一种小茴香提取物组合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于中药技术领域，具体涉及一种小茴香提取物组合物及其制备方法和应用。

背景技术

小茴香(Foeniculum vuLgare)为伞形科植物茴香的干燥成熟果实。该药材味辛、性温，具有散寒止痛、理气之功效，被收载于《中国药典》中。小茴香含有黄酮、香豆素、酚酸、生物碱、挥发油等多种类型的化学成分。现代药理学研究表明，小茴香不仅具有显著的抑菌、利尿等功效，还具有保肝利胆、抗菌抗炎、抗肿瘤以及性激素样等生物活性。

酗酒或长期过量饮酒导致的身体疾病是全球最常见的可预防的疾病之一，每年约导致330万人死亡，占全球死亡总人数的6％。酒精会对多个器官造成损害，主要是肝脏、胃肠道和大脑，其中胃粘膜损伤是酒精长期累积导致的高发性慢性疾病。乙醇进入胃后，经过代谢转化为乙醛，其与胃蛋白结合破坏胃粘膜结构，使中性粒细胞浸润于胃粘膜，并释放髓过氧化物酶、氧自由基、活性氧化代谢产物、蛋白酶，粘附于血管内皮导致粘膜损伤。因此，研发防治酒精引起的胃粘膜损伤且副作用小的中药健康产品，越来越受到人们的关注。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种小茴香提取物组合物及其制备方法和应用。本发明制得的小茴香提取物组合物对酒精引起的胃粘膜损伤有明显的防治作用，且无毒副作用。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种小茴香提取物组合物的制备方法，包括以下步骤：

将小茴香粉末和第一份水混合进行水蒸气蒸馏提取，分别得到小茴香挥发油组分、第一提取液和第一药渣；

将所述第一药渣和第二份水混合进行煎煮提取，得到第二提取液；

将所述第一提取液和第二提取液混合浓缩后过大孔树脂柱纯化，得到小茴香水溶性组分；

将所述小茴香挥发油组分和小茴香水溶性组分混合，得到所述小茴香提取物组合物；所述小茴香挥发油组分和小茴香水溶性组分的重量比为1～3:2～4。

优选的，所述小茴香挥发油组分和小茴香水溶性组分的重量比为2:3。

优选的，所述小茴香粉末和第一份水的重量比为1:8～12。

优选的，所述水蒸气蒸馏提取的时间为4～6小时。

优选的，所述第一药渣和第二份水的重量比为1:10～16。

优选的，所述煎煮提取的次数为1～3次，每次煎煮提取的时间为1小时。

优选的，所述第一提取液和第二提取液混合浓缩后得到的浸膏的比重为1.05～1.20。

优选的，所述大孔树脂柱为D101型大孔吸附树脂柱。

本发明还提供了上述技术方案所述的制备方法得到的小茴香提取物组合物，所述小茴香提取物组合物包括小茴香挥发油组分和小茴香水溶性组分；

所述小茴香挥发油组分中反式茴香脑的重量百分比为75.0～90.0％；

所述小茴香水溶性组分中总黄酮的重量百分比为13.0～20.0％，紫丁香苷的重量百分比为5.0～8.0％，槲皮素3-O-β-D葡萄糖醛酸苷的重量百分比为4.0～6.0％。

本发明还提供了上述技术方案所述的小茴香提取物组合物在制备治疗和/或预防胃粘膜损伤的药物中的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明提供了一种小茴香提取物组合物的制备方法，包括以下步骤：将小茴香粉末和水混合进行水蒸气蒸馏提取，得到小茴香挥发油组分、第一提取液和第一药渣；将所述第一药渣和水混合进行煎煮提取，得到第二提取液；将所述第一提取液和第二提取液混合浓缩后过大孔树脂柱纯化，得到小茴香水溶性组分；将所述小茴香挥发油组分和小茴香水溶性组分混合，得到所述小茴香提取物组合物；所述小茴香挥发油组分和小茴香水溶性组分的重量比为1～3:2～4。本发明通过水蒸气蒸馏、水煎煮提取、大孔树脂纯化联合使用的方法，依次从小茴香中分离纯化得到挥发油组分和水溶性组分，进一步将小茴香挥发油组分和小茴香水溶性组分相配伍，小茴香挥发油组分和小茴香水溶性组分对防治胃粘膜损伤具有明显的协同增效作用，本发明采用科学配比得到的小茴香提取物组合物，对由酗酒或长期过量饮酒导致的胃粘膜损伤具有明显的防治作用，且无毒副作用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为小茴香提取物组合物(FWEO)对酒精致胃粘膜损伤(AAGI)小鼠胃粘膜组织形态的影响；

