FGF6在口腔黏膜癌变诊断、治疗中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及FGF6在口腔黏膜癌变诊断、治疗中的应用。

背景技术

OSCC可由口腔黏膜潜在恶性疾患(oral potentially malignant disorders，OPMD)演变而来。约80％的OSCC会经历各种OPMD阶段，如口腔白斑病、口腔红斑病、口腔黏膜下纤维化。有临床数据表明，从OPMD转变为癌症可能需要数年或更长时间。因此，诊断和治疗OPMD这一关键阶段，是防治OSCC的有效途径。早期发现OPMD，以及筛查高易感人群，是降低OSCC发生率极具前景的策略。口腔白斑病(oral leukoplakia，OLK)是最常见的OPMD之一，发生率为0.13％～34.0％，癌变率为4％～13％。

口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)诊断的“金标准”是活体组织病理检查，但因其侵入性、术后影响大、患者心理负担重等特点，且受限于肿瘤的大小、取材部位的特殊性等条件不适合作为早期诊断的方法。因此，如何找到更高效、低成本和患者更易接受的早期诊断方法成为目前有探索潜质的热点问题。

由于口腔微生态环境较为复杂，微生物的代谢、口腔卫生及黏膜健康状况的改变都可能改变唾液成分和pH而影响标志物检测；尿液组分相对简单，易受生活习惯、用药情况、饮水量等多种因素影响，同一个体的不同阶段尿液蛋白质性质和浓度波动较大；脑脊液是一种血液超滤液，但因其解剖学位置和生理功能特异性，存在仅可作为神经系统疾病诊断和监测的局限性。

发明内容

为了解决现有技术中存在的上述问题，本发明提供了如下的技术方案：

本发明提供了检测样本中FGF6标志物的试剂在制备诊断口腔黏膜癌前病变的产品中的应用。

进一步，所述标志物的检测试剂包括特异性检测FGF6基因表达水平的试剂，或特异性结合FGF6基因编码的蛋白的试剂。

进一步，所述口腔黏膜癌前病变包括口腔潜在恶性疾病、口腔上皮发育不良、增殖性疣状白斑。

进一步，所述口腔黏膜癌前病变包括口腔黏膜白斑病、口腔扁平苔藓、口腔黏膜红斑病、口腔黏膜下纤维性病变、盘状红斑狼疮、口腔慢性念珠菌病和光化性唇炎。

进一步，所述样本包括骨髓、血液、血细胞、血清、外周血、腹水、组织或细针活检样本、含细胞体液、自由浮动的核酸、痰液、唾液、尿、脑脊液、腹膜液、胸膜液、粪便、淋巴、妇科液体、皮肤拭子、阴道拭子、口腔拭子、鼻拭子、冲洗液、灌洗液、抽吸物、刮擦物、骨髓样本、组织活检样本、手术样本、分泌物和/或排泄物。

进一步，所述样本包括血清、外周血。

如本文所用，标志物是指其存在或水平为特定状态或事件的特征的实体或部分。在一些实施方案中，特定标志物的存在或水平可为疾病、病症或病况的存在或所处阶段的特征。仅举一个例子，在一些实施方案中，术语是指具有特定肿瘤、肿瘤亚类、肿瘤分期等特征的基因表达产物。可选地或另外地，在一些实施方案中，特定标志物的存在或水平与特定信号传导途径的活性(或活性水平)关联，例如可能是特定肿瘤类型的特征。标志物的存在或不存在的统计显著性可能因特定标志物而异。在一些实施方案中，标志物的检测是高度特异性的，因为它反映了肿瘤属于特定亚类的高概率。这种特异性可能以灵敏度为代价(即，即使肿瘤是预期表达标志物的肿瘤，也可能出现阴性结果)而出现。相反，具有高灵敏度的标志物可能比具有较低灵敏度的标志物特异性更低。根据本发明，有用的标志物不需要以100％准确度区分特定亚类的肿瘤。

在某些具体的实施方案中，所述诊断随样本的不同而发生标准变化。在一个具体的实施方案中，诊断样本使用血清或外周血，此时标志物FGF6随癌变进程表达量不断升高，且表现出显著性差异，具体为正常人血清或外周血中FGF6表达显著性低于口腔黏膜癌前病变患者血清或外周血中FGF6表达。在一个具体的实施方案中，诊断样本使用组织，此时标志物FGF6随癌变进程表达量不断降低，且表现出显著性差异，具体为正常人组织中FGF6表达显著性低于口腔黏膜癌前病变患者组织中FGF6表达。

本发明提供了检测样本中FGF6标志物的试剂在制备口腔黏膜癌前病变与口腔黏膜癌诊断的产品中的应用。

进一步，所述标志物的检测试剂包括特异性检测FGF6基因表达水平的试剂，或特异性结合FGF6基因编码的蛋白的试剂。

进一步，所述口腔黏膜癌前病变包括口腔潜在恶性疾病、口腔上皮发育不良、增殖性疣状白斑。

进一步，所述口腔黏膜癌前病变包括口腔黏膜白斑病、口腔扁平苔藓、口腔黏膜红斑病、口腔黏膜下纤维性病变、盘状红斑狼疮、口腔慢性念珠菌病和光化性唇炎。

进一步，所述口腔黏膜癌前病变为口腔黏膜白斑病。

进一步，所述样本包括骨髓、血液、血细胞、血清、外周血、腹水、组织或细针活检样本、含细胞体液、自由浮动的核酸、痰液、唾液、尿、脑脊液、腹膜液、胸膜液、粪便、淋巴、妇科液体、皮肤拭子、阴道拭子、口腔拭子、鼻拭子、冲洗液、灌洗液、抽吸物、刮擦物、骨髓样本、组织活检样本、手术样本、分泌物和/或排泄物。

