.5mL菌液，离心机4000rpm，10分钟，弃去上清。

④向管内加入2mL新鲜LB液体培养基，重复③。

⑤取一定量的新鲜LB液体培养基加入有达卡气单胞菌ΔphoBR缺失株菌体的EP管内，重悬菌体，吸出部分菌液加入有WM3064大肠杆菌的EP管内，重悬管底的菌体沉淀。保证达卡气单胞菌ΔphoBR缺失株和WM3064大肠杆菌的比例分别为1：3，1：1；3：1。

⑥混匀后的菌液在室温静置培养1小时，将菌液均匀滴至含有50μg/mL 2，6二氨基庚二酸的LB固体培养基上，37℃，过夜正置培养。

⑦向长出大片菌落的平板上滴加1mL LB液体培养基，将板上的菌体洗下来，稀释10倍后，50μL在LB固体平皿(50μg/mL氯霉素)涂布，37℃，过夜倒置培养。

⑧使用针对重组质粒为模板重新设计的引物pRE112-F/R，对长出的单菌落进行菌落PCR鉴定，经过凝胶电泳的鉴定条带大小一致，纯化回收并送测序。

(2)筛选缺失株

①取100μL过夜培养的含有pRE112-kdpE重组质粒的达卡气单胞菌ΔphoBR缺失株，加入900μL新鲜LB液体培养基(稀释十倍)。

②取100μL稀释后的菌液在LB固体平皿(含有20％蔗糖)上涂布，37℃倒置培养12小时。

③使用引物kdpE up-F/kdpE down-R做菌落PCR鉴定。对正确的菌株扩培，做好菌种保存。

1.2.9ΔphoBRΔkdpE+CkdpE达卡气单胞菌的构建

(1)kdpE基因片段的扩增

以达卡气单胞菌野生株C160501DNA为模板，使用引物kdpEDB-F/R扩增kdpE基因片段并纯化回收。

(2)无缝克隆

提取质粒pBBR1MCS-2后，使用ScaI单酶切，纯化回收保存。以单酶切后的pBBR1MCS-2为模板，利用引物pBBR1MCS-2Δ(lacZα)-F/R将其扩增，然后在线性化的质粒两端各选择一段合适大小的序列，通过重新设计的引物kdpEDQ-F/R将选择的序列连接到kdpE基因片段两端，得到kdpE搭桥片段，使得kdpE基因片段两端与载体上存在一段互补的碱基对，从而通过无缝克隆的方法，将kdpE基因片段连接到载体上。

(3)pBBR1MCS-2Δ(lacZα)-kdpE回补质粒的转化

将pBBR1MCS-2Δ(lacZα)-kdpE回补质粒转到大肠杆菌WM3064感受态细胞，以长出的单菌落为模板，使用引物pBBR-F/R和kdpEDB-F/R分别PCR验证阳性克隆菌株。

(4)回补株的筛选

通过存在pBBR1MCS-2Δ(lacZα)-kdpE回补质粒的大肠杆菌WM3064和ΔphoBRΔkdpE达卡气单胞菌进行接合转移。以得到的单菌落为模板，使用验证引物pBBR-F/R和在kdpE两端重新设计的验证引物2kdpE-F/R进行菌落PCR验证。

1.2.10ΔphoBRΔkdpE+pBBR1MCS-2达卡气单胞菌的构建

对存在pBBR1MCS-2的大肠杆菌WM3064和ΔkdpEΔphoBR达卡气单胞菌，利用接合转移的方法，得到存在空质粒pBBR1MCS-2的ΔphoBRΔkdpE达卡气单胞菌。

1.2.11缺失株的表型分析

(1)遗传稳定性

将ΔphoBRΔkdpE缺失株接种在5mLLB液体试管(50μL/mL氨苄青霉素)内，37℃培养8小时，取出100μL接种于新的LB液体培养基(50μL/mL氨苄青霉素)，连续传代30代，每隔10代使用融合同源臂的外侧引物ΔkdpE-F/R进行验证，野生株C160501为阳性对照，ddH

(2)抗菌肽敏感性

取OD

1.2.12斑马鱼毒力试验

(1)毒力测定

分别取野生株、ΔphoBR缺失株、ΔphoBRΔkdpE缺失株、ΔphoBRΔkdpE+CkdpE回补株及ΔphoBRΔkdpE+pBBR1MCS-2缺失株菌液2mL，离心后用PBS溶液重悬菌体稀释至1×10