图2为FWEO对AAGI小鼠胃粘膜组织病理学改变的影响图(×200倍)；

其中A为正常对照组；B为模型组；C为奥美拉唑组(OEM,26mg/kg)；D为小茴香水溶性组分组(FWE,100mg/kg)；E为小茴香挥发油组分组(FEO,260mg/kg)；F为FWEO组(50mg/kg)；G为FWEO组(100mg/kg)；H为FWEO组(200mg/kg)。

具体实施方式

本发明提供了一种小茴香提取物组合物的制备方法，包括以下步骤：

将小茴香粉末和第一份水混合进行水蒸气蒸馏提取，分别得到小茴香挥发油组分、第一提取液和第一药渣；

将所述第一药渣和第二份水混合进行煎煮提取，得到第二提取液；

将所述第一提取液和第二提取液混合浓缩后过大孔树脂柱纯化，得到小茴香水溶性组分；

将所述小茴香挥发油组分和小茴香水溶性组分混合，得到所述小茴香提取物组合物；所述小茴香挥发油组分和小茴香水溶性组分的重量比为1～3:2～4。

在本发明中，若无特殊说明，使用的材料和设备均为本领域市售商品。

本发明将小茴香粉末和第一份水混合进行水蒸气蒸馏提取，分别得到小茴香挥发油组分、第一提取液和第一药渣。

在本发明中，所述小茴香粉末和第一份水的重量比优选为1:8～12。

在本发明中，所述水蒸气蒸馏提取前优选还包括浸泡，所述浸泡的时间优选为3～5小时，更优选为4小时。

在本发明中，所述水蒸气蒸馏提取的时间优选为4～6小时，更优选为5小时。

在本发明中，所述水蒸气蒸馏提取后优选还包括将收集到的挥发油进行干燥得到小茴香挥发油组分，所述干燥优选为无水硫酸钠干燥。

在本发明中，所述小茴香挥发油组分中反式茴香脑的重量百分比优选为75.0～90.0％，更优选为79.16％；所述小茴香挥发油组分中优选还包括茴香醛、D-柠檬烯、γ-萜品烯、芬香烯和雌蒿脑。