进一步，所述样本包括血清、组织、外周血。

本发明提供了检测样本中FGF6标志物的试剂在制备口腔黏膜癌诊断的产品中的应用。

进一步，所述标志物的检测试剂包括特异性检测FGF6基因表达水平的试剂，或特异性结合FGF6基因编码的蛋白的试剂。

进一步，所述样本包括骨髓、血液、血细胞、血清、外周血、腹水、组织或细针活检样本、含细胞体液、自由浮动的核酸、痰液、唾液、尿、脑脊液、腹膜液、胸膜液、粪便、淋巴、妇科液体、皮肤拭子、阴道拭子、口腔拭子、鼻拭子、冲洗液、灌洗液、抽吸物、刮擦物、骨髓样本、组织活检样本、手术样本、分泌物和/或排泄物。

进一步，所述样本包括血清、组织、外周血。

在某些具体的实施方案中，所述诊断随样本的不同而发生标准变化。在一个具体的实施方案中，诊断样本使用血清或外周血，此时标志物FGF6随癌变进程表达量不断升高，且表现出显著性差异，具体为口腔黏膜癌前病变患者血清或外周血中FGF6表达显著性低于口腔黏膜癌患者血清或外周血中FGF6表达。在一个具体的实施方案中，诊断样本使用组织，此时标志物FGF6随癌变进程表达量不断降低，且表现出显著性差异，具体为口腔黏膜癌前病变患者组织中FGF6表达显著性低于口腔黏膜癌患者组织中FGF6表达。

本发明提供了一种诊断受试者是否为口腔黏膜癌前病变或为口腔黏膜癌的产品，所述产品包括检测样本中FGF6标志物的基因或蛋白表达水平的试剂。

进一步，所述产品包括试剂盒、引物、试纸、核酸膜条、探针、芯片。

进一步，所述产品包括检测样本中标志物FGF6基因、功能片段、蛋白的存在/不存在或量的试剂。

进一步，所述试剂包括通过PCR反应、RT-PCR衍生反应、3SR扩增、LCR、SDA、NASBA、TMA、SYBR Green、TaqMan探针、分子信标、双杂交探针、复合探针、ISH、微阵列、Southern印迹、Northern印迹、多分析物谱测试、酶联免疫吸附测定法(ELISA)、放射免疫测定法、免疫荧光测定法、酶免疫测定法、免疫沉淀测定法、化学发光测定法、免疫组织化学测定法、斑点印迹测定法或狭线印迹测定法检测样本中FGF6基因、功能片段、蛋白的存在、不存在和/或量的试剂。

在某些具体的实施方案中，所述芯片包括基因芯片和蛋白芯片，所述基因芯片用于检测FGF6基因转录水平的针对FGF6基因的寡核苷酸探针，所述蛋白芯片包括FGF6蛋白的特异性抗体或配体。

在某些具体的实施方案中，所述试剂盒包括基因检测试剂盒、蛋白检测试剂盒，所述基因检测试剂盒包括用于检测FGF6基因转录水平的试剂或芯片，所述蛋白检测试剂盒包括用于检测FGF6蛋白表达水平的试剂或芯片。

在某些具体的实施方案中，所述试纸包括基因检测试纸、蛋白检测试纸。

本发明提供了FGF6的抑制剂在制备用于治疗和/或预防个体口腔黏膜癌前病变、或用于治疗和/或预防个体口腔黏膜癌的药物组合物中的应用。

进一步，所述口腔黏膜癌前病变包括口腔潜在恶性疾病、口腔上皮发育不良、增殖性疣状白斑。

进一步，所述口腔黏膜癌前病变包括口腔黏膜白斑病、口腔扁平苔藓、口腔黏膜红斑病、口腔黏膜下纤维性病变、盘状红斑狼疮、口腔慢性念珠菌病和光化性唇炎。

进一步，所述口腔黏膜癌前病变为口腔黏膜白斑病。

进一步，所述个体包括人或非人哺乳动物。

进一步，所述个体为人。

如本文所用，术语“生物样本”典型地是指从如本文所述的感兴趣的生物来源(例如，组织或生物体或细胞培养物)获得或衍生的样本。在一些实施方案中，感兴趣的来源包括生物体，诸如动物或人。在一些实施方案中，生物样本为或包含生物组织或流体。在一些实施方案中，生物样本可为或包含骨髓；血液；血细胞；腹水；组织或细针活检样本；含细胞体液；自由浮动的核酸；痰液；唾液；尿；脑脊液、腹膜液；胸膜液；粪便；淋巴；妇科液体；皮肤拭子；阴道拭子；口腔拭子；鼻拭子；冲洗液或灌洗液，诸如导管灌洗液或支气管肺泡灌洗液；抽吸物；刮擦物；骨髓样本；组织活检样本；手术样本；粪便、其它体液、分泌物和/或排泄物；和/或来自它们的细胞等。在一些实施方案中，生物样本为或包含从个体获得的细胞。在一些实施方案中，获得的细胞为或包括来自获得样本的个体的细胞。在一些实施方案中，样本为通过任何适当的方式直接从感兴趣的来源获得的“初级样本”。例如，在一些实施方案中，初级生物样本通过选自由以下组成的组的方法获得：活检(例如，细针抽吸或组织活检)、手术、体液(例如，血液、淋巴、粪便等)收集等。在一些实施方案中，如从上下文将清楚，术语“样本”是指通过处理初级样本(例如，通过除去初级样本的一种或多种组分和/或通过向初级样本中添加一种或多种剂)获得的制剂。

