一种应用普利醇改善肝脏氧化应激的体外评价方法及其应用

技术领域

本发明属于药物评价及应用技术领域，尤其涉及一种应用普利醇改善肝脏氧化应激的体外评价方法及其应用。

背景技术

氧化应激(Oxidative Stress，OS)是生物体细胞在遇到种种刺激时，机体内产生高水平高活性物质，如活性氧、氮自由基等，导致机体内氧化-还原反应速率失衡，各种氧化物导致的氧化速度超出了机体抗氧化能力，最终导致氧化应激损伤人体组织，被认为是导致衰老和疾病的一个重要因素，也是肿瘤及其他一系列疾病发生的重大起因。氧化应激对机体的肝脏功能有负面作用，参与多种肝脏疾病的形成发展过程。机体发生氧化应激时，大量的氧自由基在肝细胞内蓄积，通过损伤生物大分子物质、破坏肝细胞结构、影响细胞器功能、诱发肝细胞凋亡等，对肝脏造成严重损伤，并引发多种肝脏疾病。

普利醇是天然存在的高级醇，外观为白色粉末或鳞片状晶体，可溶于有机溶剂，不溶于水，主要存在于蔗蜡、米糠蜡、小麦胚芽油、蜂蜡及虫蜡等天然产物中。多项研究表明普利醇具有良好的生物降解性，易为动物吸收及广泛分布于动物的表皮与内脏，增强新陈代谢率、降低肌肉摩擦、消除肌肉疼痛等生理功能，但其改善肝脏氧化应激研究较少，评价其缓解肝脏氧化应激的方法缺乏。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种应用普利醇改善肝脏氧化应激的体外评价方法及其应用。本发明首次使用普利醇(40％二十八烷醇)作为缓解肝细胞氧化应激的物质，通过一套完整的体外评价方法，最终筛选出普利醇(40％二十八烷醇)的有效处理剂量为100ppm。本发明中的体外评价方法干扰因素单一，结果准确、稳定，更利于普利醇功能的评定，而且为普利醇在肝脏氧化应激改善药物制备中的应用提供了理论基础。

为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：

本发明提供了一种应用普利醇改善肝脏氧化应激的体外评价方法，包括以下步骤：

(1)选择适宜肝细胞；

(2)分别设置对照组、应激组和普利醇组进行处理；所述对照组、应激组和普利醇组的设置方法为：对照组中的肝细胞培养基为基础培养基，应激组中的肝细胞培养基在基础培养基的基础上添加导致氧化应激的药液，普利醇组中的肝细胞培养基在基础培养基的基础上同时添加导致氧化应激的药液和普利醇；

(3)处理完成后分别测定各处理组细胞活性、细胞凋亡率、细胞内ROS含量；

(4)当普利醇组细胞活性、细胞凋亡率、细胞内ROS含量至少达到对照组水平时，普利醇对氧化应激具有改善效果。

进一步的，所述步骤(1)中选择的是NCTC1469肝细胞系。

再进一步的，所述步骤(2)中导致氧化应激的药液为地塞米松(DEX)，在应激组和普利醇组中的添加量都为10μM；普利醇组中添加的普利醇为40％二十八烷醇含量。

更进一步的，所述步骤(2)中的基础培养基的成分组成如下表所示：

又进一步的，所述步骤(2)中的处理时间为5.5～6.5h。

更进一步的，所述步骤(2)中的处理时间为6h。

本发明还提供了一种所述体外评价方法在肝脏氧化应激改善药物筛选中的应用。

进一步的，所述应用中使用所述体外评价方法最终筛选出普利醇(40％二十八烷醇)的有效处理剂量为100ppm。

与现有技术相比，本发明具有如下技术效果：

本发明首次使用普利醇(40％二十八烷醇)作为缓解肝细胞氧化应激的物质，通过一套完整的体外评价方法，最终筛选出普利醇(40％二十八烷醇)的有效处理剂量为100ppm。本发明中的体外评价方法干扰因素单一，结果准确、稳定，更利于普利醇功能的评定，而且为普利醇在肝脏氧化应激改善药物制备中的应用提供了理论基础。