得到第一药渣后，本发明将所述第一药渣和第二份水混合进行煎煮提取，得到第二提取液。

在本发明中，所述第一药渣和第二份水的重量比优选为1:10～16，更优选为1:12。

在本发明中，所述煎煮提取的次数优选为1～3次，更优选为2次，每次煎煮提取的时间优选为1小时。

得到第一提取液和第二提取液后，本发明将所述第一提取液和第二提取液混合浓缩后过大孔树脂柱纯化，得到小茴香水溶性组分。

在本发明中，所述浓缩优选为减压浓缩，所述减压浓缩的条件优选包括：负压为0.09～0.10MPa，温度为50～55℃。

在本发明中，所述第一提取液和第二提取液混合浓缩后得到的浸膏的比重优选为1.05～1.20，更优选为1.15。

在本发明中，所述浓缩后优选还包括将得到的浸膏和第三份水混合，所述浸膏和第三份水的重量比优选为1:3，本发明用水将浸膏充分溶解利于过柱分离纯化。

在本发明中，所述大孔树脂柱优选为D101型大孔吸附树脂柱，所述D101型大孔吸附树脂柱的径高比优选为1:6～10。

在本发明中，所述过大孔树脂柱纯化优选包括以下步骤：

将浸膏和水混合得到的混合液上样后，依次进行除杂和洗脱，得到洗脱液；

将所述洗脱液依次进行浓缩和干燥，得到所述小茴香水溶性组分。

在本发明中，所述除杂优选采用8～10倍柱体积水，所述洗脱优选采用5～8倍柱体积乙醇溶液，所述乙醇溶液的体积浓度优选为50％。

在本发明中，所述浓缩优选为减压浓缩，所述减压浓缩的条件优选包括：负压为0.09～0.10MPa、温度为50～55℃。

在本发明中，所述干燥优选为真空干燥，所述真空干燥的条件优选包括：负压为0.09～0.10MPa、温度为55～60℃。

在本发明中，所述小茴香水溶性组分中总黄酮的重量百分比优选为13.0～20.0％，更优选为15.75％；所述小茴香水溶性组分中优选还包括β-胡萝卜苷和香豆素。

在本发明中，所述小茴香水溶性组分中紫丁香苷的重量百分比优选为5.0～8.0％，更优选为6.50％；所述小茴香水溶性组分中槲皮素3-O-β-D葡萄糖醛酸苷的重量百分比优选为4.0～6.0％，更优选为4.32％。

得到小茴香挥发油组分和小茴香水溶性组分后，本发明将所述小茴香挥发油组分和小茴香水溶性组分混合，得到所述小茴香提取物组合物；所述小茴香挥发油组分和小茴香水溶性组分的重量比为1～3:2～4。

在本发明中，所述小茴香挥发油组分和小茴香水溶性组分的重量比优选为2:3。

本发明对所述小茴香挥发油组分和小茴香水溶性组分混合的方法没有特殊的要求，采用本领域技术人员常用的方法即可。

本发明还提供了上述技术方案所述的制备方法得到的小茴香提取物组合物，所述小茴香提取物组合物包括小茴香挥发油组分和小茴香水溶性组分；

所述小茴香挥发油组分中反式茴香脑的重量百分比为75.0～90.0％；

所述小茴香水溶性组分中总黄酮的重量百分比为13.0～20.0％，紫丁香苷的重量百分比为5.0～8.0％，槲皮素3-O-β-D葡萄糖醛酸苷的重量百分比为4.0～6.0％。

在本发明中，以占所述小茴香提取物组合物的重量百分比计，所述反式茴香脑的重量百分比优选为25.0～40.0％，更优选为31.66％。

在本发明中，以占所述小茴香提取物组合物的重量百分比计，所述总黄酮的重量百分比优选为7.0～12.0％，更优选为9.45％。

在本发明中，以占所述小茴香提取物组合物的重量百分比计，所述紫丁香苷的重量百分比优选为3.0～4.8％，更优选为3.90％。

在本发明中，以占所述小茴香提取物组合物的重量百分比计，所述槲皮素3-O-β-D葡萄糖醛酸苷的重量百分比优选为2.4～3.6％，更优选为2.59％。

本发明还提供了上述技术方案所述的小茴香提取物组合物在制备治疗和/或预防胃粘膜损伤的药物中的应用。

在本发明中，所述胃粘膜损伤优选为由化学物质引起的胃粘膜损伤，更优选为由酒精引起的胃粘膜损伤。

在本发明中，所述小茴香提取物组合物可进一步制成制剂，应用到健康产品中。

为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的小茴香提取物组合物及其制备方法和应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1小茴香提取物组合物的制备

将小茴香药材2.0kg粉碎过筛，用12倍重量水室温浸泡4小时，采用水蒸气蒸馏法提取5小时后，收集挥发油，无水硫酸钠干燥，得到小茴香挥发油组分(FEO)38mL，-20℃条件下储存备用。

提取后药渣以12倍重量的水煎煮2次，1小时/次，合并提取液(包括挥发油提取后剩余的提取液)，以0.09MPa的负压、50℃的温度减压浓缩，得到比重为1.15的流浸膏810g；浸膏用3倍重量的去离子水溶解后上D101型大孔吸附树脂柱(径高比1:10)，先用10个柱体积水进行除杂，再用8个柱体积的50％乙醇进行洗脱，收集50％乙醇洗脱液，以0.09MPa的负压减压浓缩，在负压为0.09MPa、温度为55℃的条件下真空干燥，得到棕黄色粉末66.87g，即为小茴香水溶性组分FWE。