本发明提供了一种用于治疗和/或预防口腔黏膜癌前病变、或用于治疗和/或预防口腔黏膜癌的药物组合物，所述药物组合物包括治疗有效量和/或预防有效量的FGF6的抑制剂。

如本文所用，术语“抑制剂”是指其存在、水平或程度与靶标的水平或活性降低相关的实体、状况或事件)。在一些实施方案中，抑制剂可直接起作用(在这种情况下，其直接对其靶标施加影响，例如通过结合至靶标)；在一些实施方案中，抑制剂可间接起作用(在这种情况下，其通过与靶标的调节剂相互作用和/或以其它方式改变靶标的调节剂来施加其影响，使得靶标的水平和/或活性降低)。在一些实施方案中，抑制剂是其存在或水平与相对于特定参考水平或活性(例如，在适当参考条件下观察到的，诸如存在已知抑制剂或不存在所述抑制剂等的适当参考条件)降低的靶标水平或活性相关的抑制剂。

进一步，所述药物组合物还包括药学上可接受的辅料。

根据本发明的“组合物”或“药物组合物”是指如本文所述的两种或更多种剂的组合，用于共同施用或作为同一方案的一部分施用。不在所有实施方案中要求剂的组合产生物理混合物，即组合物的各组分作为单独的助剂施用是可能的；然而，许多患者或本领域从业者可能会发现制备以下组合物是有利的，所述组合物为两种或更多种成分在药学上可接受的载体、辅料、稀释剂或赋形剂中的混合物，使得有可能同时施用所述组合的组成成分。

在某些具体的实施方案中，所述药物组合物中可添加非治疗剂，例如以提供或有助于期望的一致性或稳定效果。合适的药物组合物辅料包括例如淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。

本发明提供了FGF6标志物在构建诊断口腔黏膜癌前病变或口腔黏膜癌的计算机模型中的应用。

本发明中使用的术语“计算机模型”指代根据所获得的FGF6标志物的表达检测数据而预测患者患有口腔黏膜癌前病变或口腔黏膜癌的模型。

本发明提供了一种利用标志物FGF6诊断口腔黏膜癌前病变或诊断口腔黏膜癌的系统，包括：结果判定单元，用于将数据处理单元得到的标志物的临界值与设定诊断值进行比较。

进一步，所述系统包括核酸或蛋白样本分离单元，用于从检测对象提供的样本中分离出核酸或蛋白样本。

进一步，所述系统包括测序单元，用于对核酸或蛋白样本进行测序，以获得测序结果。

进一步，所述系统包括数据处理单元，用于根据测序结果，对标志物的表达水平进行检测，将所得到的表达水平进行分析，得出标志物的临界值。

本发明提供了标志物FGF6在筛选治疗口腔黏膜癌前病变或口腔黏膜癌的候选药物中的应用，所述筛选治疗口腔黏膜癌前病变或口腔黏膜癌的候选药物通过体外口腔黏膜癌前病变或口腔黏膜癌的组织或细胞进行。

如本文所用，术语“改进”、“增加”、“抑制”、“减少”或其语法等同物指示相对于基线或其它参考测量的值。在一些实施方案中，适当的参考测量可为或包含在不存在特定剂或治疗(例如，在其之前和/或之后)，或在存在适当的可比较参考剂的情况下在另外可比的条件下在特定系统(例如，单个个体)中的测量。在一些实施方案中，适当的参考测量可为或包括在存在相关剂或治疗时已知或预期以特定方式响应的可比系统中的测量。

附图说明

图1是TCGA数据集中，FGF6在各类癌组织中的表达图；

图2是TCGA数据集中，FGF6在正常组织与HNSC组织中的表达图；注：A：FGF6在正常组织与HNSC组织中的表达；B：FGF6在正常组织与HNSC各病理分级组织中的表达，Grade 1表示高分化，Grade 2表示中分化，Grade 3表示低分化，Grade 4表示原位癌；

图3是裸鼠组织形态学观察图；注：a为疾病模型构建14d；b为疾病模型构建30d；

图4是HSC-4细胞及HaCaT细胞培养图；注：a为HSC-4细胞；b为HaCaT细胞；图5是过表达慢病毒转染细胞后的绿色荧光表达图；注：A为HSC-4细胞；B为HaCaT细胞；a为转染24h；b为转染48h；c为转染72h；

图6是慢病毒转染后HSC-4细胞内FGF6的mRNA相对表达量图；

图7是动物建模大体观图；注：第一排分别为对照正常组、对照癌前病变组织组、对照癌组；第二排分别为FGF6慢病毒转染正常组、FGF6慢病毒转染癌前病变组织组、FGF6慢病毒转染癌组；

图8是癌组裸鼠皮下荷瘤重量差异图；

图9是HE染色结果图；注：第一排分别为对照正常组、对照癌前病变组织组、对照癌组；第二排分别为FGF6慢病毒转染正常组、FGF6慢病毒转染癌前病变组织组、FGF6慢病毒转染癌组；

图10是阴性对照、FGF6免疫组化染色结果图，注：第一排分别为对照正常组、对照癌前病变组织组、对照癌组；第二排分别为FGF6慢病毒转染正常组、FGF6慢病毒转染癌前病变组织组、FGF6慢病毒转染癌组；