(2)半数致死量(LD

将野生株、ΔphoBR缺失株、ΔphoBRΔkdpE缺失株、ΔphoBRΔkdpE+CkdpE回补株及ΔphoBRΔkdpE+pBBR1MCS-2缺失株培养至对数中期时，分别使用PBS溶液洗涤3次并以梯度浓度稀释。实验共选择了斑马鱼208条，随机每组8条，腹部注射菌液10μL，对照组为10μLPBS溶液，对96小时内每组的死亡数目进行记录，直至不再有死亡情况发生。利用Bliss方法(Finney,1985)计算野生株与每个缺失株的半数致死量。

1.2.13斑马鱼免疫效力试验

①离心收集ΔphoBR缺失株、ΔphoBRΔkdpE缺失株、ΔphoBRΔkdpE+CkdpE回补株及ΔphoBRΔkdpE+pBBR1MCS-2缺失株的菌体，PBS溶液洗涤后稀释至1×10

②免疫后的第15天，每组选择30条斑马鱼，分别向其腹部注射10μL 1.09×10

1.2.14数据处理

用SPSS软件进行统计分析，比较各缺失株与野生株之间的变量差异。数据以均数±标准差表示。p值＜0.05为组间显著性差异。

2结果分析

2.1ΔphoBRΔkdpE达卡气单胞菌的构建

2.1.1kdpE基因上、下游同源臂扩增

参照达卡气单胞菌野生株C160501，设计引物kdpE up-F/R和kdpE down-F/R，以野生株C160501为模板，分别扩增kdpE基因的上、下游同源片段，扩增片段的大小为上游：1,023bp和下游：1,007bp；通过1％的琼脂糖凝胶电泳对所扩增的PCR产物进行验证，结果正确(图6)。

2.1.2kdpE基因上、下游同源臂的融合及双酶切

上游片段3’端和下游片段5’端存在15bp的互补序列，overlap PCR获得2,030bp的融合片段。用限制性内切酶SacⅠ和XbaⅠ对融合片段双酶切，然后切胶回收。结果见图7。

2.1.3pRE112质粒的提取及双酶切

提取了pRE112质粒后，使用与融合片段相同的限制性内切酶XbaⅠ和SacⅠ对其双酶切，纯化回收得到的酶切产物。结果见图8。

2.1.4pRE112-ΔkdpE重组质粒的转化鉴定

(1)菌落PCR验证

T4 DNA连接酶连接双酶切后的上下游融合片段和pRE112质粒构建重组质粒，然后通过热激转化得到阳性克隆，引物kdpE up-F/kdpE down-R菌落PCR鉴定，大小为2,030bp，见图9(4泳道)。

(2)双酶切验证

经过菌落PCR验证出来的阳性克隆，扩培后提取重组质粒，加入限制性内切酶XbaⅠ和SacⅠ双酶切验证，重组质粒片段大小为7,761bp，双酶切后片段大小分别为5,731bp和2,030bp。电泳凝胶验证，见图9。

2.1.5ΔphoBRΔkdpE达卡气单胞菌的鉴定

(1)含重组质粒的达卡气单胞菌鉴定

将含有pRE112-ΔkdpE重组质粒的Δasd大肠杆菌与ΔphoBR达卡气单胞菌接合转移后，因为重组质粒具有氯霉素抗标记且Δasd大肠杆菌在没有2，6二氨基庚二酸的培养基上不能生长，所以将接合转移后的菌株在含有氯霉素且不含2，6二氨基庚二酸的培养基中进行初步筛选，然后以pRE112质粒序列设计的引物pRE112-F/R做菌落PCR，得到含有重组质粒的菌落，大小为1,076bp，符合正确结果。

(2)ΔphoBRΔkdpE达卡气单胞菌的鉴定

菌落PCR得到的阳性菌落扩培后在LB固体培养基(含20％蔗糖)上进行负筛选。利用根据kdpE基因上下同源臂外侧基因组序列设计的验证引物ΔkdpE-F/R对蔗糖板上挑选的单菌落做菌落PCR。见图10，野生株C160501扩增出2,854bp，ΔphoBRΔkdpE缺失株扩增出2,173bp。再使用为ΔphoBR达卡气单胞菌设计的验证引物F0/R0对ΔphoBRΔkdpE达卡气单胞菌进行验证，扩增片段大小为1,315bp，以野生株为模板的片段大小为3,270bp。符合预期结果，ΔphoBRΔkdpE达卡气单胞菌构建完成。