将小茴香挥发油组分FEO和水溶性组分FWE按重量比为2:3混合，得到小茴香提取物组合物FWEO。

1、采用《中国药典》2020版方法测定FWE中总黄酮的含量：

取芦丁对照品10.0mg，精密称定，置50mL容量瓶中，加甲醇适量，置水浴上微热使溶解，放冷，加甲醇至刻度，摇匀即得对照品溶液(每1mL中含芦丁0.2mg)。精密量取对照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL，分别置25mL容量瓶中，各加水至6.0mL，加5％亚硝酸钠溶液1.0mL，混匀，放置6分钟，加10％硝酸铝溶液l.0mL，摇匀，放置6分钟，加4％氢氧化钠试液10.0mL，再加水至刻度，摇匀，放置15分钟，以相应的试剂为空白，照紫外-可见分光光度法(通则0401)，在500nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，芦丁浓度为横坐标，绘制标准曲线，得到的线性回归方程为y＝0.5259x-0.0007(R

2、采用高效液相色谱法测定FWE中紫丁香苷和槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷的含量：

色谱条件：Agilent Eclipse XDB-C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)；以色谱级乙腈(B)和0.1％磷酸溶液(A)为流动相，梯度洗脱(0～25min，8％→20％；25～30min，20％→45％；30～35min，45％→45％；35～40min，45％→8％；40～45min，8％→8％B)；流速1.0mL/min，柱温30℃，检测波长245nm，进样量10μL。标准曲线的绘制：精密称取紫丁香苷和槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷对照品适量，用70％的甲醇水稀释并定容至10mL容量瓶中，摇匀备用。分别精密吸取紫丁香苷对照品溶液0.2、0.5、1.0、2.0、5.0mL于10mL容量瓶中，以70％甲醇定容至刻度，摇匀。按色谱条件进样，记录峰面积，绘制标准曲线，得回归方程：紫丁香苷：y＝10464x+2.1828，R

3、采用高效液相色谱法测定FEO中反式茴香脑的含量：

色谱条件：Shim-pack×C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)；以色谱甲醇(B)-水(A)为流动相。梯度洗脱(0～19min，70％→80％；19～21min，80％→95％；21～30min，95％→90％；30～40min，90％→70％B)；流速1.0mL/min，柱温30℃，检测波长254nm，进样量10μL。标准曲线的绘制：取反式茴香脑对照品，精密称定，加无水乙醇溶解制成浓度为0.0096mg/mL的对照品溶液。分别精密吸取上述对照品溶液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0mL于10mL容量瓶中，以无水乙醇定容至刻度，摇匀，按色谱条件进样，记录峰面积，得回归方程y＝81823535.493x+20181.300，R

FEO和FWE的配伍组合物FWEO中反式茴香脑的重量百分比为31.66％，紫丁香苷的重量百分比含量为3.90％，槲皮素3-O-β-D葡萄糖醛酸苷的重量百分比在2.59％，总黄酮的重量百分比在9.45％。

实施例2小茴香组合物FWEO对酒精性胃粘膜损伤(AAGI)小鼠的保护作用

实验方法：96只雄性昆明小鼠适应性喂养4天后，根据体重随机分为正常组(空白对照组)、模型组、阳性奥美拉唑组(OEM，26mg/kg)、小茴香黄酮组(FWE，100mg/kg)、小茴香挥发油组(FEO，260mg/kg)、小茴香提取物组合物组(FWEO，50、100、200mg/kg)，每组12只。给药前用0.5wt％吐温-80溶液溶成相应浓度：阳性药为2.6mg/mL，FWE为10mg/mL，FEO为26mg/mL，FWEO分别为5、10、20mg/mL，按10mL/kg预给相应药物4天，正常组和模型组灌胃给予等量0.5wt％吐温-80溶液，从第6天开始，除正常组给予生理盐水外，其余各组给药1小时后按10mL/kg灌胃85％酒精，连续给药给予酒精3天，形成急性酒精性胃粘膜损伤小鼠模型。末次给酒1小时后，摘眼球取血，颈椎脱臼处死小鼠，分离取出胃组织，称重；沿胃大弯剪开胃腔，冰生理盐水清洗干净，平展于干净平板上，观察大体改变，评价胃组织损伤程度，计算出损伤指数及溃疡抑制率；采用生化试剂盒测定小鼠血清PEG