图11是FGF6免疫组化平均光密度值柱状图，注：a为正常组，b为癌前病变组织组，c为癌组，d为对照组，e为FGF6慢病毒转染组(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001)；

图12是MDA含量测定结果图，注：a为正常组，b为癌前病变组织组，c为癌组，d为对照组，e为FGF6慢病毒转染组(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)；

图13是Fe

图14是测试集2中健康人与口腔黏膜癌患者、口腔黏膜癌前病变患者与口腔黏膜癌患者FGF6差异表达的分析结果图；其中，A为鳞癌组与正常组(血清)FGF6差异表达，B为鳞癌组与白斑组(血清)FGF6差异表达；

图15是WB验证FGF6在口腔黏膜癌变各组血清中的表达图；

图16是WB验证FGF6在口腔黏膜癌变各组组织中的表达图；

图17是免疫组化验证FGF6在口腔黏膜癌变各组组织中的表达图；

图18是测试集1使用TCGA数据库组织样本绘制FGF6进行健康人与口腔黏膜癌诊断的ROC曲线图；

图19是测试集2使用真实世界收集血清样本绘制FGF6进行健康人与口腔黏膜癌、口腔黏膜癌前病变与口腔黏膜癌的ROC曲线图；

图20是验证集使用真实世界收集血清样本绘制FGF6进行健康人与口腔黏膜癌前病变、口腔黏膜癌前病变与口腔黏膜癌、健康人与口腔黏膜癌诊断的ROC曲线图；

图21是验证集使用真实世界收集组织样本绘制FGF6进行口腔黏膜癌前病变与口腔黏膜癌、健康人与口腔黏膜癌的ROC曲线图。

具体实施方式

实施例1

1、实验方法

1)TCGA数据集分析

从TCGA(https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/)数据集中，共获取了520例HNSC的原始数据和相应临床信息，并分析了FGF6在正常组织与HNSC组织中的表达情况。

2)口腔黏膜癌变进程动物疾病模型建立

(1)细胞准备：复苏并大量扩增HaCaT及HSC-4细胞，细胞量足够时进行动物模型构建。HaCaT及HSC-4细胞消化离心后进行细胞计数，加入适量无血清的DMEM高糖培养基混匀，使其细胞密度约为1.0×10

(2)动物准备：裸鼠购回后于西南医科大学动物实验中心SPF级环境中饲养，饲养1周无异常情况后进行模型构建。

(3)动物疾病模型构建：共5组裸鼠，每组各6只，分别于裸鼠右侧背部皮下注射HaCaT细胞悬液，每只0.2mL，并标记注射部位，待两周形成稳定的类上皮层结构后，于类上皮层基底膜区内注射HSC-4细胞悬液。注意事项：①两种细胞悬液尽量多准备，避免因容器内壁中残留，出现细胞悬液总量不足的情况；②注射器每次吸取细胞悬液前应反复轻轻吹打，以保证细胞密度均匀；③注射结束后针头应停留在裸鼠皮下数秒后再取出，避免立即取出针头导致漏液；④上述操作需严格无菌，避免因细胞污染或感染病原体而导致裸鼠死亡。注射后每日观察裸鼠注射部位的情况，待出现肉眼可见的包块时定期观察包块变化情况，有无变小、吸收等。

(4)取材：各组裸鼠分别于HSC-4细胞悬液注射结束后的第7d、14d、21d、30d、37d取材，所取组织分为两部分，一部分于10％中性福尔马林中固定待用，一部分于-80℃冰箱内保存待用。

3)组织形态学观察

(1)组织包埋

组织经10％中性福尔马林固定24h后包埋。

a)组织固定及脱水：将组织放入一次性塑料包埋框中，依次放入AF固定液(95％乙醇与浓甲醛按9:1的比例配置而成)中浸泡15min，80％酒精脱水1h，95％酒精脱水1h，无水乙醇I脱水1.5h，无水乙醇II脱水1.5h。

b)组织透明：将装有组织的塑料包埋框于二甲苯中浸泡40min。

c)组织浸蜡：将组织从塑料包埋框中取出，在通风橱中干燥10min后，放入60℃恒温石蜡箱内浸蜡45min，重复两次。

d)组织包埋：浸蜡完成后，选择大小合适的金属包埋框，将组织放入金属包埋框底部(注意组织块的放置方向)，先滴加少部分石蜡待组织初步固定后，再继续滴加石蜡使其填满整个金属包埋框，最后将塑料包埋框覆盖于金属包埋框上部，放置于制冷机上凝固蜡块，待蜡液完全凝固后取出蜡块标记组别，放入-20℃冰箱中备用。

(2)组织切片

修整蜡块，将蜡块作厚度为5μm的均匀连续、完整切片，随后摊片、捞片、烘片(烘片时间至少2h)，标记好分组后放置于切片盒中备用。

(3)组织HE染色

a)切片脱蜡与水化：脱蜡前先将切片置于烤片机上60℃烤片20min，冷却至室温后，二甲苯脱蜡12min，重复2次；无水乙醇、95％酒精、80％酒精、70％梯度酒精各作用2min；超纯水冲洗2s。

b)染色：①苏木素染色5min；②超纯水冲洗2s；③1％盐酸酒精酸化1s；

④超纯水冲洗2s；⑤1％氨水返蓝1min；⑥超纯水冲洗2s；⑦伊红染色1min；

⑧超纯水冲洗2s；⑨70％酒精、80％酒精、95％酒精各脱水2s；⑩无水乙醇脱水10min；

c)HE染色结果判断

所有切片均由两位高年资病理医师根据2005年WHO标准进行病理诊断，鉴定模型构建成功率。

4)HSC-4细胞转染及构建稳转株

(1)将生长状态良好，无污染，且细胞密度达到80％以上的HSC-4细胞消化离心，制成细胞悬液，并进行细胞计数，使细胞密度达到3×10

(2)将过表达FGF6慢病毒、空载体慢病毒、polybrene预先从-80℃冰箱取出，于4℃冰箱缓慢溶解，配制含polybrene(5μg/mL)的细胞培养液备用，同时按照MOI＝60及各病毒的病毒滴度，计算各孔病毒加入量；