2.2ΔphoBRΔkdpE+CkdpE达卡气单胞菌的构建

2.2.1回补质粒的构建

以达卡气单胞菌野生株C160501为模板，引物kdpEDB-F/R得到684bp的kdpE基因片段。利用引物pBBR1MCS-2Δ(lacZα)-F/R将pBBR1MCS-2质粒线性化后，得到大小为4,782bp的缺失lacZα的pBBR1MCS-2片段。在线性化的质粒两端各选择一段15bp的序列，利用引物kdpEDQ-F/R将选择的15bp序列连接到kdpE基因片段两端，得到片段kdpE搭桥片段，大小为714bp，使得kdpE基因片段两端与载体上各存在一段互补的碱基对。结果见图11。

2.2.2回补菌株的构建

(1)回补质粒的构建

通过无缝克隆试剂盒，将kdpE搭桥片段和pBBR1MCS-2-Δ(lacZα)片段进行重组反应，然后通过热激法将重组产物转化大肠杆菌WM3064感受态细胞中，使用引物pBBR1-F/R和kdpEDB-F/R分别通过菌落PCR验证阳性克隆菌株，结果见图12，大小分别是1,286bp和684bp，确保重组成功且重组产物进入感受态细胞中，结果符合预期。

(2)回补菌株的构建

对存在pBBR1MCS-2Δ(lacZα)-kdpE回补质粒的大肠杆菌WM3064和ΔphoBRΔkdpE达卡气单胞菌进行接合转移实验，使用验证引物pBBR-F/R和在kdpE两端重新设计的验证引物2kdpE-F/R进行菌落PCR验证，见图13，大小分别为1,286bp和2,173bp。得到回补菌株ΔphoBRΔkdpE+CkdpE达卡气单胞菌。

2.3ΔphoBRΔkdpE+pBBR1MCS-2达卡气单胞菌的构建

将存在pBBR1MCS-2的大肠杆菌WM3064和ΔkdpEΔphoBR达卡气单胞菌进行接合转移，利用验证引物pBBR-F/R进行筛选，见图14，大小为969bp。得到含有pBBR1MCS-2空质粒的ΔphoBRΔkdpE达卡气单胞菌。

2.4缺失株的表型分析

2.4.1遗传稳定性

将ΔphoBRΔkdpE达卡气单胞菌连续盲传30代后，使用同源臂的外侧引物ΔkdpE-F/R进行检测缺失株的遗传稳定性。图15可以看到随机挑选的8株菌均能扩出2173bp的特异性条带(1-8泳道)，与原代缺失株的结果一致(9泳道)。阴性对照没有加模板，可以看到没有条带(11泳道)。证明缺失株可以稳定遗传。

2.4.2抗菌肽敏感性

采用菌落计数法对野生株、ΔphoBR缺失株、ΔphoBRΔkdpE缺失株、ΔphoBR+CkdpE回补株和ΔphoBRΔkdpE+pBBR1MCS-2缺失株的初始菌落浓度进行统计，原始的菌落浓度分别为2.73×10

表3细菌存活率(％)

2.5斑马鱼毒力试验

2.5.1毒力的测定

为了对ΔphoBRΔkdpE缺失株的毒力做出判断，选择250条斑马鱼，随机分为五个实验组，每条斑马鱼注射10μL菌液后记录腹部出血的斑马鱼(如图17)的累计死亡条数。结果(表4)显示野生株的死亡率为60％，ΔphoBR缺失株的死亡率为40％，而ΔphoBRΔkdpE缺失株的累计死亡率为27％，ΔphoBRΔkdpE缺失株的毒性进一步减弱，可以说明达卡气单胞菌的kdpE基因的缺失会影响与毒力表达相关的其他基因。

表4毒力试验

2.5.2半数致死量(LD

为了进一步知道达卡气单胞菌在缺失了kdpE基因毒力的改变情况，我们使用斑马鱼进行半数致死量的实验，实验分为25个实验组和一个对照组，每组8条鱼。实验结果(表5)得到ΔphoBRΔkdpE缺失株的LD

表5半数致死量测定

2.6斑马鱼免疫效力试验

将1×10

表6免疫保护实验

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