实验结果：

试验过程中，正常对照组小鼠生长状况良好、活泼好动、食欲旺盛、毛发光泽；而模型组小鼠酒精灌胃后出现步态不稳、活动减少、食量减少、体型消瘦、嗜睡等症状，个别小鼠还出现口唇紫绀、大口喘息的声响。各组小鼠体重变化无统计学差异，结果见表1和如图1，正常组小鼠胃组织宏观形态正常，未出现明显出血性病变，而模型组小鼠胃组织充血肿胀出血性病变明显，溃疡最为严重。FWEO(100、200mg/kg)能明显改善这些症状，且能显著降低酒精导致胃指数的升高(P<0.05)。

表1FWEO对AAGI小鼠体重和胃指数的影响

备注：

进一步参照Guth标准对计算溃疡指数，评价FWEO改善胃粘膜损伤的活性，如表2所示，与模型组比较(18.72)，FWEO能显著降低酒精诱导胃粘膜损伤小鼠的溃疡指数(16.42、13.28、10.63，P<0.05)，其中高剂量(100、200mg/kg，P<0.05)活性优于FWE(100mg/kg，16.83，P<0.05)，高剂量(200mg/kg)活性优于FEO(260mg/kg，13.09)，疗效几乎和奥美拉唑一样(26mg/kg，10.83)，抑制率达到了43.23％。

表2FWEO对AAGI小鼠胃溃疡指数的影响

备注：根据Duncan多重范围检验同一列中的不同字母表示差异显著性，差异在P<0.05。

PGE

表3FWEO对AAGI小鼠血清PGE

备注：

TNF-α、IL-1β是机体内常见的炎症因子，在机体炎症反应中发挥重要作用。如表4所示，酒精灌胃会导致小鼠胃组织TNF-α、IL-1β含量显著升高(P<0.05)，FWEO(50、100、200mg/kg)、FEO(260mg/kg)和FWE(100mg/kg)能够显著缓解酒精摄入造成的TNF-α、IL-1β含量增加(P<0.05)，其中高剂量的FWEO作用显著，优于FEO和FWE，高剂量的抑制效果接近于阳性对照OEM。结果说明FWEO可通过抑制促炎细胞因子的表达发挥保护胃粘膜损伤的作用。

表4FWEO对AAGI小鼠胃组织TNF-α、IL-1β水平

备注：

图2为FWEO对AAGI小鼠胃粘膜组织病理学改变的影响图(×200倍)，其中A为正常对照组；B为模型组；C为OEM组(26mg/kg)；D为FWE组(100mg/kg)；E为FEO组(260mg/kg)；F为FWEO组(50mg/kg)；G为FWEO组(100mg/kg)；H为FWEO组(200mg/kg)。HE染色结果显示，空白对照组小鼠胃粘膜各层结构清晰完整，未见出血和炎性细胞浸润(图2中A)。模型组小鼠胃粘膜损伤严重，肌层细胞破裂脱落，各种细胞受损严重，局部区域大量出血坏死，可见大量的炎性细胞浸润(图2中B)。FWE组(100mg/kg)和FWEO组(50mg/kg)小鼠胃粘膜损伤程度较模型组有所减轻，但粘膜上皮细胞脱落严重，存在充血和炎性细胞浸润现象(图2中D和图2中F)。FEO组(260mg/kg)和FWEO(100mg/kg)组小鼠胃粘膜损伤程度大大降低，胃组织各层结构较为清晰，粘膜上皮和腺体无明显损伤，部分表面破损，局部有少量的充血和炎性细胞浸润(图2中E和图2中G)。奥美拉唑阳性组(26mg/kg)和FWEO(260mg/kg)组小鼠胃粘膜未见明显损伤，各层结构清晰完整，炎性细胞浸润不明显(图2中C和图2中H)。

结果表明，FEO和FWE对酒精引起的胃粘膜损伤具有较好的防治作用，而且FEO和FWE存在明显的协同增效作用，FWEO组对由酒精刺激导致的胃粘膜损伤具有显著的防治作用(小茴香挥发油组分FEO和小茴香水溶性组分FWE以2:3的重量比组合而成)，药效学试验结果明显优于单独使用FEO组和FWE组。

尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本发明实施例在不经创造性劳动前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。