(3)24h后将孔板从培养箱取出，于光学显微镜下观察细胞状态，细胞状态良好，分布均匀，且有90％以上细胞贴壁时，可进行慢病毒转染；

(4)去掉6孔板中旧培养液，用PBS缓冲液清洗细胞3次，FGF6慢病毒转染组(overexpression group，即OE group)每孔中含过表达病毒液、polybrene、DMEM基础培养基共2mL，根据计算好的病毒添加量，将含polybrene的培养液、过表达慢病毒依次加入至6孔板中，并轻轻十字晃动混匀；

(5)空载体慢病毒转染组(对照组，即control group)，每孔中含空载体病毒液、polybrene、DMEM基础培养基共2mL，根据计算好的病毒添加量，将含polybrene的培养液、空载体慢病毒依次加入至6孔板中，并轻轻十字晃动混匀；

(6)空白组(blank group)加入2mL DMEM基础培养基；

(7)慢病毒加入10～12h后观察细胞状态进行换液，弃去带有病毒液和polybrene的培养液，每孔加入2mL细胞完全培养液放入培养箱继续培养，若细胞状态不好可提前至8h换液；

(8)转染48h后加入嘌呤霉素，根据前期实验筛选的HSC-4细胞稳转株的最适嘌呤霉素浓度(2μg/mL)，配制筛选培养基，每2～3天换一次筛选培养基，使嘌呤霉素总浓度为2μg/mL，筛选一周左右得到HSC-4细胞的稳转株。

(9)稳转株可根据细胞密度按适当比例传代和冻存，也可根据细胞扩增量进行后续实验。

5)FGF6慢病毒干扰正常黏膜癌变进程的动物疾病模型构建

本实验共模拟三个阶段，分别为正常阶段、口腔黏膜潜在恶性疾患(oralpotential malignant disorders，OPMD)阶段、黏膜癌变阶段，每个阶段分别包含FGF6慢病毒转染组和对照组两组，每组6只裸鼠，共36只。其中，正常阶段中，FGF6慢病毒转染组于裸鼠右侧背部皮下注射转染FGF6慢病毒的HaCaT细胞悬液，对照组注射转染空载体慢病毒的HaCaT细胞悬液；OPMD阶段中，先于裸鼠右侧背部皮下注射HaCaT细胞悬液，待两周形成稳定的类上皮层结构后，FGF6慢病毒转染组于类上皮层基底膜区内注射转染FGF6慢病毒的HSC-4细胞悬液，对照组于类上皮层基底膜区内注射转染空载体慢病毒的HSC-4细胞悬液；黏膜癌变阶段中，FGF6慢病毒转染组于裸鼠右侧背部皮下注射转染FGF6慢病毒的HSC-4细胞悬液，对照组注射转染空载体慢病毒的HSC-4细胞悬液，每只裸鼠皮下注射0.2mL。

6)组织丙二醛(MDA)含量检测

(1)样本处理：从-80℃冰箱取出各组组织样本，称取约0.1g组织，加入1mL提取液进行冰浴匀浆；8000g，4℃离心10min，取上清，置于冰上待测；

(2)加样：测定管分别加入MDA检测工作液300μL、样本100μL、试剂三100μL；空白管分别加入MDA检测工作液300μL、蒸馏水100μL、试剂三100μL，其中空白管做2次；

(3)将混合液在100℃水浴中保温60min后(盖紧，防止水分散失)，置于冰浴中冷却，10000g，常温，离心10min；

(4)吸取各管200μL上清液于96孔板中，分别测定各样本在532nm和600nm处的吸光度(酶标仪预热30min以上)；

(5)MDA含量计算：按说明书计算MDA含量。

7)组织免疫组化染色

(1)切片脱蜡与水化

脱蜡前先60℃烤片20min，冷却至室温后，二甲苯脱蜡12min，重复2次；无水乙醇、95％酒精、80％酒精、70％酒精各作用2min；超纯水冲洗2s；

(2)抗原热修复

常温下将切片放入装有0.01M柠檬酸盐缓冲液(PH＝6.0)的烧杯中，置于恒温水浴锅中加热，温度设置为96℃，当水浴温度达96℃时，持续20min，即可停止水浴，自然冷却至室温，取出切片，PBS缓冲液冲洗3min，并重复冲洗3次，吸干切片组织周围液体；

(3)向切片上组织滴加试剂1(内源性过氧化物酶阻断剂)，室温孵育10min，然后用PBS缓冲液冲洗3min，重复冲洗3次，吸干切片组织周围液体；

(4)向切片上组织滴加试剂2(山羊封闭血清)，室温孵育10～15min，倾去，勿冲洗，吸干切片组织周围液体；

(5)一抗孵育：向切片上的组织滴加一抗(一抗稀释比例分别为：FGF6：1:200、BCL2：1:200、Cyclin D1：1：100、pERK：1:500、ERK：1：200、Caspase9：1：200、pAKT：1：100、AKT：1：200、FGFR4：1：200、FGFR1：1：200、PI3K：1：200、ACSL4:1：200、GPX4：1：200)，将切片置于湿盒中37℃孵育2h(中途注意观察防止干片)或4℃孵育过夜，PBS缓冲液代替一抗孵育作为阴性对照；PBS缓冲液冲洗3min，重复冲洗3次，吸干切片组织周围液体；