附图说明

图1为本发明实施例1中不同处理组对肝细胞活性的影响对比图；

图2～图3为本发明实施例1中不同处理组对肝细胞凋亡情况的影响对比图；

图4为本发明实施例1中不同处理组对肝细胞内ROS含量的影响对比图；

图5为本发明实施例1中不同处理组对肝细胞内SOD、GSH-Px、MDA的影响对比图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和本质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。以下实施例中使用的试剂/仪器均可由市售获得，实施例中使用的方法如无特别说明，与常规使用的方法一致。

下面结合实施例，对本发明的技术方案进行进一步详细阐述。

实施例1

一、试验内容

1试验设计

购买NCTC1469肝细胞系，培养肝细胞至生长到80％密度时，随机分为3组：对照组、应激组和普利醇组。对照组肝细胞培养基为基础培养基，应激组肝细胞培养基在基础培养基的基础上添加10μM地塞米松(DEX)，普利醇组肝细胞培养基在基础培养基的基础上添加10μM地塞米松(DEX)和100ppm普利醇，处理6h后，分别测定细胞活性、细胞凋亡、细胞内ROS含量。

2试验培养基

基础培养基为高糖培养基，其具体成分组成如表1所示。在基础培养基中添加10μMDEX作为应激组培养基。在基础培养基中添加10μM DEX和100ppm普利醇(40％二十八烷醇)作为缓解应激组培养基。

表1基础培养基具体成分组成

3普利醇(40％二十八烷醇)处理对肝细胞活性的影响

将处理好的NCTC1469细胞悬浮液(100μL/孔)接种在96孔板中。将板在潮湿的培养箱中预孵育(例如，在37℃，5％CO

4普利醇(40％二十八烷醇)处理对肝细胞凋亡和坏死的影响

1)每个样品收集约10-100万细胞于1.5ml离心管内，离心弃上清。细胞沉淀用0.8-1毫升细胞染色缓冲液重悬。

2)加入5微升Hoechst染色液。

3)加入5微升PI染色液。

4)混匀，冰浴或4℃孵育20-30分钟。

5)用流式细胞仪检测红色荧光和蓝色荧光。

5普利醇(40％二十八烷醇)处理对肝细胞内ROS含量的影响

肝细胞处理结束后，按照1:1000用无血清培养液稀释DCFH-DA，使终浓度为10微摩尔/升。去除细胞培养液，加入适当体积稀释好的DCFH-DA。37℃细胞培养箱内孵育20分钟。用无血清细胞培养液洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。利用荧光酶标仪(488nm激发波长，525nm发射波长)测定其荧光强度。

6实验数据采用SPSS22.0统计软件进行单因素方差分析(One-Way ANOVA)，Duncan组间比较，结果以“平均数±标准误”表示。肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

二、实验结果

1普利醇(40％二十八烷醇)处理对肝细胞活性的影响结果如图1所示。

结果显示：应激(DEX)处理可显著降低NCTC1469肝细胞的增殖活性(P＜0.05)，添加100ppm普利醇(40％二十八烷醇)可显著缓解DEX对肝细胞活性的抑制(P＜0.05)，且缓解程度基本达到了与对照组相当的水平。

2普利醇(40％二十八烷醇)处理对肝细胞凋亡的影响结果如图2～图3所示。

结果显示：应激(DEX)处理可显著升高NCTC1469细胞的凋亡率(P＜0.05)、降低其存活率(P＜0.05)；与DEX组相比，添加100ppm普利醇(40％二十八烷醇)可显著降低NCTC1469细胞的凋亡率(P＜0.05)、升高其存活率(P＜0.05)，且改善程度也基本达到了与对照组相当的水平。

3普利醇(40％二十八烷醇)处理对肝细胞内ROS含量的影响结果如图4所示。

结果显示：应激(DEX)处理可显著升高NCTC1469肝细胞内ROS(P＜0.05)，添加100ppm普利醇(40％二十八烷醇)可显著抑制DEX对肝细胞活性的增加(P＜0.05)，且抑制程度达到了比对照组还好的水平。

4普利醇(40％二十八烷醇)处理对肝细胞内SOD、GSH-Px、MDA的影响结果如图5所示。

结果显示：与对照组相比，应激(DEX)处理可显著降低NCTC1469肝细胞内抗氧化酶SOD、GSH-Px的活力，升高MDA的含量(P＜0.05)；添加100ppm普利醇(40％二十八烷醇)还可显著升高SOD、GSH-Px的活力，降低MDA的含量(P＜0.05)。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。