(6)向切片上的组织滴加试剂3(生物标记山羊抗小鼠/兔IgG)，室温孵育10～15min，然后用PBS缓冲液冲洗3min，重复冲洗3次，吸干切片组织周围液体；

(7)向切片上的组织滴加试剂4(辣根酶标记链霉卵白素工作液)，室温孵育10～15min，然后用PBS缓冲液冲洗3min，重复冲洗3次，吸干切片组织周围液体；

(8)DAB显色：滴加DAB工作液(溶液A与溶液B配置比例20:1，避光混匀，即为DAB工作液，现配现用)，室温孵育5～10min，并在显微镜下观察颜色变化，达到预期颜色变化后，立即使用超纯水冲洗终止反应；

(9)苏木素复染：苏木素染色4min，超纯水冲洗2s，1％盐酸酒精酸化1s，超纯水冲洗2s，1％氨水返蓝1min，超纯水冲洗2s；

(10)切片脱水：70％酒精、80％酒精、95％酒精、无水乙醇依次脱水2s；

(11)二甲苯透明10min，中性树胶封片，正置显微镜下采图并分析。

8)组织亚铁离子(Fe

(1)试剂准备：检测前，将试剂盒中的试剂平衡至室温，按说明书配制标准品保护液及100μmol/L铁标准品，并将标准品稀释至不同浓度；

(2)样本处理：取0.1g新鲜组织，加入缓冲液匀浆，10000g离心10min，取上清液备用；

(3)加样

①标准管：取300μL不同浓度标准品，分别加入对应的1.5mL EP管中测定管：取300μL样本，加入对应的1.5mL EP管中；②向步骤①各管中加入150μL显色液；③混合均匀，37℃孵育10min；④将各管以12000g离心10min；⑤取300μL步骤④中各管上清液加入96孔板中；⑥酶标仪测定593nm处各孔的OD值，按说明书计算Fe

9)统计学方法

利用Image J软件和GraphPad Prism 9.0进行统计学分析并作图，两组间比较采用独立样本t检验，两组以上比较采用单因素方差分析，当P<0.05时差异有统计学意义。

2、实验结果

1)TCGA数据集结果

如图1所示，在各类癌症组织中，FGF6在HNSC组织中有表达；且FGF6在正常组织中的表达高于其在HNSC组织中的表达(图2A)；如图2B所示，FGF6在HNSC各病理分级组织中表达有差异，且FGF6在正常组织与HNSC高分化、中分化、低分化各组组织间的表达差异有统计学意义，而在HNSC的高分化、中分化、低分化及原位癌之间的表达差异无统计学意义。

2)口腔黏膜癌变进程动物疾病模型标准的结果

HE结果显示14d为OPMD阶段标准模型构建期，镜下可见细胞多形性，核浓染，核仁增大，核浆比例增加等；30d为黏膜癌变阶段模型构建期，镜下可见癌细胞和坏死组织，结果如图3所示。

3)HSC-4细胞及HaCaT细胞培养结果

两种细胞培养结果如图4所示，HSC-4细胞为上皮细胞样形态，细胞核呈多形性，HaCaT细胞形如铺路石样，细胞呈扁圆形，无突起，胞浆丰满，核呈圆形或卵圆形。

4)过表达FGF6慢病毒转染

过表达FGF6慢病毒转染HSC-4细胞及HaCaT细胞，转染24h后，镜下见过表达FGF6慢病毒转染的HSC-4细胞及HaCaT细胞有绿色荧光表达，转染72h后，绿色荧光表达最强，结果如图5所示。

5)RT-qPCR验证FGF6过表达效果

FGF6慢病毒转染组(OE group)HSC-4细胞内FGF6的mRNA相对表达量高于空白组(blank group)，且差异有统计学意义(P<0.0001)；而空载体转染组(control group)HSC-4细胞内FGF6的mRNA相对表达量与其在空白组的mRNA相对表达量无统计学差异(图6)。

6)慢病毒干扰口腔黏膜癌变进程疾病模型结果

慢病毒干扰口腔黏膜癌变进程疾病模型大体观如图7所示，对照癌前病变组织组裸鼠建模成功，而FGF6慢病毒转染癌前病变组织组呈现成瘤趋势，倾向于鳞癌的组织病理学表征，镜下可见鳞癌细胞；FGF6慢病毒转染癌组与对照癌组裸鼠的荷瘤组织重量存在差异，差异具有统计学意义(P<0.001)(图8)，而且FGF6慢病毒转染癌组裸鼠荷瘤鳞癌组织分化程度低于对照癌组，镜下可见大面积坏死组织(图9)。

7)组织免疫组化结果

如图10及图11所示，免疫组化分析了FGF6在各组组织中的表达差异，结果显示：FGF6在对照正常组、对照癌前病变组织组、对照癌组中的表达量呈现下调趋势；FGF6在FGF6慢病毒转染正常组、FGF6慢病毒转染癌前病变组织组、FGF6慢病毒转染癌组中的表达量也呈现下调趋势；上述表达差异均有统计学意义(P<0.05)。

8)MDA含量(脂质氧化水平)测定结果

如图12所示，a.与对照正常组相比，FGF6慢病毒转染正常组的MDA含量下调；与对照癌前病变组织组相比，FGF6慢病毒转染癌前病变组织组的MDA含量下调；与对照癌组相比，FGF6慢病毒转染癌组的MDA含量也下调。b.MDA在对照正常组、对照癌前病变组织组、对照癌组中的含量呈现下调趋势；在FGF6慢病毒转染正常组、FGF6慢病毒转染癌前病变组织组、FGF6慢病毒转染癌组中的含量也呈现下调趋势。各组中MDA含量差异均有统计学意义(P<0.05)。

9)亚铁离子含量测定结果

如图13所示，a.与对照正常组相比，FGF6慢病毒转染正常组的Fe

实施例2

1、实验方法

1)样本来源

测试集1：研究对象来源为TCGA数据库，共获取了520例HNSC的原始组织数据和相应临床信息，并用于后续分析。

测试集2：取临床收集3例正常人血清样本、3例OLK血清样本、3例OSCC血清样本进行测序分析，其结果具体信息如表1、表2所示，其中，

表1为鳞癌组vs正常黏膜组

表2为鳞癌组vs口腔白斑组

表1

表2

验证集：来源于现实世界临床样本，共获取健康人样本13例，口腔黏膜癌前病变患者样本7例，口腔黏膜癌患者样本30例，样本为血清和组织样本，用于验证标志物FGF6诊断口腔黏膜癌前病变或诊断口腔黏膜癌的正确性。测试集2和验证集中临床患者基本信息统计结果如表3所示。

表3

所述口腔黏膜癌前病变患者的纳入排除标准如下：

纳入标准：

1)年龄在18岁以且小于80岁。

2)均符合WHO颁布的关于口腔黏膜癌前损害且经病理学检测确诊者。

3)初次确诊。

4)均未使用局部或全身糖皮质激素，也没有严重的心血管系统疾病或任何肝、肾或其他器官功能障碍。

5)纳入患者对本研究知情，并签署知情同意书。

排除标准：

1)除口腔黏膜癌前病变外还伴有其他口腔疾病。

2)牙周炎。

3)唾液腺疾病。

4)全身系统性疾病。

5)近1个月内使用过影响免疫功能药物、抗菌药物、激素类药物。

6)合并恶性肿瘤/合并其他恶性肿瘤(非OSCC)。

7)正在接受化疗和放疗的患者。

8)接受过器官移植的患者。

9)有慢性病毒性疾病阳性病史的患者。

10)孕妇或哺乳期妇女。

11)诊断不明确。

所述口腔黏膜癌患者的纳入排除标准如下：

纳入标准：

1)标本需要经过两名病理科医师独立确认为OSCC。

2)首次行OSCC根治术。

3)既往未接受任何形式治疗。/患者均未接受化疗、放疗等抗肿瘤治疗。

4)年龄在18岁以且小于80岁。

5)不分性别。

6)卡氏功能状态评分＞70分者。

7)临床分期为Ⅱ-Ⅲ期。

8)患者临床资料及随访资料完整。

排除标准：

1)伴有其他部位恶性肿瘤。

2)伴有血液系统疾病、重要脏器严重功能障碍、血栓高度风险及存在活动性出血。

3)伴有免疫缺陷性疾病、传染性疾病、严重感染、严重内科合并症。

4)医患沟通障碍。

5)术前发现远处转移。

6)有药物滥用史、吸毒史、面部手术史。

7)伴有牙周、黏膜疾病。

8)凝血功能障碍。

9)妊娠期、哺乳期。

2)差异表达分析

测试集：使用SPSS软件对测试集中FGF6的测序数据进行差异表达分析，比较在筛选集中健康人与口腔黏膜癌前病变、口腔黏膜癌前病变与口腔黏膜癌、健康人与口腔黏膜癌之间的基因差异表达。

验证集：①RNA提取

使用RNeasy试剂盒(Beyotime,Shanghai,456中国,R0027)从样本中提取总RNA。具体如下：

a.样品准备：取20mg样本，置于1.5ml离心管中，加入6颗左右氧化锆珠，迅速加入600μl冰浴预冷的裂解液，用微型电动匀浆器匀浆。研磨或匀浆后，轻轻吹打匀浆液8-10次，室温放置3-5分钟。然后约14,000g离心2分钟，将上清液移至新的离心管中。

b.加入等体积结合液至裂解液中，轻轻颠倒混匀3-5次。

c.将裂解液和结合液的混合物转移到纯化柱内，放入离心机16,000g离心1分钟，弃去下层液体。

d.在纯化柱上加入600μL洗涤液I，16,000g离心1分钟，弃去下层液体。在纯化柱上加入600μL洗涤液II，16,000g离心1分钟，弃去下层液体。此步骤重复两次。

e.16,000g离心2分钟去除纯化柱上残余的液体。

f.弃去收集管，RNA纯化柱置于RNA洗脱管中，在纯化柱中心加入50μL洗脱液，室温放置3分钟，16,000g离心30秒。得到的洗脱液再次加到纯化柱中心重复洗脱，16,000g离心30秒，得到纯化的RNA.

②逆转录：

a.测定样本RNA的浓度和质量:

对于浓度高于143ng/μL且OD230/260和OD280/260符合标准的样本RNA进行反转录。

b.去除RNA中的DNA:

先在冰上配制gDNA Eraser和5×gDNA Eraser Buffer的混合溶液，并分装到各反应管，然后加入1μg总RNA和无酶水。

以上反应体系在42℃加热两分钟，去除DNA。

c.反转录反应:

先在冰上配制除第一步反应液外的混合溶液，然后加入第一步反应液。

以上反应体系在37℃加热15分钟，在85℃加热30秒。每管加入180μLRNase FreedH

③PCR

a配制反应体系：

TB Green Premix Ex Taq II试剂避光，PCR正反引物提前混合。

先在冰上配制除cDNA外的混合溶液，分装到八联排，然后加入cDNA.

b.八联排离心，上机。

实时定量PCR检测分析使用两步法PCR标准扩增程序，反应条件：以cDNA为模版，进行qRT-PCR，以GAPDH为内参照进行扩增，反应条件：第一步预变性(98℃30秒)和第二步PCR扩增(95℃5秒，60℃30秒，40个循环)。

通过qRT-PCR仪特定软件程序记录并分析检测数据结果，根据公式倍数＝2

3)诊断效能分析

采用R包“pROC”绘制受试者工作曲线(ROC)，分析经筛选得到的在健康人与口腔黏膜癌前病变、口腔黏膜癌前病变与口腔黏膜癌之间呈现显著性差异表达的FGF6标志物分别在测试集和验证集中的AUC值、灵敏度、特异性，以判断其对口腔黏膜癌前病变、口腔黏膜癌的诊断效能。

3、实验结果

1)差异表达分析

测试集1：测试集1中TCGA数据库组织样本中健康人与口腔黏膜癌患者FGF6差异表达的分析结果如图2所示，与健康人相比，FGF6在口腔黏膜癌患者的组织中的表达水平显著下调。

测试集2：测试集2临床收集的血清样本中口腔黏膜癌前病变患者与口腔黏膜癌患者、健康人与口腔黏膜癌患者FGF6差异表达的分析结果如图14所示，与口腔黏膜癌前病变患者相比，FGF6在口腔黏膜癌患者血清中的表达水平显著上调；与健康人相比，FGF6在口腔黏膜癌患者血清中的表达水平显著上调。

验证集：为了验证测试集中的FGF6的功能，临床采集血清样本作为验证集通过WB实验，验证FGF6在口腔黏膜癌变各组血清中的差异表达，结果如图15所示，与健康人相比，FGF6在口腔黏膜癌前病变患者血清中的表达水平显著上调；与口腔黏膜癌前病变患者相比，FGF6在口腔黏膜癌患者血清中的表达水平显著上调；与健康人相比，FGF6在口腔黏膜癌患者血清中的表达水平显著上调。

临床采集组织样本作为验证集通过WB实验，验证FGF6在口腔黏膜癌变各组组织中的差异表达，结果如图16所示，与口腔黏膜癌前病变患者相比，FGF6在口腔黏膜癌患者组织中的表达水平显著下调；与健康人相比，FGF6在口腔黏膜癌患者组织中的表达水平显著下调。

临床采集组织样本作为验证集通过免疫组化实验，验证FGF6在口腔黏膜癌变各组组织中的差异表达，结果如图17所示，与口腔黏膜癌前病变患者相比，FGF6在口腔黏膜癌患者组织中的表达水平显著下调；与健康人相比，FGF6在口腔黏膜癌患者组织中的表达水平显著下调。

2)标志物FGF6诊断健康人与口腔黏膜癌前病变、口腔黏膜癌前病变与口腔黏膜癌、健康人与口腔黏膜癌的ROC曲线分析

以标志物FGF6为变量，使用TCGA数据库组织样本作为测试集，绘制健康人与口腔黏膜癌患者的ROC曲线，其结果如图18所示，TCGA数据库的样本绘制的ROC曲线中，显示AUC值为0.662，表明标志物FGF6可以作为健康人与口腔黏膜癌诊断的标志物。

以标志物FGF6为变量，使用临床收集血清样本作为测试集，绘制健康人与口腔黏膜癌患者、口腔黏膜癌前病变患者与口腔黏膜癌患者的ROC曲线，其结果如图19所示，血清样本绘制的ROC曲线中，健康人与口腔黏膜癌患者显示AUC值为1.000，口腔黏膜癌前病变患者与口腔黏膜癌患者显示AUC值为0.972，表明标志物FGF6可以作为健康人与口腔黏膜癌、口腔黏膜癌前病变与口腔黏膜癌诊断的标志物。

为了验证上述结果的可靠性，以标志物FGF6为变量，使用真实世界收集血清样本，绘制健康人与口腔黏膜癌前病变、口腔黏膜癌前病变与口腔黏膜癌、健康人与口腔黏膜癌的ROC曲线，其结果如图20所示，在真实世界收集血清样本绘制的ROC曲线中，健康人与口腔黏膜癌前病变显示AUC值为0.750(Cl:0.350-1.000)，口腔黏膜癌前病变与口腔黏膜癌显示AUC值为0.750(Cl：0.530-0.970)，健康人与口腔黏膜癌显示AUC值为0.868，表明标志物FGF6可以作为健康人与口腔黏膜癌前病变、口腔黏膜癌前病变与口腔黏膜癌、健康人与口腔黏膜癌诊断的标志物。

以标志物FGF6为变量，使用真实世界收集组织样本，绘制口腔黏膜癌前病变与口腔黏膜癌、健康人与口腔黏膜癌的ROC曲线，其结果如图21所示，在真实世界收集组织样本绘制的ROC曲线中，口腔黏膜癌前病变与口腔黏膜癌的AUC值为0.750，健康人与口腔黏膜癌的AUC值为0.654，表明标志物FGF6可以作为口腔黏膜癌前病变与口腔黏膜癌、健康人与口腔黏膜癌诊断的标志物。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。